新疆褐牛瘦素基因在不同部位中表達水平與肉質指標的關聯性

李紅波，李 娜，閆向民，葉治兵，崔繁榮，張 楊

(1.新疆畜牧科學院畜牧研究所，烏魯木齊 830000；2.新疆肉牛工程技術中心，烏魯木齊 830052；3.新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】肉質性狀是一個復合型的經濟性狀，評定指標有pH值、保水性、結締組織含量與分布、肌纖維直徑以及牛大理石花紋豐富度所決定的。pH值是反映肉的生化變化的重要指標，其對肉的顏色、嫩度、保水性都有顯著影響[1]；蒸煮損失越小，肉的出品率越高[2]，剪切力越小，牛肉越嫩[3]；其中大理石花紋等級是最關鍵的指標，不僅有利于牛肉嫩度還直接影響牛肉的品質等級[4-6]；瘦素蛋白(leptin)是由ob (肥胖基因)編碼的基因參與調節機體基礎代謝和胴體脂肪沉積等并起著重要作用。【前人研究進展】leptin可顯著減少烏金豬和長白豬肌內和皮下脂肪細胞中的甘油三酯和游離脂肪酸含量[7]。皮下脂肪中leptin表達量與母兔肌內脂肪含量、熟肉率和pH值呈顯著的相關性[8]，血清瘦素蛋白濃度與牛胴體的大理石花紋等級、背膘厚度[9]，綿羊的脂肪沉積等呈極顯著相關[10]。【本研究切入點】leptin的表達水平與肉質關系密切，能作為研究肉質一個候選基因。但leptinmRNA表達量在新疆褐牛肉質方面鮮見報道。亟需研究新疆褐牛瘦素基因在不同部位中表達水平與肉質指標的關聯性。【擬解決的關鍵問題】選取新疆褐牛為研究對象，采用熒光定量聚合酶鏈式反應技術，分析其與BPI、大理石花紋、剪切力、蒸煮損失、肌肉脂肪含量等肉質性狀相關性，為新疆肉牛肉質育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 褐牛

選擇新疆褐牛，肉樣取自伊犁西天山農牧發展有限責任公司舍飼狀態，活重560 kg/頭，年齡2.5～3歲，根據《新疆褐牛品種標準》要求，隨機選取外貌特征顯著、年齡、營養條件均一致，健康的新疆褐牛成年公牛20頭，禁食12 h后屠宰。采集脂肪樣品(肌間脂肪、腎周脂肪、皮下脂肪、心周脂肪)300 g/樣品，立即投入液氮中保存，以備提取總RNA。經屠宰后，胴體在0～4℃排酸72 h，取左側胴體12～13肋背最長肌組織，用于肉質性狀檢測。

1.1.2 主要儀器試劑

儀器：BIOFUGE PRIMOR低溫離心機，超ZHJH C1112B凈工作臺，Light Cycler 2.0熒光定量PCR儀，NanoDrop?ND-2000 Spectorphotometer可見/紫外分光光度計，CFX96TM實時定量PCR儀。

試劑：Oligo(dT)15；Ribonuclease Inhibitor，M-MLV5×Reaction Buffer，SYBR?Prime Script TMⅡ熒光定量試劑盒。

1.2 方 法

1.2.1 指標測定

1.2.1.1 體重、體高

按常規方法進行體重稱量，體尺測量。根據體重和體高數據計算肉用指數(Beef purpose index) BPI值即體重與體高比值。

1.2.2 等級評定

1.2.2.1 大理石花紋

依據第12～13處背最長肌橫切面內，脂肪沉積量的多少進行等級評定，大理石花紋等級從4至1依次為幾乎沒有、少量、豐富、極豐富，每2級間沒有0.5級。

1.2.2.2 胴體脂肪覆蓋

于屠宰后懸掛測定牛體皮下脂肪覆蓋度面積占整個胴體總面積的比率。脂肪覆蓋等級從4至1依次為特級、優一級、優二級和普通級。

1.2.2.3 pH

用NWF-IQ160G便攜式pH測定儀進行測定。將探頭插入到肉樣中，使pH計電極與肌肉中的組織液充分接觸，待pH計湊數穩定后記錄，每個肉樣重復測定4～6次，取平均值為最終pH值測定結果。

