煙粉虱持續(xù)取食對(duì)棉花葉片防御酶活性、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物含量的影響

賈尊尊, 付開赟, 丁新華, 吐爾遜·阿合買提,姜衛(wèi)華，王小武, 郭文超

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 843005；2. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091；3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，南京 844200；4. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】 外來入侵性昆蟲由于其強(qiáng)繁殖力及適應(yīng)性，使得入侵地的生態(tài)平衡遭到破壞[1]，煙粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)是入侵性極強(qiáng)的農(nóng)業(yè)害蟲[2]，對(duì)于寄主植物危害在于刺吸葉片使得葉片生理性受損，分泌蜜露造成葉片煤污病，還會(huì)攜帶植物病毒病[3]。煙粉虱是使用口器刺入植物葉片組織吸取營(yíng)養(yǎng)，造成植株葉片退綠或萎蔫，誘導(dǎo)植物的防御機(jī)制產(chǎn)生[4]，煙粉虱所攜帶的棉花曲葉病毒(Cotton leaf curl virus, CLCuV) 對(duì)棉花生產(chǎn)造成威脅[5]。研究不同蟲口密度煙粉虱在不同時(shí)間脅迫棉花苗期植株后，觀察其體內(nèi)丙二醛、脯氨酸、過氧化氫酶、可溶性蛋白含量、可溶性糖和葉綠素含量的變化，分析棉花對(duì)煙粉虱造成的蟲害脅迫所產(chǎn)生的防御機(jī)制產(chǎn)生的生理生化影響，進(jìn)一步研究煙粉虱與棉花的互作關(guān)系，對(duì)控害和預(yù)防煙粉虱的發(fā)生有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】 葉綠素是植物光合作用關(guān)鍵物質(zhì)[6]，其含量可受多種逆境的脅迫而下降，與植物的光合能力、發(fā)育階段相關(guān)性顯著，也是植物抗逆性生理指標(biāo)之一[7]。植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在昆蟲取食后其含量發(fā)生變化，其變幅決定了植物對(duì)昆蟲的防御能力[8]，可溶性糖能夠刺激昆蟲取食，也是其重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量來源[9]；可溶性蛋白含量的高低影響昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育與存活率[10]，植物氨基酸含量的高低與植物抗蟲性密切相關(guān)[11]，脯氨酸(Pro)是一種多功能的氨基酸，主要維持植物遭受逆境脅迫下細(xì)胞的正常功能，其作用可協(xié)助調(diào)控細(xì)胞氧化還原勢(shì)和穩(wěn)定細(xì)胞滲透壓等[12-14]。丙二醛(MDA)是植物膜脂過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物[15]，過氧化氫酶(CAT)是抗氧化活性氧代謝相關(guān)的關(guān)鍵性酶，其作用可以緩解MDA的積累，使得植物形成對(duì)脅迫的防御機(jī)制，提高植物的抗性[16-17]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】 昆蟲與寄主植物之間生態(tài)關(guān)系隨著時(shí)間不斷進(jìn)化演變逐漸形成某種化學(xué)聯(lián)系[18]，植物對(duì)昆蟲會(huì)產(chǎn)生一種防御機(jī)制來抵擋昆蟲的攻擊、產(chǎn)生次生代謝物質(zhì)以吸引天敵或者恢復(fù)受害部[19]，這種防御機(jī)制具體表現(xiàn)為植物自身體內(nèi)生理生化指標(biāo)變化，如葉綠素的變化改變光合作用，保護(hù)酶增多、滲透物質(zhì)增加，次生代謝物質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生變化等[20-21]。亟需研究不同密度與不同為害時(shí)間下，棉花植株對(duì)煙粉虱持續(xù)取食脅迫所產(chǎn)生防御應(yīng)答響應(yīng)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】 研究煙粉虱在不同蟲口密度與為害時(shí)間下，棉花苗期葉片的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝物質(zhì)可溶性蛋白、可溶性糖、葉綠素、丙二醛、脯氨酸及過氧化氫酶含量動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，分析煙粉虱與棉花植株的互作關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 煙粉虱

