基于系統藥理學探討莪術醇調控鐵死亡和細胞自噬的作用機制

王佳慧，何文星，黃茹君，何佳禧，黎小清，鄭 洋，汪 磊

莪術是姜科植物蓬莪術(CurcumaphaeocaulisVal)，廣西莪術(C.kwangsiensisS.G.Leeet.C.F.Liang)的干燥根莖，具有行氣破血、消積止痛之功，對脅痛等有效果[1]。莪術醇是莪術的主要活性成分，具有抑制腫瘤細胞增殖、抗炎等作用[2]。目前對莪術醇的研究主要集中在癌癥以及慢性肝病領域。鐵超載和脂質過氧化被認為是鐵死亡的中心環節[3]。有研究[4]表明，誘導肝星狀細胞發生鐵死亡，可以有效阻止肝纖維化的發展。細胞自噬是通過溶酶體降解自身組分以維持穩態的過程。細胞自噬對肝纖維化的調控是雙向的[5]。細胞自噬通過調節肝星狀細胞的脂質代謝促進肝纖維化的發展；另一方面，細胞自噬通過調控肝細胞在肝臟炎癥和肝臟代謝穩態等細胞功能抑制肝纖維化的發展[6]。鐵死亡和細胞自噬在肝纖維化的發展中均發揮了重要作用，為了探究莪術醇和鐵死亡與細胞自噬之間的關系。該研究使用系統藥理學的方法對莪術醇調控鐵死亡和細胞自噬的分子機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 莪術醇化學成分靶點預測本研究使用中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)(http:ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)收集莪術醇藥效成分信息，保存為mol2格式文件，然后將其上傳PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)。基于反向藥效團匹配法，選擇藥物的藥效團模型, 設置最終產生300個蛋白構象，得到與化合物相關的靶點名稱、基因名稱、Uniprot ID等結果。借助Uniprot(https://www.uniprot.org/)，對化合物預測產生的靶點進行篩檢，只保留物種為“Homo sapiens”的靶點。

1.2 鐵死亡和細胞自噬相關靶點的獲取鐵死亡相關靶點是在FerrDb數據庫(http://www.zhounan.org/ferrdb)中獲取的，細胞自噬相關靶點在HAMdb(http://hamdb.scbdd.com/)數據庫中檢索獲取，從而構建相應數據庫。

1.3 網絡的構建采用Venny2.1對莪術醇作用靶點與鐵死亡相關靶點；以及與細胞自噬相關靶點進行交互處理，同時采用Venny2.1對三者共同靶點進行交互處理，而后借助蛋白互作String數據庫獲取相關靶點互作信息，使用Cytoscape3.6.0將互作靶點進行可視化處理。

1.4 生物信息學分析使用基因本體論(GO)注釋數據庫網站(http://www.geneontology.org)，京都基因與基因組百科全書(KEGG)路徑富集分析(http://www.genome.jp/kegg/)對這些靶點進行可視化和生物信息學分析。

2 結果

2.1 莪術醇作用靶點以及鐵死亡和細胞自噬相關靶點的確定使用Pubchem數據庫確認了莪術醇的結構，通過PharmMapper數據庫獲得了莪術醇的作用靶點300個，借助Uniprot數據庫，對化合物預測產生的靶點進行篩檢與檢查，剔除重復、非人源與不規范的靶點，最終只得到了152個靶點。在FerrDb數據庫中選取抑制和促進鐵死亡以及其標志物，去除三者重復的靶點，最終獲得與鐵死亡關系密切的靶點259個，在HAMdb數據庫中獲取了與細胞自噬關系密切的靶點796個。

