紅花椒提取物和青花椒提取物對慢性束縛應激小鼠的抗抑郁作用

譚邦銀，于浩飛，謝建平，張素婷，王 晶，尹文耀，丁彩鳳，張榮平，郭 英，張蘭春

目前，臨床多用西藥治療抑郁癥，存在副作用大等問題，中藥治療副作用則相對較小，因而從中藥中篩選抗抑郁的藥用資源，逐漸受到關注[1]。花椒為蕓香科植物青花椒Zanthoxylumschinifolium或花椒Zanthoxylumbungeanum的干燥成熟果皮，其含有生物堿等化合物[2]。花椒根部提取物可通過調節海馬中的神經炎癥和單胺類神經遞質抑制脂多糖誘導的小鼠抑郁樣行為[3]，而粗提物中化學成分種類較多，雖有抗抑郁作用，也不利于直接作為藥物使用，更不利于從中分離高效的抗抑郁單體。本研究針對這一不足，鑒于臨床療效確切的抗抑郁藥多為生物堿，故按富集生物堿的方法制備兩受試物。根據預實驗結果及文獻[3]資料，以單次灌胃200 mg/kg受試物進行治療，并進行行為學測試，監測血清與皮層中腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、5-羥色胺(5-hydroxytryptophan, 5-HT)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)以及血清和腦中一氧化氮(nitric oxide, NO)的水平變化，初步評價兩受試物的抗抑郁作用，旨為從兩受試物中分離高效低毒的抗抑郁單體提供藥理學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級雄性ICR小鼠45只， 4～5周齡，體質量(20±2)g，購自昆明醫科大學實驗動物學部，實驗生產許可證號：SCXK(滇)K2020-0004，動物實驗獲得昆明醫科大學動物實驗倫理委員會的同意。

1.2 主要儀器與試劑多功能酶標儀、高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific)；高速組織勻漿儀(武漢塞維爾生物科技有限公司)；含種子的干青、紅花椒果皮(市售)；鹽酸舍曲林片(輝瑞制藥有限公司，批號：H10980141)；橄欖油(益海嘉里食品營銷有限公司)；Mouse BDNF ELISA檢測試劑盒、Mouse 5-HT ELISA檢測試劑盒、Mouse GSH ELISA檢測試劑盒、Mouse NO ELISA檢測試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.3 花椒提取物的制備分別取青花椒和紅花椒粉末，加3倍量甲醇，(76±2) ℃提取3次，每次2 h，合并提取液，回收溶劑，得青花椒和紅花椒浸膏。取青花椒浸膏，加水稀釋，鹽酸調pH為2～3，抽濾，濾液加氨水調pH為9～10，加3倍量乙酸乙酯，萃取3次，合并乙酸乙酯層，減壓回收溶劑，冷凍干燥，即得青花椒提取物；另取紅花椒浸膏，加水稀釋，D101大孔樹脂吸附，依次用水、35%甲醇及甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，回收甲醇，加少量乙酸乙酯，除去脂溶性成分，減壓揮干溶劑，冷凍干燥，即得紅花椒提取物。

1.4 分組與造模將小鼠隨機分成5組，每組9只，分別為正常組、模型組、鹽酸舍曲林組(10 mg/kg)、紅花椒提取物組(200 mg/kg)與青花椒提取物組(200 mg/kg)；記錄小鼠體質量W0(g)，模型組及給藥組用慢性束縛應激的方式復制抑郁模型，具體方法為：將小鼠放入50 ml四周開有通氣孔的特制離心管中，用紗布與膠帶封住離心管口，連續8 d，每天11 h。

