液質聯用技術用于皂角的有機分析

何 蕾, 高元吉, 趙麗娟*, 余永良

(1. 四川師范大學 化學與材料科學學院, 四川 成都 610066； 2. 成都天河農業旅游發展有限公司, 四川 成都 611938)

皂角又稱皂莢,是豆科蘇木亞科多年生木本植物,在我國分布廣泛,具有較高的生態、經濟價值[1],其相關產品在食品、農業、醫藥及化工方面有較好應用.《本草綱目》等古代醫書中均有皂角藥用價值的記載,隨著科研工作者對皂角的深入研究,其在臨床和生產生活中具有更廣的應用范圍.皂莢的干燥荊棘即皂角刺,2015版《中華人民共和國藥典》記載皂角刺具有消腫托毒、排膿、殺蟲等功效,有黃酮、多酚、三萜皂苷、甾醇、內酯、三萜等成分,其中的黃酮類化合物,是一種天然抗氧化劑,常被用做抗癌藥物[2]；皂角米含有豐富的氨基酸、礦物質元素、多糖類物質等,在營養保健產品、保鮮膜、藥物開發等方面均具有實際應用價值[3].另外,皂莢外殼及皂角胚中的氨基酸、皂苷等成分,可用于生產洗發液、洗衣粉、洗手液等洗漱產品.基于上述皂角不同部位的潛在應用價值,其不同部位的活性成分值得深入研究,為其綜合利用開發提供理論基礎.

超高效液相色譜(UPLC)具有高靈敏度、高速、高效、應用范圍廣等特點,可以用來實現有機化合物的分離.質譜(MS)具備高選擇性和準確性,可實現化合物的定量.將液相色譜與質譜結合的液質聯用(LC-MS)技術可作為常規的實現化合物分離和定性的方法,能夠連續測得樣品中的多種組分,用于有機成分的高效分析[4-5].皂角資源豐富,而目前對其在實際生產中的應用研究還較少,本研究建立液質聯用技術用于皂角4種物質化學成分分離與鑒定的方法,以期為皂角資源的利用與開發提供參考依據.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器胰酶(Promega)、乙腈(Fisher Chemical)、三氟乙酸(Sigma Aldrich)、甲酸(Fluka)、甲醇(Thermo)、乙酸銨(Thermo)、碘代乙酰胺(Sigma)、硫酸(國藥集團化學試劑有限公司)、葡萄糖(Dr.Ehrenstorfer)、無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)、苯酚(國藥集團化學試劑有限公司)、二硫蘇糖醇(Sigma)、尿素(Sigma)、丙酮(Sigma)、BCA試劑盒(碧云天)及娃哈哈純凈水(天津娃哈哈食品有限公司).

8453可見光光度計(Agilent)、FA1004B分析天平(上海越平科學儀器有限公司)、KQ-800DE數控超聲波清洗儀器(昆山市超聲儀器有限公司)、BR4I離心機(Thermo)、QE系列質譜儀(Thermo)、Q ExactiveTMHF色譜儀(Thermo)、Hypesil色譜柱(Thermo)及ST12R低溫離心機(Thermo).

1.2 實驗方法各步驟實驗簡化流程圖見圖1.

圖1 實驗流程圖

1.2.1蛋白質分析 從-80 ℃的冷庫中取出一定量的樣品,加入液氮研磨,再加入等體積Tris緩沖液,離心10 min,取上清液,加入5倍體積0.1 mol/L乙酸銨/甲醇沉淀,過夜,蛋白質沉淀分別用甲醇和丙酮洗滌3次并沉淀.蛋白溶液中加二硫蘇糖醇至濃度為5 mmol/L,56 ℃還原30 min后加碘代乙酰胺至濃度為11 mmol/L,室溫避光孵育15 min.

