艾椒散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

王越欣，李媛媛，王 梅，張文智，馮 敏，冀來(lái)喜，倪 艷

（1.山西省中醫(yī)藥研究院，山西 太原 030012；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619）

艾椒散來(lái)源于治療銀屑病的臨床經(jīng)驗(yàn)方，已申請(qǐng)并授權(quán)發(fā)明專利（201610555543.9），由蜂房、苦參、川椒、土大黃、大楓子、蘆薈、艾葉等7味藥材組成，具有清熱燥濕、殺蟲(chóng)止癢、活血化瘀之功效，療效顯著，價(jià)格低廉，且無(wú)副作用［1］。方中蜂房祛風(fēng)止痛，殺蟲(chóng)止癢，祛腐生肌，消炎止痛［2］，為君藥；苦參、川椒、土大黃三藥共為臣藥，清熱燥濕止癢，與君藥配伍，能夠加強(qiáng)祛風(fēng)止癢之功效；大楓子、蘆薈二者共為佐藥，既能加強(qiáng)祛風(fēng)止癢之功，又能起到燥濕清熱之效；艾葉祛濕止癢，活血化瘀，散寒止痛［3］，作為使藥，起調(diào)和諸藥之用。目前尚無(wú)對(duì)艾椒散質(zhì)量評(píng)價(jià)的相關(guān)研究，為了控制其質(zhì)量，保證臨床使用療效，本研究參照處方的功能主治，對(duì)方中主要藥味蜂房、艾葉和蘆薈進(jìn)行了定性鑒別，選擇同時(shí)檢測(cè)大黃素、大黃酚作為土大黃的質(zhì)量控制方法［4］，為艾椒散制訂了準(zhǔn)確可靠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本研究建立的方法具有較強(qiáng)的專屬性和準(zhǔn)確性，能有效控制艾椒散的質(zhì)量，值得推廣應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀 器

Agilent 1100 series HPLC色譜儀（Agilent安捷倫化學(xué)工作站）、LC-300B型數(shù)控超聲波清洗機(jī)（山東濟(jì)寧魯超超聲設(shè)備有限公司）、DFY-200型200 g萬(wàn)能粉碎機(jī)（西安比朗生物科技有限公司）、RE5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、ZF1-Ⅰ多功能紫外分析儀（上海佳鵬科技有限公司）、YOKO-XR顯色加熱器（武漢科技新技術(shù)開(kāi)發(fā)公司）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）、電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑

蜂房、苦參、川椒、土大黃、大楓子、蘆薈、艾葉（生產(chǎn)企業(yè)均為安國(guó)市祁澳中藥飲片有限公司）；大黃酚（批號(hào)0796-200208）、大黃素（批號(hào)110756-201512）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司；聚酰胺（100-200目）、硅膠G，水為超純水，其他所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

按處方比例［1］稱取藥材后將其粉碎，70%乙醇浸泡過(guò)夜，用70%乙醇以合適的流速進(jìn)行滲漉，收集滲漉液（終點(diǎn)為滲漉液變澄清）。將滲漉液減壓濃縮后移入蒸發(fā)皿中，于水浴鍋上蒸干并放入烘箱中烘干，將其研磨作為樣品粉末。

2.2 蜂房的TLC定性鑒別

2.2.1 供試品溶液制備 取本品粉末1 g，加入70%乙醇15 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，蒸干，加入1 mL甲醇溶解。將溶液加在聚酰胺柱（100～200目，1 g，內(nèi)徑為1 cm）上，用甲苯20 mL與70%乙醇10 mL依次洗脫，收集70%乙醇洗脫液，蒸干，殘?jiān)?.5 mL甲醇溶解，即得。

2.2.2 對(duì)照藥材溶液制備 取蜂房對(duì)照藥材1 g，按“2.2.1”項(xiàng)下方法操作，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液制備 按2.1項(xiàng)下方法制備蜂房陰性樣品，取1 g，按“2.2.1”項(xiàng)下方法操作，即得。