1.5 給藥與行為學測試整個實驗過程只給予一次藥物治療，具體方法為：造模結束1 d后，記錄小鼠體質量W1(g)。稱取鹽酸舍曲林，加橄欖油配成1 mg/ml的混懸液；取青花椒和紅花椒提取物用橄欖油各配成20 mg/ml的混懸液，按0.1 ml/10 g灌胃給藥，正常組和模型組則同法給予橄欖油。給藥后第1天進行曠場實驗：將小鼠放入長、寬均為50 cm，高為40 cm，底部為黑色的敞口木箱中央，記錄6 min內小鼠進入中央區域次數(central area times，CAT)、中央時間百分比(percentage of central time，PCT)和中央路程百分比(percentage of central distance，PCD)。每只小鼠測試結束后，用75%乙醇溶液擦拭箱底，除去上一只小鼠留下的排泄物及氣味，待酒精揮干后，再測試下一只小鼠。給藥后第2天進行強迫游泳實驗：將小鼠放入裝有4.5 L水的5 L透明燒杯中，水溫(25±2) ℃，待小鼠自由游泳適應2 min后，記錄6 min內小鼠的不動時間百分比。每測完一只小鼠更換一次水。

1.6 ELISA法檢測BDNF、5-HT、GSH及NO的含量給藥后第3天，記錄小鼠體質量W2(g)，用2%水合氯醛麻醉小鼠，心尖取血，全血4 ℃下10 000 r/min離心10 min，取上清液，即得待測液；取血后，處死小鼠并迅速取出小鼠大腦，液氮冷凍20 min后移至-80 ℃冰箱保存。指標測試前，取出小鼠大腦，冰上快速分離皮層，稱重，9 g樣品加2% PBS溶液1 ml，勻漿，4 ℃下10 000 r/min離心10 min，取上清液，即得BDNF、GSH及5-HT待測液；取去除大腦皮層的半腦，稱重，10 g樣品加1 ml的NO提取液，勻漿，4 ℃下10 000 r/min離心10 min，取上清液，即得NO待測液。按ELISA 試劑盒說明書測定上述待測液中BDNF、5-HT、GSH及NO的含量。

2 結果

2.1 花椒提取物對小鼠體質量的影響與正常組相比，各組小鼠W0無明顯差異(FW0=0.80,P>0.05)，各組小鼠W1均降低，表明慢性束縛應激可致小鼠體質量降低(FW1=5.39,P<0.01)。與模型組相比，鹽酸舍曲林組與紅花椒提取物組小鼠W2均增加，提示紅花椒提取物能逆轉小鼠體質量的降低(FW2=4.09,P<0.05)，作用效果與鹽酸舍曲林相當，見表1。

表1 花椒提取物對小鼠體質量的影響

2.2 花椒提取物對小鼠曠場行為的影響與正常組相比，模型組PCT、PCD及CAT均降低(P<0.05,P<0.01,P<0.01)，表明慢性束縛應激可致小鼠焦慮樣行為；與模型組相比，紅花椒提取物組PCD和CAT均增加(FPCD=5.03,FCAT=4.25;P<0.01,P<0.05)；鹽酸舍曲林組和青花椒提取物組的PCT、PCD和CAT均增加(FPCT=3.60,FPCD=5.03,FCAT=4.25;P<0.01)；表明紅花椒、青花椒提取物均可改善小鼠焦慮樣行為，作用效果同鹽酸舍曲林。見表2。

表2 花椒提取物對小鼠曠場行為的影響

2.3 花椒提取物對小鼠強迫游泳不動時間百分比的影響如圖1所示，與正常組相比，模型組不動時間百分比增加(P<0.05)，表明慢性束縛應激可致小鼠抑郁樣行為；與模型組相比，鹽酸舍曲林組、紅花椒提取物組及青花椒提取物組均能降低小鼠不動時間百分比(F=3.599;P<0.05,P<0.05,P<0.01)，提示紅花椒提取物和青花椒提取物均能改善小鼠的抑郁樣行為，作用效果與鹽酸舍曲林相當。