1.2.2.4 蒸煮損失(cooling loss, CL)

取排酸后的肉樣，將附著標間的脛腱、脂肪后稱重，切成約2.5 cm左右厚，用塑料袋包扎好肉樣，保持袋口朝上，放入80℃水浴鍋中，加蓋后持續加熱，直至肌肉中心溫度達到70℃為止，取出肉樣使肌肉冷至室溫，吸干表面水分，稱蒸煮后重，計算蒸煮損失。

1.2.2.5 剪切力

蒸煮損失與嫩度測定同步進行，將蒸煮后吸干表面水分并稱重后的肉樣，用直徑為1.27 cm的空心取樣器沿肌纖維方向鉆取肉柱(每個樣品至少取3根肉柱，避開肉筋)，然后用C-LM型嫩度計測定每個肉柱的剪切力值，取其平均值作為該樣品的剪切力值。

1.2.3 總 RNA 的提取及其純度

稱取150 mg的脂肪組織，研磨至于1 mL QIAzol裂解液中，并根據RNeasy Lipid Tissue Mini試劑盒實驗步驟進行RNA提取。獲得的RNA利用紫外可見分光光度計檢測純度及濃度，RNA的完整性用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 熒光定量聚合酶鏈式反應

PCR體系：水7.4 μL，2×TaqPCR MasterMix 10 μL，上有引物 0.8 μL，下游引物0.8 μL，模板1 μL。PCR反應程序：95℃ 3 min；35個循環(95℃ 30s，57℃ 1 min，72℃ 1 min)；72℃ 5 min，反應結束后4℃保存。

在NCBI網站上搜索目的基因序列，采用Oligo 6.0在線引物設計軟件設計目的基因引物。表1

1.3 數據處理

以gapdh基因作為內參基因，采用2-△△CT法測定leptin基因的相對表達量，利用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，用鄧肯法進行多重比較，結果以平均值±標準差表示，并利用皮爾森相關系數分析相關系數和顯著性。

表1 引物序列信息Table 1 The primer sequence information

2 結果與分析

2.1 不同部位脂肪組織中leptin 基因表達水平

研究表明，新疆褐牛不同部位leptin基因相對表達量由高到低依次為肌間脂肪、皮下脂肪、腎周脂肪和心周脂肪。皮下和腎周脂肪中leptin的表達水平極顯著低于肌間脂肪(P<0.01)，而心周脂肪中leptin的表達水平與肌間脂肪無差異(P>0.05)；在不同部位脂肪組織中leptin基因表達水平，肌間脂肪組織顯著高于其他部位脂肪組織。圖1

2.2 新疆褐牛背最長肌組織肉質特性

研究表明，新疆褐牛活重平均為620.15 kg，屠宰率59.33%；BPI為4.45，經過適當的育肥條件，新疆褐牛12～13肋的橫斷面的面積為95.23 cm2，背最長肌的剪切力3.3 kg，肉質嫩，具有較高的商品價值，背最長肌肌內脂肪含量所占比例5.17%。表2

注：**表示在P<0.01水平具有高度統計學意義

2.3 不同部位leptin基因表達水平與肉質性狀相關性

研究表明，新疆褐牛皮下脂肪組織中leptin表達水平與其外脊剪切力顯著正相關(P<0.05)，相關系數為0.555；與蒸煮損失顯著正相關(P<0.05)，相關系數分別0.479；與肌內脂肪含量顯著正相關(P<0.05)，相關系數為0.474，而腎周、肌間、心周脂肪組織中leptin表達水平與其肉質性狀無顯著相關性(P>0.05)。表3

表3 不同部位leptin基因表達水平與肉質性狀相關性Table 3 Correlation between leptin gene expression levels in different parts and meat quality traits