2.2 關鍵靶點的網絡構建與分析對莪術醇作用靶點和鐵死亡靶點進行交互處理，得到14個共同靶點，分別是MAPK8、AKR1C2、ALB、MAPK1、MAPK14、DPP4、NOS2、AKR1C3、AKR1C1、PTGS2、SRC、HNF4A、NQO1、ALOX15；莪術醇與細胞自噬靶點交互處理得到21個靶點，分別是MAPK8、MAPK10、KDR、ALB、MAPK14、IGF1R、FKBP1A、MAPK1、HSP90AA1、PPARG、CTSB、CHEK1、PKM、NOS3、IRGM、PDPK1、GSK3B、NQO1、PRKCD、CAMKK2、NOS2；莪術醇與細胞自噬和鐵死亡共同重復靶點6個，分別是MAPK8、ALB、MAPK14、MAPK1、NOS2、NQO1，如圖1A所示。

莪術醇抗鐵死亡的14個靶點，借助String數據庫獲取其相互作用數據，導入Cytoscape3.6.0進行可視化(如圖1B所示)，其中度值排名前5的分別是PTGS2、ALB、MAPK1、MAPK8、MAPK14，說明這些靶點是關鍵靶點在這個調控網絡中發揮重要的作用，圖中節點的大小反映了度值的大小。

莪術醇抗細胞自噬的21個靶點，借助String數據庫獲取其相互作用數據，只獲得了19個靶點相互作用的數據，導入Cytoscape3.6.0進行可視化(如圖1C所示)，其中度值排名前5的分別是HSP90AA1、MAPK1、MAPK8、ALB、NOS3，說明這些靶點是關鍵靶點在這個調控網絡中發揮重要的作用，圖中節點的大小反映了度值的大小。

莪術醇與鐵死亡和細胞自噬重復靶點6個，借助String數據庫獲取其相互作用數據，導入Cytoscape3.6.0進行可視化(如圖1D所示)，其中度值排名前3的分別是MAPK1、MAPK8、ALB，說明這些靶點是莪術醇調控鐵死亡以及細胞自噬的關鍵靶點，也反映了鐵死亡和細胞自噬之間的關系密切，圖中節點的大小反映了度值的大小。

圖1 莪術醇調控鐵死亡和細胞自噬相關靶點A：莪術醇作用靶點與鐵死亡以及細胞自噬相關靶點交互；B：莪術醇調控鐵死亡靶點互作網絡；C：莪術醇調控細胞自噬相關靶點互作網絡；D:莪術醇與鐵死亡和細胞自噬重復靶點互作網絡

2.3 關鍵靶點途徑和功能的富集分析從莪術醇作用的152個靶點中收集到14個調控鐵死亡的靶點，為了確定相關的途徑和功能，對這些可能的靶點按照P<0.01進行了通路富集和GO功能分析。這些靶點的生物過程、分子功能以及細胞組分分別是對刺激的反應、代謝過程、生物調節過程；細胞因子活力、抗氧化的能力、轉錄調節活力；主要位于細胞器和細胞膜上，富集途徑主要包括血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)信號通路、花生四烯酸代謝通路、白細胞介素17(interleukin 17, IL-17)信號通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)信號通路等，具體見圖2。

從莪術醇作用的152個靶點中收集到21個調控細胞自噬的靶點，為了確定相關的途徑和功能，對這些可能的靶點按照P<0.01進行了通路富集和GO功能分析。這些靶點的生物過程、分子功能以及細胞組分分別是細胞增殖、生長、免疫過程；結合、抗氧化的能力、轉錄調節活力；主要位于細胞器和細胞外，富集途徑主要包括NOD樣受體信號通路、自噬通路、FoxO信號通路、PI3K-Akt信號通路等，具體見圖3。

圖3 莪術醇調控細胞自噬相關靶點功能富集分析A：莪術醇調控細胞自噬靶點的GO分析；B：莪術醇調控細胞自噬靶點通路分析

從莪術醇作用的152個靶點中收集到了6個與細胞自噬和鐵死亡重復的靶點，為了確定相關的途徑和功能，筆者對這些可能的靶點按照P<0.01進行了通路富集和GO功能分析。這些靶點的生物過程、分子功能以及細胞組分分別是生物過程的負調控、抗氧化的能力、主要位于細胞器，富集途徑主要包括ErbB信號通路、GnRH信號通路、HIF-1信號通路等，具體見圖4。