胰酶酶解：稀釋樣品的尿素濃度至2 mol/L,以w(胰酶)∶w(蛋白)=1∶50加入胰酶和蛋白,37 ℃酶解過夜.再以w(胰酶)∶w(蛋白)=1∶100加入胰酶和蛋白,繼續酶解4 h,利用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定.脫鹽：使用質量分數2.5%的三氟乙酸(TFA)將冷凍干燥樣品調節至TFA質量分數為1.0%,離心1 min；吸20 μL樣品,離心,分別用質量分數0.1%TFA、體積分數0.1%甲酸和體積分數80%的乙腈溶液清洗離心,冷凍干燥30 min,用20 μL質量分數0.1%TFA、質量分數5%乙腈溶液溶解,待檢測.

儀器為Q ExactiveTMHF色譜儀(Thermo),色譜柱為Agilent 300Extend C18(5 μm,4.6 mm×250 mm).流動相A為含體積分數0.1%甲酸和體積分數2%乙腈的水溶液,流動相B為含體積分數0.1%甲酸的乙腈.色譜條件：60 min內流動相B由質量分數5%逐漸切換為35%,流速為0.3 μL/min.肽段經由超高效液相系統分離后注入電噴霧離子源(ESI)中進行電離分析.最后,將下機后的raw文件直接導入Proteome Discoverer 2.2軟件中進行UniProt數據庫檢索.

1.2.2有機小分子分析 取一定量經液氮研磨的組織樣品,置于EP管中,加入500 μL含質量分數0.1%甲酸和質量分數為80%的甲醇溶液,渦旋振蕩,水浴靜置5 min,離心10 min,取一定量上清液,稀釋至其甲醇質量分數為53%,離心,取上清液,待檢測.

Q ExactiveTMHF色譜儀(Thermo)串聯QE系列質譜儀(Thermo),使用Hyperil Gold Column C18色譜柱.質譜正離子模式下流動相A為質量分數0.1%甲酸水溶液,B為甲醇溶液；質譜負離子模式下流動相A為5 mmol/L醋酸銨溶液,B為甲醇溶液.色譜條件采用梯度洗脫：1.5 min內保持質量分數98% A,12 min內A相質量分數逐漸降為0%,并維持2 min,0.1 min內切換回初始條件(質量分數98% A),平衡2.9 min.流速為0.2 mL/min,柱溫為40 ℃.檢測實驗樣品,將下機數據(.raw)導入CD搜庫軟件,進行保留時間、質荷比(m/z)等參數設置.根據設置的參數進行峰提取、峰面積定量等.通過m/z和碎片離子預測分子式并與數據庫進行比對,用空白樣本去除干擾離子,并對定量結果進行歸一化處理.

1.2.3總糖測定 規范配置質量分數分別為80%和5%的苯酚溶液、100 mg/L標準葡萄糖溶液.取適量樣品于50 mL具塞離心管,5 mL水浸潤,加20 mL無水乙醇,混合均勻,超聲提取30 min.提取結束后離心棄上清液,不溶物用質量分數為80%的無水乙醇洗滌、離心,將不溶物轉移至圓底燒瓶,加入50 mL水超聲提取30 min,重復2次,冷卻至室溫,轉移至200 mL容量瓶,定容.

分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL的標準葡萄糖工作液于具塞試管,用蒸餾水補至1.0 mL,加入1.0 mL苯酚溶液、5 mL硫酸,使用漩渦振蕩器混合均勻,30 ℃水浴中反應20 min,490 nm條件下測吸光度,制定標準曲線.吸取1.0 mL樣品測定液于20 mL具塞試管中,按上述步驟操作,測定吸光度.樣品中多糖含量以質量分數w計,單位以“g/100 g”表示,按下式計算：

其中,m1為標準曲線上查得樣品測定液中含糖量(μg),V1為樣品定容體積(mL),V2為比色測定時所移樣品測定液的體積(mL),m2為樣品質量(g),0.9為校正系數.

2 結果與討論

采用Q ExactiveTMHF色譜儀(Thermo)實現了皂角提取物中多種蛋白質和有機活性物質分析,并對其中含有的總糖含量采用硫酸苯酚法做了定量分析,總離子流圖如圖2所示.