3 討 論

新疆褐牛的4個部位脂肪組織中leptin基因均有表達，證實了瘦素蛋白在新疆褐牛脂肪組織中內普遍存在。新疆褐牛不同部位leptin基因相對表達量由高到低依次為肌間脂肪、皮下脂肪、腎周脂肪和心周脂肪。肌間脂肪中leptin的表達水平極顯著高于皮下和腎周脂肪，且與心周脂肪的表達無顯著差異性。Tomoya等[11]研究表明，成年日本和牛leptinmRNA表達水平由高到低依次為腎、肌間、皮下脂肪，與研究結果不完全一致。leptin基因出現空間上的表達差異主要是leptin表達依賴于不同部位脂肪細胞形態。新疆褐牛各部位脂肪單個細胞面積大小順序：腎周、皮下、心周和肌間；日本和牛各部位脂肪大小順序也不同：腸系膜、腎周、肌間、皮下脂肪；同時也有研究指出，脂肪組織中毛細血管網也廣泛的存在，脂肪生成依賴血管的生成，首先脂肪細胞的增殖主要發生在毛細血管簇中，其次抑制血管生成顯著降低脂肪組織的重量，血管生長因子能夠刺激細胞的分化，脂肪細胞也會分泌血管生長因子，脂肪組織生成基于血管形態和毛細血管的密度[12]。毛細血管網絡為脂肪細胞提供營養，并允許脂肪細胞積極分泌脂肪細胞因子，如瘦素[13,14]。

瘦素是動物脂肪細胞分泌的一種蛋白質激素，可以通過作用于下丘腦調節攝食，同時還可以通過促進三酰甘油分解抑制脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)的表達，也可以通過增加能量消耗來介導乙酰輔酶A羧化酶基因(Acetyl CoA carboxylase)的表達從而抑制脂肪的合成[15]。新疆褐牛肌內脂肪含量和皮下脂肪組織中leptin基因的表達水平呈顯著正相關(r=0.474，P<0.05)，皮下脂肪組織中的leptin基因對肌內脂肪有顯著影響。皮下脂肪也能反映脂肪沉積的程度，肌內脂肪也是沉積于肌束膜中的，兩者具有顯著相關性，也是評價牛肉品質的一個重要因素。肌內脂肪能夠促進肉的嫩度，同時也可影響牛肉的多汁性[16，17]。利木贊牛肉肌內脂肪含量較低約為1.4%，且具有較高的剪切力[18]。母兔的肌內脂肪含量和皮下脂肪中leptin基因的表達量呈極顯著正相關[8]，這與研究結果一致。研究南方黃牛肉質嫩度調控的分子機制中發現leptin基因表達水平與肌肉的剪切力值顯著相關性，與研究結果一致[19]。研究分析了皮下脂肪中leptin基因的表達水平與肌肉嫩度(剪切力)、蒸煮損失的關系，發現皮下脂肪中leptin基因的表達可能在新疆褐牛肉質(嫩度、蒸煮損失)形成過程中起著重要的調節作用。今后需要在細胞水平上利用RNA干擾、過表達以及TALEN敲除技術來進一步驗證該基因的功能，尋找新疆褐牛肉質調控相關的遺傳標記。

4 結 論

新疆褐牛不同部位脂肪中leptin基因均有表達，其相對表達量由高到低依次為肌間脂肪、皮下脂肪、腎周脂肪和心周脂肪。在不同部位脂肪組織中leptin基因表達水平，肌間脂肪組織顯著高于其他部位脂肪組織。皮下脂肪組織中leptin表達水平與其外脊剪切力(r=0.555,P<0.05)、蒸煮損失(r=0.479,P<0.05)顯著正相關，與肌內脂肪含量顯著正相關(r=0.474,P<0.05)；而腎周、肌間、心周脂肪組織中leptin表達水平與其肉質性狀無顯著相關性(P>0.05)，提示皮下脂肪中leptin基因可能參與新疆褐牛肉質形成過程，可作為研究新疆褐牛肉質的一個候選基因。