圖4 莪術醇與鐵死亡和細胞自噬重復靶點功能富集分析A：莪術醇與鐵死亡和細胞自噬重復靶點的GO分析；B：莪術醇與鐵死亡和細胞自噬重復靶點的通路分析

3 討論

鐵死亡是谷胱甘肽過氧化物酶4的含量下降，導致細胞氧化還原平衡被打破，引起脂質過氧化物積累，從而誘發細胞死亡的一種類型。細胞自噬主要由雙層膜結構包裹衰老或受損的細胞器、蛋白質、病原微生物等形成自噬溶酶體，然后利用溶酶體中的各種水解酶降解所包裹的內容物，為細胞提供物質與能量來源，是細胞針對內外環境變化的重要調節機制[7]。近年來細胞自噬與鐵死亡之間的調控關系受到廣大科研工作者的關注，對兩者之間的關系目前主要有三種觀點：相互促進，雙氫青蒿素通過促進鐵蛋白自噬，增加ROS活性氧積累，誘導急性髓細胞性白血病細胞鐵死亡，同時抑制自噬可以抑制細胞鐵死亡的發生[8]；相互獨立，有研究顯示西拉米辛和拉帕替尼聯用既可以誘導乳腺癌細胞發生鐵死亡，也可誘導細胞發生自噬性死亡，但兩種死亡方式發生順序不同，提示鐵死亡過程與自噬過程獨立發生作用[9]；相互拮抗，抑制膠質母細胞瘤干細胞自噬活性可以誘導鐵死亡發生，并且增加了其對替莫唑胺的敏感性，提示自噬和鐵死亡之間存在拮抗關系[10]。

本研究通過系統藥理學的研究方法，對莪術醇調控兩種生理過程的可能機制進行了探究。結果表明，莪術醇可以通過PTGS2、ALB、MAPK1、MAPK8、MAPK14等靶點發揮調控鐵死亡的作用，這些靶點的功能主要集中在調控細胞增殖、抗氧化活性、轉錄活性，靶點的途徑主要集中在VEGF信號通路、TNF信號通路、缺氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)信號通路，這些結果表明莪術醇很有可能是調控炎癥反應以及血管新生等過程影響鐵死亡的發生發展。莪術醇可以通過HSP90AA1、MAPK1、MAPK8、ALB、NOS3等靶點發揮調控細胞自噬的作用，這些靶點的功能主要集中在調控細胞增殖、抗氧化活性、轉錄活性，靶點的途徑主要集中NOD樣受體信號通路、FoxO信號通路、PI3K-Akt信號通路，PI3K-Akt以及FoxO信號通路都是調控細胞增殖、凋亡、生長的上游信號[11]。莪術醇可以通過ALB、MAPK1、MAPK8等靶點發揮調控鐵死亡和細胞自噬的作用，這些靶點的功能主要集中在調控細胞增殖、抗氧化活性，靶點的途徑主要集中在HIF-1信號通路，莪術醇調控鐵死亡和細胞自噬與HIF-1、VEGF信號通路以及HSP90AA1、NOS3等靶點關系密切，而這些靶點和通路與血管新生關系密切。說明鐵死亡和細胞自噬是可以調控血管新生的過程，本研究將為莪術醇在慢性肝病的研究領域開拓新的視角，進一步推動廣西道地藥材莪術的開發與利用。鐵死亡和細胞自噬之間關系密切，但是具體的調控機制需要基礎實驗進一步驗證。

綜上，本研究顯示莪術醇通過PTGS2、ALB、MAPK1等靶點發揮調控鐵死亡的作用，也可以通過HSP90AA1、MAPK1、MAPK8等靶點發揮調控細胞自噬的作用，表明莪術醇可能通過調控鐵死亡和細胞自噬發揮藥理作用。