MED煙粉虱采自新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所內(nèi)，寄主植物為南瓜，分別使用COI測(cè)序以及CAPs方法[22]鑒定為Mediterraean (MED) 隱種，后在NJ-135棉花植株上罩籠擴(kuò)繁。使用棉花NJ-135，催芽后移入盆內(nèi)在養(yǎng)蟲網(wǎng)內(nèi)移栽，長(zhǎng)至8片葉后接蟲。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取棉花苗期植株，罩籠140目尼龍網(wǎng)，單株分別接蟲0頭、50頭、500頭煙粉虱，重復(fù)5次，成蟲分別取食24、48和72 h后采樣，后用于相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)

1.2.2.1 植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)

采用蒽酮比色法植物可溶性糖測(cè)定[23]，糖與濃硫酸發(fā)生經(jīng)脫水反應(yīng)會(huì)生成糖醛或者羥甲基糖醛，所生成的糖醛或羥甲基糖醛均可與蒽酮顯色反應(yīng)，可生成藍(lán)綠色的衍生物，在630 nm可見光下測(cè)定其吸光度值。

植物可溶性蛋白測(cè)定使用BCA法[24]，在堿性的條件下，蛋白可將二價(jià)銅離子還原為一價(jià)銅離子，同時(shí)一價(jià)銅離子可與BCA試劑發(fā)生顯色反應(yīng)形成紫色絡(luò)合物，在562 nm處有最大的吸收峰，吸光度與濃度成正比，測(cè)吸光度，計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。

測(cè)定植物體內(nèi)所含有的氨基酸中的脯氨酸(PRO)使用酸性茚三酮與其發(fā)生的相關(guān)顯色反應(yīng)所生成紅色產(chǎn)物，測(cè)定515 nm可見光的吸光度值[25]。

1.2.2.2 植物葉綠素

葉綠素a和葉綠素b在663 nm分別具有最大吸收峰，根據(jù)葉綠素提取液對(duì)可見光譜的吸收，利用分光光度計(jì)在最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度，從而計(jì)算總?cè)~綠素含量[26]。

1.2.2.3 丙二醛

使用TBA法，MDA可以與硫代巴比妥酸(TBA)縮合發(fā)生顯色反應(yīng)，最終反應(yīng)生成紅色產(chǎn)物，在532 nm處會(huì)有最大的吸收峰，隨后使用測(cè)得吸光度計(jì)算丙二醛濃度[27]。

1.2.2.4 過氧化氫酶

使用鉬酸銨法，H2O2與鉬氨酸的反應(yīng)[28]，產(chǎn)生的絡(luò)合物為淡黃色，加入鉬氨酸可使過氧化氫酶(Catalase)分解H2O2的反應(yīng)迅速終止，在405 nm處可有最大峰，計(jì)算過氧化氫酶活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸、葉綠素、丙二醛及過氧化氫酶的含量使用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件的鄧肯 (Tukey) 進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)間與密度的蟲害脅迫下棉花營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的變化

研究表明，24、48和72 h的處理組中，對(duì)照間差異不顯著(16.16, 16.77和18.10 mg/g)。在50頭/株的處理下，隨著煙粉虱持續(xù)取食時(shí)間延長(zhǎng)，可溶性糖含量降低。在處理24、48和72 h后，可溶性糖含量降低(16.77，15.83和15.64 mg/g)，但差異性不顯著；在500頭/株密度下，可溶性糖含量降低且程度增大，隨著持續(xù)取食時(shí)間的延長(zhǎng)在24、48和72 h其含量依次為18.10、15.75和7.84 mg/g，處理72 h與處理24和48 h含量存在顯著性差異。在相同的煙粉虱持續(xù)取食時(shí)間下，取食24 h后隨著蟲口密度的增加可溶性糖含量上升，500頭/株的含量最高，差異性不顯著；取食48和72 h，均表現(xiàn)為隨著蟲口密度的增加可溶性糖含量下降；而取食72 h后，這種下降程度表現(xiàn)更加明顯，密度為50頭/株的處理組與對(duì)照組相比下降14 %，處理密度為500頭/株，下降了57 %，僅密度為500頭/株處理組與對(duì)照相比可溶性糖含量差異性顯著。圖1

