響應面法優化辣椒籽油堿異構化制備共軛亞油酸工藝及其氧化穩定性

馬 燕，許銘強，李喜弟，孟新濤，鄒淑萍，張 婷，張 謙

(1.新疆農科院農產品貯藏加工研究所/新疆主要農副產品精深加工工程技術研究中心，烏魯木齊 830091；2.新疆西爾單食品有限公司，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】共軛亞油酸(conjugatedlinoleicacids, CLA)具有提高免疫力等一系列獨特的生理功能[1，2]，但天然CLA人體自身不能合成[3]，多以高亞油酸植物油為原料形式轉化生成。辣椒(CapsicumannumL.)是新疆“紅色產業”的重要支柱作物之一[4]，其在加工過程中會產生大量的副產物，辣椒籽作為辣椒主要加工副產物，籽油中富含不飽和脂肪酸，其中亞油酸含量72.2%～74.26%[5]，可作為一種制備共軛亞油酸的經濟、廉價原料新資源。若能利用高效、可行且易于生產的加工技術開發辣椒籽油CLA新資源功效食品，不僅可為規模化生產奠定基礎，也可大幅度提高辣椒籽的全效利用率和附加值，對延長辣椒加工產業鏈，緩解資源，推進果蔬副產物綜合利用和環境友好型的辣椒加工產業發展具有重要現實意義。【前人研究進展】目前，我國對CLA的研究起步較晚，現主要研究從山核桃油[6]、紅花籽油[7]、茶油[8]、葵花籽油[9]等亞油酸含量較高的油脂中提取共軛亞油酸，但對辣椒籽油共軛亞油酸方面的研究尚未見相關報道。CLA的制備化方法主要有生物法[10]和化學法[11]。其中堿異構化化學法得到的產物無毒、易處理、更適合工業化生產[12]。【本研究切入點】采用堿異構化制備共軛亞油酸的主要影響因素(溫度、壓力、堿性催化劑和醇類溶劑種類)及加工工藝條件不同，會直接影響CLA的得率[13]，需尋找能夠大量廉價制取CLA的原料資源和可靠的制備方法[14]。需研究充分利用辣椒副產物—辣椒籽作為制備共軛亞油酸的新資源。【擬解決的關鍵問題】以冷榨后的辣椒籽油為試材，分析堿異構法制備辣椒籽油共軛亞油酸的各因素對轉化效果的影響，研究堿異構法的主要影響因素；探討各試驗因素及交互作用對轉化率的影響；通過總體優化，為獲得辣椒籽油CLA最優工藝條件，為新資源產品研發及辣椒副產物綜合利用提供理論和技術依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

辣椒籽，新疆西爾單食品有限公司提供；辣椒籽油(亞油酸含量為72.82%)，自制；CLA標準品，購于Sigma-Aldrich上海貿易有限公司。KOH、聚乙二醇、無水硫酸鈉、碘化鉀、濃鹽酸、正己烷、三氯乙酸等試劑為分析純，均購于北京化學試劑有限公司。

TP-A1000型電子天平，福州華志科學儀器有限公司； EMS-18A磁力攪拌器，天津市歐諾儀器儀表有限公司；共軛亞油酸制備裝置(自制)；UV-1800紫外可見分光光度計，日本島津公司；101型電熱鼓風干燥箱，北京市永光明醫療儀器廠；SENCO R-501旋轉蒸發儀，上海申順生物有限公司。

圖1 自制共軛亞油酸反應裝置Fig.1 Reaction diagram of conjugated linoleic acid by self-made device

1.2 方 法

1.2.1 CLA轉化率的測定[8]

CLA標準曲線繪制: 將 CLA標準品100 mg用石油醚定容至 10 mL，配成標準溶液。從標準溶液中分別吸取20、40、60、80、100 μL CLA 定 容 至 100 mL，以正己烷為參比，采用紫外可見分光光度計測定其在 233 nm 處的吸光度。以 CLA 的質量濃度為橫坐標， 吸光度為縱坐標，繪制 CLA 標準曲線，得到的回歸 方程為y= 0.009 8x(R2= 0.999 6) 。

共軛亞油酸轉化率的測定: 取一定量的 CLA樣品，用正己烷稀釋，振蕩。以正己烷為參比，在 233 nm 處測其吸光度，利用標準曲線計算樣品的質量濃度，并按下式計算 CLA 轉化率：