圖1 花椒提取物對小鼠強迫游泳不動時間百分比的影響(n=9)A：正常組；B：模型組；C：鹽酸舍曲林組；D：紅花椒提取物組；E：青花椒提取物組；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較：#P<0.05

2.4 花椒提取物對小鼠血清和皮層中BDNF的影響血清BDNF水平：與正常組相比，模型組、紅花椒提取物組和青花椒提取物組均降低(P<0.01,P<0.01,P<0.05)；與模型組相比，紅花椒提取物組和青花椒提取物組均無明顯變化(F血清=5.467,P>0.05)，紅花椒提取物組較鹽酸舍曲林組有差異(P<0.05)，表明前者作用較后者弱，見圖2a；皮層BDNF水平：與正常組相比，模型組降低(P<0.01)；與模型組相比，鹽酸舍曲林組和紅花椒提取物組均增加(F皮層=9.893,P<0.01)，提示紅花椒提取物抗抑郁作用與改善小鼠大腦皮層中的BDNF水平有關，作用效果與鹽酸舍曲林相當，見圖2b。

圖2 花椒提取物對小鼠血清中和皮層中BDNF的影響(n=5)A：花椒提取物對小鼠血清中BDNF水平的影響；b：花椒提取物對小鼠皮層中BDNF水平的影響；A：正常組；B：模型組；C：鹽酸舍曲林組；D：紅花椒提取物組；E：青花椒提取物組；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較：#P<0.05，##P<0.01；與鹽酸舍曲林組比較：$P<0.05

2.5 花椒提取物對小鼠血清和皮層中5-HT的影響如圖3所示，與正常組相比，模型組小鼠血清和皮層中5-HT水平均降低(P<0.05)；與模型組相比，紅花椒提取物組小鼠血清和皮層中5-HT水平均增加(F血清=3.121,F皮層=2.105;P<0.05)，表明紅花椒提取物抗抑郁作用與改善小鼠血清和皮層中的5-HT水平有關；青花椒提取物組小鼠皮層中5-HT的水平增加(F皮層=2.105,P<0.05)，血清中無明顯變化，提示青花椒提取物抗抑郁作用與改善小鼠皮層中5-HT水平有關，兩花椒提取物改善血清或皮層中5-HT水平的作用與鹽酸舍曲林相當。

圖3 花椒提取物對小鼠血清中和皮層中5-HT的影響(n=5)A：花椒提取物對小鼠血清中5-HT水平的影響；b：花椒提取物對小鼠皮層中5-HT水平的影響；A：正常組；B：模型組；C：鹽酸舍曲林組；D：紅花椒提取物組；E：青花椒提取物組；與模型組比較：*P<0.05；與正常組比較：#P<0.05

2.6 花椒提取物對小鼠血清和皮層中GSH的影響如圖4所示，與正常組相比，模型組小鼠血清和皮層中GSH水平均降低(P<0.01,P<0.05)；與模型組相比，紅花椒提取物組小鼠血清和皮層中GSH水平均改善(F血清=12.271,F皮層=2.664;P<0.01)，表明紅花椒提取物抗抑郁作用與增加小鼠血清和皮層中GSH的水平密切相關；鹽酸舍曲林組和青花椒提取物組小鼠血清中GSH的水平均增加(F血清=12.271,P<0.01)，皮層中GSH的水平均無明顯變化，提示青花椒提取物的抗抑郁作用與改善血清中GSH水平有關。

圖4 花椒提取物對小鼠血清中和皮層中GSH的影響(n=5)A：花椒提取物對小鼠血清中GSH水平的影響；b：花椒提取物對小鼠皮層中GSH水平的影響；A：正常組；B：模型組；C：鹽酸舍曲林組；D：紅花椒提取物組；E：青花椒提取物組；與模型組比較：**P<0.01；與正常組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.7 花椒提取物對小鼠血清和腦中NO的影響