煙粉虱持續(xù)取食脅迫下，棉花葉片的總蛋白含量均上升。對(duì)于50頭/株處理組，隨著為害時(shí)間的延長(zhǎng)總蛋白的含量逐漸升高，24、48和72 h總蛋白含量分別為3.23、4.87和5.55 μg/mL，且差異性顯著；500頭/株處理組，隨著為害時(shí)間的延長(zhǎng)總蛋白含量同樣也為逐漸升高的趨勢(shì)，24、48和72 h總蛋白含量分別為3.84、5.38和5.92 μg/mL；在相同處理時(shí)間，可溶性蛋白的含量隨著蟲口密度的升高而升高。圖2

煙粉虱對(duì)棉花植株為害后，棉花葉片脯氨酸含量隨為害時(shí)間延長(zhǎng)其含量逐漸升高，500頭/株處理組，為害72 h下與為害24和48 h具有顯著性差異，且處理48 h與處理24 h相比脯氨酸含量增加11%，而處理72 h與處理24 h相比脯氨酸含量增加36%。隨著為害時(shí)間的延長(zhǎng)，50頭/株的處理組脯氨酸含量升高，差異不顯著，對(duì)于不同處理時(shí)間下，處理組與對(duì)照組相比，為害密度越大其脯氨酸含量升高，且隨著為害延長(zhǎng)，這種現(xiàn)象更加明顯，在72 h處理時(shí)間下，隨蟲口密度增加，脯氨酸含量升高(0.85, 0.92和1.21 μg/g)，50頭/株脯氨酸含量與對(duì)照組差異性不顯著，而500頭/株處理組與50頭/株和對(duì)照均表現(xiàn)為脯氨酸含量顯著升高。圖3

圖1 不同煙粉虱密度與持續(xù)取食時(shí)間下棉花葉片可溶性糖含量變化Fig.1 Soluble sugars content of cotton leaves treated under different whitefly densities or stress time

圖2 不同煙粉虱密度與持續(xù)取食時(shí)間下棉花葉片總蛋白含量變化Fig.2 Total protein content of cotton leaves treated under different whitefly densities or stress time

圖3 不同煙粉虱密度與持續(xù)取食時(shí)間下棉花葉片脯氨酸含量變化Fig.3 Proline content of cotton leaves treated under different whitefly densities or stress time

2.2 不同時(shí)間與蟲口密度的蟲害脅迫下棉花丙二醛含量變化

研究表明，隨著為害時(shí)間的延長(zhǎng)，蟲口密度分別為50與500頭/株處理組棉花葉片丙二醛含量均先降低后升高。在相同為害時(shí)間，蟲口密度越高其丙二醛含量越高，且處理組與對(duì)照組相比其含量變化隨著為害時(shí)間延長(zhǎng)，丙二醛含量變幅越大，在72 h時(shí)，500頭/株的處理組與對(duì)照相比增加55%，而50頭/株的處理組與對(duì)照組相比增加34%，而為害時(shí)間在24和48 h時(shí)，500頭/株與對(duì)照相比分別增加33%和19%；50頭/株與對(duì)照組相比分別增加13%和0%。圖4

圖4 不同煙粉虱密度與持續(xù)取食時(shí)間下棉花葉片丙二醛含量變化Fig.4 Malondialdehyde content of cotton leaves treated under different whitefly densities or stress time

2.3 不同時(shí)間與蟲口密度的蟲害脅迫下棉花過氧化氫酶(CAT)含量變化

研究表明，相同處理時(shí)間下，過氧化氫酶活力變化均隨為害密度增大而增加(6.42, 9.81和12.42 U/mg prot；7.40,10.98和15.29 U/mg prot；10.74,18.45和19.16 U/mg prot)；相同處理密度下，過氧化氫酶活力變化隨煙粉虱持續(xù)取食時(shí)間延長(zhǎng)而增大。在煙粉虱持續(xù)取食24和48h， 500頭/株與對(duì)照間均差異性顯著。在煙粉虱持續(xù)取食72 h后，50頭/株和500頭/株處理組與對(duì)照組相比均差異性顯著。圖5