2.2.4 鑒別 照薄層色譜（通則0502）試驗(yàn)［5］，分別吸取上述3種溶液10μL、15μL、10μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板，以乙酸乙酯-甲醇-水（8∶1∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出晾干，噴以5%AlCl3乙醇溶液，置于氨蒸氣中熏后，在紫外光365 nm下檢視，供試品在與蜂房對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)且陰性對(duì)照無(wú)干擾（見(jiàn)圖1）。

圖1 蜂房的TLC圖

2.3 艾葉的TLC定性鑒別

2.3.1 供試品溶液制備取本品粉末2 g，加入石油醚（60～90℃）25 mL，置水浴上加熱回流30min濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)诱和? mL使溶解即得。

2.3.2 對(duì)照藥材溶液制備 取艾葉對(duì)照藥材2 g，按“2.3.1”項(xiàng) 下方法操作，即得。

2.3.3 陰性對(duì)照溶液制備 按2.1項(xiàng)下方法制備艾葉陰性樣品，取2 g，按“2.3.1”項(xiàng)下方法操作，即得。

2.3.4 鑒別 照薄層色譜（通則0502）試驗(yàn)［5］，分別吸取上述3種溶液10μL、5μL、10μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板，以石油醚（60～90℃）-甲苯-丙酮（10∶8∶0.5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃下加熱至斑點(diǎn)顏色清晰。艾葉的供試品色譜中，在與艾葉對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同的紫色斑點(diǎn)且陰性對(duì)照無(wú)干擾（見(jiàn)圖2）。

圖2 艾葉的TLC圖

2.4 蘆薈的TLC定性鑒別

2.4.1 供試品溶液制備 取本品粉末1 g，加入70%乙醇15 mL，超聲30 min，過(guò)濾，蒸干，加1 mL甲醇溶解，即得。

2.4.2 對(duì)照藥材溶液制備 取蘆薈藥材0.5 g，按“2.4.1”項(xiàng)下方法操作，即得。

2.4.3 陰性對(duì)照溶液制備 按2.1項(xiàng)下方法制備蘆薈陰性樣品，取1 g，按“2.4.1”項(xiàng)下方法操作，即得。

2.4.4 鑒別 照薄層色譜（通則0502）試驗(yàn)［5］，分別吸取上述3種溶液10μL、5μL、10μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水為（8∶1∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出晾干，噴以5%AlCl3乙醇溶液，于紫外光（365nm）下檢視。蘆薈的供試品色譜中，在與蘆薈對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同的黃色斑點(diǎn)且陰性對(duì)照無(wú)干擾（見(jiàn)圖3）。

圖3 艾葉的TLC圖

2.5 土大黃HPLC含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Waters X-bridge C18（4.6×250 mm，5μm），流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（75∶25），檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm，柱溫：25℃。理論塔板數(shù)按大黃素峰計(jì)算，應(yīng)不低于4000。

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備 取大黃素對(duì)照品、大黃酚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇分別制備成每1 mL中含有大黃酚37μg、大黃素38μg的溶液，搖勻，0.45μm微孔過(guò)濾，即得。

2.5.3 供試品溶液的制備 取艾椒散樣品0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲30 min，放冷，再稱定重量。用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液5 mL，置于燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲處理2 min。再加二氯甲烷10 mL，超聲30 min，放冷，置于分液漏斗中，用少量二氯甲烷洗滌容器，洗滌液并入分液漏斗中，分取二氯甲烷液。酸液再用二氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并二氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL的容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液經(jīng)0.45μm微孔過(guò)濾，即得。

2.5.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.5.2”項(xiàng)下的對(duì)照品2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、20μL、40μL注入高效液相色譜儀。以測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果 （n=6）