1.2.2 堿異構化制備辣椒籽油 CLA實驗設計

參考陳麗敏[15]和潘群文[16]等方法。稱取一定質量的催化劑KOH與溶劑聚乙二醇加入辣椒籽油中，在氮氣保護下油浴迅速加熱至一定溫度，充分反應一段時間后終止反應，冷卻至 60℃，加入一定溫水攪拌30 min，并用 0.5 mol/L的濃鹽酸調節 pH至2; 待靜置分層后，將上清液轉移至分液漏斗中，用蒸餾水洗至中性，再用無水硫酸鈉脫除多余水分，得辣椒籽油CLA樣品，保存備用。

1.2.3 響應面法優化試驗

在前期單因素試驗得出較優的工藝條件(反應溫度170℃、反應時間4 h、堿油比0.3、溶油比1.5)的基礎上，以共軛亞油酸轉化率為響應值，選擇辣椒籽油反應溫度(X1)、反應時間(X2)、堿油比(X3)和溶油比(X4)這4個因素作為對轉化影響較大的試驗因子。

1.2.4 辣椒籽油CLA氧化能力穩定性測定

將辣椒籽油和辣椒籽油CLA置于60℃烘箱中進行加速氧化，每隔2 d測定其過氧化值(POV)和TBA反應物。

1.2.4.1 過氧化值測定[17]

參照GB 5009.227-2016的測定方法進行測定。

1.2.4.2 TBA 反應物測定[18]

稱取2 g 樣品分別加入3 mL 蒸餾水、4 mL 20%三氯乙酸和2 mL 0.67%TBA混合均勻,沸水浴加熱15 min后冷卻，在5 000 r/ min條件下離心10 min，取下層清液于532 nm測定其吸光度。

1.3 數據處理

運用Design-Expert 11.00 進行響應面設計，采用Origin9.2軟件進行圖表繪制，利用Excel、SPSS 22.0進行數據分析和處理。

2 結果與分析

2.1 響應面優化

2.1.1 數學模型的建立

在前期單因素試驗中，選擇反應溫度(150、160、170、180、190℃)、反應時間(2、3、4、5、6 h)、堿油比(0.9、0.7、0.5、0.3、0.1)和溶油比(0.5、1、1.5、2、2.5)進行4因素3水平試驗，通過單因素試驗確定辣椒籽共軛亞油酸制備較佳工藝參數為反應溫度170℃、反應時間4 h、堿油比0.3、溶油比1.5，并在單因素的基礎上以反應溫度(X1)、反應時間(X2)、堿油溶比(X3)和溶油比(X4)為響應因子，進行辣椒籽油共軛油酸制備工藝優化研究，分析各因子對共軛轉化率(Y1)的影響。表1，表2

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface

表2 優化試驗設計與結果Table 2 Optimize experimental designs and results

續表2 優化試驗設計與結果Table 2 Optimize experimental designs and results

表3 回歸模型系數及顯著性檢驗結果Table 3 Regression coefficients and significant test for quadratic polynomial model equation

共軛轉化率與反應溫度、反應時間、堿油比和溶油比相互關系的二次多項數學回歸方程：

Y=86.03+1.08X1+4.82X2+2.39X3+3.15X4-4.91X1X2-2.53X1X3+0.73X1X4-4.98X2X3-5.72X2X4-7.01X3X4-0.07X12-4.74X22-2.82X32-6.88X42

模型中P=0.002 0<0.01，回歸模型極顯著，P=0.120 4>0.1，失擬項不顯著，該模型擬合程度良好，試驗誤差小；模型中的部分一次項、二次項和平方項影響顯著。相關系數R2為0.838 7，模型方程擬合程度較好。設計實驗中的CV為0.58%，實驗精確度越高，回歸方程符合模型建立。根據F值大小確定各因素對辣椒籽油CLA轉化率的影響依次為：反應時間>溶油比>堿油比﹥反應溫度。表3

2.1.2 響應面圖分析與優化

研究表明，響應曲面圖較為平緩，反應溫度和堿油比、溶油比之間對共軛轉化率交互作用不顯著。響應曲面圖較為陡峭，反應時間和堿油比、溶油比，堿油比和溶油比之間對共軛轉化率交互作用顯著。整個響應曲面呈山丘形，共軛轉化率隨著各因子量的上升而增大，達到最高值后逐漸緩慢，每個影響因子對共軛轉化率都有一個最佳值。最優點：X1=-0.11，X2=-0.35，X3=-0.48，X4=0.31，并得到最佳工藝組合為：反應溫度為169℃、反應萃取時間為4.4 h、堿油比為0.2、溶油比為1.7，模型預測共軛轉化率為84.72%。圖2