2.4 不同時(shí)間與蟲口密度的蟲害脅迫下棉花植物葉綠素含量變化

研究表明，24和48 h處理，處理組與對(duì)照組隨著蟲口密度的增加葉綠素含量顯著下降，而在為害時(shí)間延長(zhǎng)至72 h，50頭/株處理組與500頭/株對(duì)于50頭處理組間葉綠素含量差異性不顯著，但與對(duì)照間均表現(xiàn)差異性顯著增高的情況。500頭/株隨著為害時(shí)間的延長(zhǎng)，葉綠素含量升高，48 h比24 h升高72%，72 h比48 h升高129%，對(duì)于50頭/株處理組，葉綠素含量先下降30%后上升113%。不同處理密度，隨著為害時(shí)間的延長(zhǎng)，棉花葉片內(nèi)葉綠素含量呈現(xiàn)下降后上升的情況，對(duì)照間無顯著性差異。圖6

圖5 不同煙粉虱密度與持續(xù)取食時(shí)間下棉花葉片過氧化氫酶含量變化Fig.5 Catalase content of cotton leaves treated under different whitefly densities or stress time

圖6 不同煙粉虱密度與持續(xù)取食時(shí)間下棉花葉片葉綠素含量變化Fig.6 Chlorophyll content of cotton leaves treated under different whitefly densities or stress time

3 討 論

植物對(duì)蟲害脅迫的響應(yīng)表現(xiàn)為不同物質(zhì)的生理生化指標(biāo)在昆蟲為害后發(fā)生改變，如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、次生代謝物質(zhì)、防御酶以及植物激素等，變化來抵御昆蟲侵害[29]。煙粉虱的口器為刺吸式，其為害作物的方式為吸食食物葉片造成植物生理性受損[30]，發(fā)現(xiàn)煙粉虱對(duì)棉花進(jìn)行取食脅迫后，棉花葉片的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中可溶性糖、可溶性蛋白和游離氨基酸脯氨酸均產(chǎn)生了不同程度的變化，且變化程度與煙粉虱的為害密度和為害時(shí)間密切相關(guān)，72 h的處理時(shí)間中，可溶性糖的含量隨著為害密度升高含量降低，隨著為害時(shí)間延長(zhǎng)含量降低，脯氨酸和總蛋白含量的變化是隨著為害密度的升高而含量升高，隨著為害時(shí)間的延長(zhǎng)含量上升。植物的可溶性糖是存在于葉肉細(xì)胞中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是植物的抗逆性境調(diào)控的重要組成物質(zhì)，是刺吸式口器昆蟲直接吸食的物質(zhì)，隨著昆蟲的吸食使得葉片中可溶性糖含量降低，與前人研究結(jié)論一致[23]，脯氨酸和總蛋白含量的變化，很大可能性是植物本身的防御機(jī)制對(duì)刺吸式口器昆蟲為害產(chǎn)生的一種生理補(bǔ)償反應(yīng)，是對(duì)蟲害脅迫的應(yīng)答，其體內(nèi)總蛋白含量上升，脯氨酸含量長(zhǎng)期研究在植物受到逆境脅迫的條件下會(huì)在植物體內(nèi)積累[31]，最初發(fā)現(xiàn)游離的脯氨酸的大量積累的現(xiàn)象出現(xiàn)在萎蔫的黑麥草中[32]，脯氨酸長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)其作用是作為細(xì)胞的有效滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，同時(shí)能夠保護(hù)酶和膜的結(jié)構(gòu)，一直以來相關(guān)研究多將脯氨酸作為細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能受損評(píng)價(jià)指標(biāo)[31]。在較低密度煙粉虱為害棉花葉片，棉花葉片的葉綠素含量是先下降后上升的，而對(duì)于較高蟲口密度下對(duì)棉花為害，葉綠素含量隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而升高。