如圖5所示，與正常組相比，模型組小鼠血清和腦中的NO的水平均增加(P<0.01)；與模型組相比，青花椒提取物組小鼠血清和腦中的NO的水平均降低(F血清=3.881,F腦=4.161,P<0.05)，表明青花椒提取物的抗抑郁作用與降低NO水平密切相關，且作用與鹽酸舍曲林相當；紅花椒提取物組小鼠血清和腦中的NO水平只呈現出降低的趨勢。

圖5 花椒提取物對小鼠血清中和腦中NO的影響(n=5)A：花椒提取物對小鼠血清中NO水平的影響；b：花椒提取物對小鼠腦中NO水平的影響；A：正常組；B：模型組；C：鹽酸舍曲林組；D：紅花椒提取物組；E：青花椒提取物組；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

抑郁癥的發病率逐年增加，嚴重威脅人類生命健康[4]，鹽酸舍曲林作為一線抗抑郁藥物，具有較好的療效，在臨床被廣泛應用，有研究[5-6]表明其治療效果與文拉法辛相當，治療總有效率達83.33%，但其也具有可累及神經系統、循環系統等全身多個重要系統器官，且為遲發型的不良反應。近年來，天然產物因其安全性高，從中篩選抗抑郁藥物逐漸受到重視，五乙酰梔子苷、姜黃素等正廣泛開展抗抑郁研究，結果表明兩者均具有較好的抗抑郁作用，其中五乙酰梔子苷可通過調節下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal, HPA)軸，進而改善慢性輕度不可預見性應激所致大鼠抑郁行為[7-8]。花椒是一種藥食同源的日常調味品，安全性高，有研究[3]表明其根部提取物具有較好的抗抑郁作用，具有深入研究的價值。

慢性束縛應激是使小鼠長時間束縛于密閉環境，最終感到逃脫無望而產生類似人類絕望、乏力等癥狀，廣泛用于復制小鼠抑郁模型。曠場實驗常用于評價焦慮狀態，強迫游泳則廣泛用于評價抑郁狀態。本研究通過慢性束縛應激復制抑郁模型，經曠場及強迫游泳實驗評價小鼠焦慮和抑郁狀態，結果表明慢性束縛應激可致小鼠體質量降低，并產生典型的焦慮和抑郁樣行為；較模型組，紅花椒提取物可逆轉慢性束縛應激所致小鼠的體質量降低，且給藥組均能改善抑郁小鼠異常的行為學指標。

抑郁是一種復雜的精神疾病，具體發病機制尚不清楚，但增加5-HT水平，對改善抑郁癥狀有明確的療效。BDNF具有調節和保護5-HT和多巴胺能神經元的作用，是兩種神經元的重要調控物質[9]，上調抑郁模型大鼠海馬區BDNF的表達可促進5-HT的水平增加。 NO含量顯著增加，負反饋抑制四氫生物蝶呤的合成，進而影響5-HT的生物合成，降低NO水平，可改善5-HT水平；而且NO能使HPA軸亢進，進而導致抑郁；鉤藤總生物堿能通過HPA軸降低腫瘤壞死因子及NO的水平，明顯改善小鼠的抑郁行為[10]。因此改善抑郁小鼠的5-HT和BDNF，降低NO水平可明顯改善抑郁癥狀。除此，增加大鼠血清和皮質部位GSH的水平，也可改善模型大鼠抑郁樣行為[11]。本研究結果表明，按本研究方法制備的兩受試物均能不同程度地改善上述因子水平，從而發揮一定的抗抑郁作用。

綜上，按本研究方法制備的青花椒和紅花椒提取物均表現出一定的抗抑郁作用，是篩選抗抑郁生物堿單體的理想原料。本研究的受試物為混合物，作用機制較復雜，清楚地闡明其抗抑郁機制比較困難，故只對其進行了抗抑郁的初步評價。對其抗抑郁的具體機制，還有待于后期進一步對兩受試物中的主要化學成分的分離以及各成分的藥理研究。