2.5.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.5.3”項(xiàng)下艾椒散供試品溶液10μL，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄大黃素、大黃酚的峰面積，計(jì)算其RSD分別為1.6%、0.5%。表明儀器具有良好的精密度。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.5.3”項(xiàng)下艾椒散供試品溶液10μL，分別于樣品制備后的0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算大黃素、大黃酚含量的RSD分別為1.69%、0.47%。表明供試品溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.5.3”項(xiàng)下的方法制備6份艾椒散供試品溶液，精密吸取10μL，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果測(cè)得6份供試品中大黃素、大黃酚含量的RSD分別為4.23%、3.52%。表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.5.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取艾椒散樣品9份，每份0.4 g，分別準(zhǔn)確加入大黃素對(duì)照品溶液（38μg/mL）11.00 mL、13.76 mL、16.51 mL，大黃酚對(duì)照品溶液（37μg/mL）15.77 mL、19.71 mL、23.65 mL，按“2.5.3”項(xiàng)下的方法制備加樣回收供試品溶液，精密吸取10μl，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各待測(cè)成分的加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率測(cè)試結(jié)果 （n=6）

2.5.9 樣品測(cè)定 精密吸取3份供試品溶液各10μL，平行進(jìn)樣2針，兩份對(duì)照品溶液各10μL分別注入高效液相色譜儀測(cè)定，即得色譜圖（見(jiàn)圖4），結(jié)果顯示，峰形理想，基線平穩(wěn)，大黃素與大黃酚分離效果較好，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。以外標(biāo)法計(jì)算艾椒散中大黃素與大黃酚的含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

圖4 土大黃HPLC含量測(cè)定圖

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果

由表3可知，3份樣品大黃素、大黃酚的平均含量分別為1.3075 mg/g、1.8225 mg/g。考慮到藥材來(lái)源差異，本研究以略低于含量最低值設(shè)限，初步擬定艾椒散中大黃素的含量不得少于1.20 mg/g、大黃酚的含量不得少于1.80 mg/g。

3 討論

蜂房的薄層鑒別照參考文獻(xiàn)［2］實(shí)驗(yàn)中供試品和對(duì)照藥材直接使用濾液，斑點(diǎn)不明顯，且供試品圖譜背景色較深，因此采用聚酰胺柱對(duì)其進(jìn)行純化。采用聚酰胺純化供試品溶液時(shí)，考察了用甲苯、70%乙醇，水、70%乙醇依次洗脫，薄層鑒別結(jié)果顯示采用甲苯、70%乙醇洗脫后斑點(diǎn)清晰而且分離效果較好，供試品色譜在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)且陰性對(duì)照無(wú)干擾，故采用此方法作為蜂房的薄層鑒別方法。

實(shí)驗(yàn)考察了蘆薈樣品的展開(kāi)劑，分別比較了乙酸乙酯-甲醇-水兩種不同配比的展開(kāi)效果（100∶17∶13、8∶1∶1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)以8∶1∶1比例展開(kāi)，以5%AlCl3乙醇溶液為顯色劑時(shí)，色譜圖上斑點(diǎn)清晰而且分離效果較好，故采用此方法作為蘆薈的薄層鑒別方法。

土大黃具有清熱解毒、殺蟲(chóng)止血、祛瘀通便等功效［6］，其中大黃素和大黃酚為其中主要藥效成分，大黃素具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗真菌、抗原蟲(chóng)等作用［7］，大黃酚具有抗菌等作用［8］。大黃素、大黃酚均以游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的形式存在，本研究采用稀鹽酸水解可將結(jié)合蒽醌全部水解成為游離蒽醌，便于含量測(cè)定。游離蒽醌溶于二氯甲烷等有機(jī)溶劑，不溶于水，在水解的同時(shí)加入二氯甲烷可使水解出的游離蒽醌溶于二氯甲烷，有利于萃取［9］。流動(dòng)相比例的選擇方面，實(shí)驗(yàn)前期考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸等不同流動(dòng)相，結(jié)合峰形、基線和分離度等因素調(diào)整流動(dòng)相比例，最終選定甲醇-0.1%磷酸溶液（75∶25）作為流動(dòng)相，峰形理想，基線平穩(wěn)，大黃素與大黃酚分離效果較好，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。