圖2 因子交互與共軛轉化率的響應面圖Fig.2 Response surface diagram of factor interaction and conjugate conversion

2.1.3 驗證實驗

研究表明，共軛轉化率分別為84.56%、84.13%、85.12%，平均值為84.60%(誤差0.12%)。所得最大預測值接近驗證值，建立的模型與實際情況比較吻合。

2.2 CLA的氧化穩定性

研究表明，相同天數的辣椒籽油CLA 過氧化值明顯高于辣椒籽油過氧化值。辣椒籽油過氧化值(0.78～2.71 mmol/kg)和辣椒籽油CLA過氧化值(0.8～2.13 mmol/kg)在前6 d 的變化較為穩定，隨后上升較快，到第14 d辣椒籽油的過氧化值達10.95 mmol/kg，約為辣椒籽油CLA 的1.75倍。吸光度值越高，TBA反應物的量越大。吸光度值隨著天數的增加呈上升趨勢，辣椒籽油吸光度值(0.125～0.3)和辣椒籽油CLA吸光度值(0.12～0.2)在前8 d 變化較為穩定，隨后上升較快，到第14 d辣椒籽油的吸光度值達0.8，約為辣椒籽油CLA 的1.3倍。辣椒籽油CLA 具有較好的氧化穩定性。圖3，圖4

3 討 論

在辣椒籽油CLA制備過程中，單一因素(反應時間、溶油比、堿溶比和反應溫度)對CLA轉化率雖有影響，但起主導作用的是不同因子間的交互效應，隨著交互效應越顯著，CLA轉化率越高。堿油比與溶油比交互作用對CLA轉化率影響極顯著，反應時間與堿油比、反應時間和反應溫度之間交互作用對CLA轉化率顯著，因子間的交互作用組合均存在單一最優水平，可用于堿異構化法制備辣椒籽油CLA工藝優化，同時可根據顯著性分析結果，去除模型中不顯著項[19]，進一步得到以下簡化模型：Y=86.03+4.82X2+3.15X4-4.91X1X2-4.98X2X3-5.72X2X4-7.01X3X4-4.74X22-6.88X42，獲得轉化率較高的辣椒籽油CLA。在操作過程中，雖然較高的反應溫度有利于提高CLA轉化率，但在反應過程中亞油酸易發生分解、熱聚合及環化等副反應，不利于共軛化和活性成分[20]，在操作過程中應嚴格控制反應溫度。

圖3 辣椒籽油和辣椒籽油CLA中過氧化值比較Fig.3 Comparison of peroxide value between pepper seed oil and pepper seed oil CLA

圖4 辣椒籽油和辣椒籽油CLA中TBA反應物比較Fig.4 Comparison of TBA reactant between pepper seed oil and pepper seed oil CLA

過氧化值和TBA反應物分別反映了油脂氧化初產物和氧化產物生成量，是衡量油脂氧化穩定性的主要指標[21]，測定過氧化值和TBA反應物能夠更好地反映過氧化值穩定性。通過進一步對辣椒籽油CLA的氧化穩定性分析發現，辣椒籽油CLA較辣椒籽油具有較好的氧化穩定性，這可能與共軛不飽和脂肪酸和非共軛不飽和脂肪酸的氧化機理不同有關[22]。該結果與張紅玉等[8，23]研究結果一致。辣椒籽油和辣椒籽油CLA的TBA反應物在前4 d 的吸光度值變化差異不大，這可能是由于CLA在氧化起始階段的過氧化物積累較少, 并能較快地轉變成氧化第二階段產物導致[23]。后期可進一步探究其抗氧化機理，從而尋求提高其抗氧化水平的方法。

4 結 論

4.1采用響應面優化法建立了堿異構化制備辣椒籽油CLA的二次回歸方程，并通過顯著性分析得到影響辣椒籽共軛轉化率的因素依次為：反應時間>溶油比>堿油比﹥反應溫度；辣椒籽油CLA的最佳轉化條件為：反應溫度為169℃、反應萃取時間為4.4 h、堿油比為0.2、溶油比為1.7，此時共軛轉化率為84.60%，辣椒籽油CLA較辣椒籽油具有更好的氧化穩定性。

4.2辣椒籽油CLA可作為一種良好的運動食品和營養輔助保健食品原料或功能性輔料。