植物在蟲害脅迫的情況下，其體內(nèi)保護(hù)酶系的含量和活性上升可用于維持植物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除之間的平衡，預(yù)防膜脂過氧化的反應(yīng)的發(fā)生[33]；但當(dāng)蟲害脅迫的時(shí)間及脅迫的程度加劇，使得活性氧、自由基產(chǎn)生就會(huì)明顯增加，破壞植物體內(nèi)保護(hù)酶系能夠維持的平衡，導(dǎo)致自由基積累，造成膜脂過氧化。丙二醛(malondialdchydc MDA)是膜脂過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物之一，通常利用它作為脂質(zhì)過氧化指標(biāo)，表示細(xì)胞膜脂過氧化程度和對(duì)逆境地條件反應(yīng)的強(qiáng)弱[34-37]。研究發(fā)現(xiàn)，不同密度為害棉花葉片內(nèi)丙二醛的含量隨著為害時(shí)間的增長(zhǎng)其變化是先降低再升高的，而在相同為害時(shí)間內(nèi)，丙二醛含量隨著蟲害密度增加而升高。過氧化氫酶CAT是ROS系統(tǒng)中的一種關(guān)鍵性的保護(hù)酶，是植物體內(nèi)常見的以鐵卟啉為輔基的酶類清除劑其主要功能是促使過氧化氫分解為氧和水，避免過氧化氫的積累，以維護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[38-39]，通過系統(tǒng)研究了煙粉虱不同密度和取食持續(xù)時(shí)間對(duì)棉花防御酶酶活性、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與代謝產(chǎn)物含量的變化，發(fā)現(xiàn)了CAT活性變化、蛋白質(zhì)、可溶性糖、脯氨酸、丙二醛和葉綠素的含量變化均與煙粉虱取食棉花葉片相關(guān)。研究?jī)H從煙粉虱MED隱種為害棉花葉片，在不同為害時(shí)間和為害密度的條件下其葉片的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及葉綠素、丙二醛以及相關(guān)防御酶等物質(zhì)含量變化的角度去揭示棉花受蟲害脅迫后其防御應(yīng)答機(jī)制，但對(duì)于更深層次的原因還需要進(jìn)一步的發(fā)掘和研究。

4 結(jié) 論

4.1棉花對(duì)煙粉虱持續(xù)取食脅迫產(chǎn)生應(yīng)答響應(yīng)，與棉花生理生化性質(zhì)改變相關(guān)。煙粉虱對(duì)棉花的取食為害作用部位一般在葉片背面，在棉花葉片上，不同取食密度和持續(xù)取食時(shí)間均是造成棉花葉片營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物和防御酶活力發(fā)生變化的原因。

4.2不同密度煙粉虱持取食棉花葉片后，葉片中3種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量動(dòng)態(tài)變化不同。在持續(xù)取食24 h后，棉花葉片可溶性糖含量隨密度升高逐漸增高(16.16, 16.77 和18.10 mg/g)；在持續(xù)取食48和72 h后，其含量均隨密度升高而降低，取食時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)增加降低的程度?？偟鞍缀侩S著煙粉虱密度增加而升高，隨煙粉虱持續(xù)取食時(shí)間延長(zhǎng)而升高，在500頭/株處理下，煙粉虱脅迫72 h 后，含量最高(5.92 μg/mL)。脯氨酸含量的變化與總蛋白含量動(dòng)態(tài)變化情況一致，均隨著煙粉虱密度增加而升高，隨煙粉虱持續(xù)取食時(shí)間延長(zhǎng)而升高，脯氨酸含量在500頭/株處理組持續(xù)取食72 h后含量最高。

4.3丙二醛含量在不同密度煙粉虱持取食后，隨著持續(xù)取食時(shí)間延長(zhǎng)，丙二醛含量在50和500頭/株處理密度下呈現(xiàn)先降低后升高的情況。在24和72 h處理下隨煙粉虱處理密度升高含量升高。

4.4植物防御酶CAT隨著煙粉虱處理密度增高和持續(xù)取食時(shí)間延長(zhǎng)，含量均升高。葉綠素在煙粉虱持續(xù)取食24和48 h含量隨密度升高而下降，72 h測(cè)定含量隨取食密度升高而升高(1.55, 1.92和1.98 mg/g)。