圖2 皂角提取物的液質聯用總離子流圖

皂角米共鑒定得到包含Hypothetical chloroplast RF21、RNA聚合酶亞單元、成熟酶K、蛋白質TIC 214、蛋白質RceA、光敏色素A、光敏色素B等在內的17個蛋白質,其中光敏色素A是植物中唯一能感受并響應遠紅光的光受體[6].皂角胚共鑒定得到26個蛋白質,如ATP合酶亞基8、DNA誘導RNA聚合酶亞基、成熟酶K、蛋白質Ycf2等.UPLC-MS結合高分辨質譜及數據庫,實現了皂角米、皂角胚、皂莢外殼和皂角刺的活性成分的定性定量分析.結果表明,UPLC對不同化合物實現了較好的分離效果,通過對每個化合物峰面積進行定量、整合目標離子,結合母離子和碎片離子歸納分子式,結合mzCloud、mzVaulth和MassList等數據庫,實現各化合物的定性分析,并對其進行歸一化的定量分析.綜上,共鑒定出數百個有機小分子化合物,其中皂角米256個、皂角胚440個、皂莢外殼909個、皂角刺613個.另外,對皂角米、皂角刺、皂莢外殼以及皂角胚的4類主要的活性成分含量進行了對比(表1).

表 1 皂角中4類物質質量分數比較

生物堿是廣泛存在于動、植物體內的一種天然活性成分,是含氮雜原子的弱堿性有機化合物,具有很好的鎮痛作用和抗病毒活性[7-8].皂角米中的生物堿類化合物質量分數達5.814%(表1),含有較多的葫蘆巴堿(質量分數2.817%),該2種化合物具有抗腫瘤、降血糖、降血脂[9-10]活性,具有很大的市場需求.此外,皂角米中含有長春新堿、辣椒堿,有鎮痛、消炎的功效[11-12].皂角米中豐富的生物堿類化合物,擴大了皂角米的實際應用范圍,可用于開發抗病毒、抗腫瘤及鎮痛藥物.皂角米糖類質量分數(5.382%)較低,是一種低糖、高蛋白、氨基酸齊全、礦質元素豐富且符合高鉀低鈉特性的營養食物[3],可制作成飲品或保健食物,適合各類人群食用.另外,皂角米中含有瓜爾豆膠,可作為持水劑和增稠劑用于飲品中,提升產品的穩定性,而且瓜爾豆膠用于食品中具有一定的降低血糖、膽固醇的功效[13-14].皂角米還可用于保鮮薄膜材料、涂料、乳化劑[15-16]等領域.

與皂角米相比,皂角刺富含豐富的生物堿和黃酮化合物,具有天然抗氧化和清除自由基的能力[2];皂角刺的黃酮提取物既可作為食品添加劑來延緩食物的氧化質變,也常作為抗癌藥物和抗腫瘤藥物[13];皂角刺含有的酚類、萜類、甾醇類化合物等,也具備藥理活性,如抗菌、抗炎、抗過敏、免疫調節等作用[17].作為一種傳統中藥,有價格低廉、來源廣、療效多樣化等優點,但目前針對皂角刺藥理研究較少[18],尚需進一步研究皂角刺的化學成分及相應的藥理作用,以擴大皂角刺的應用范圍.

氨基酸是由酸性羧基和堿性氨基組成的有機化合物,氨基酸衍生物則是氨基酸通過一系列反應化合而成.氨基酸及其衍生物具有獨特的生理活性,可調節氮氧化物水平、刺激細胞開放促使鉀外流,使毛發由休止期向生長期轉化[19],促進頭發生長且對皮膚的刺激性較小.皂莢外殼和皂角胚中氨基酸及其衍生物含量較高,常按一定比例配入各種洗護產品中.近年來,市面上也推出了很多含皂角的洗護產品,如皂角洗衣粉、洗衣液等.因此,可充分利用皂莢外殼中含有的有效成分,更有針對性地開發生產洗發水、洗手液、潔面膏等一系列天然獨特的洗護產品.

3 結論

本研究采用液質聯用技術,分別對皂角樹的皂角米、皂角刺、皂莢外殼以及皂角胚的化學成分進行了全面的定性定量分析,從皂角米和皂角胚中鑒定得到多種蛋白質；檢測出數百種有機小分子化合物,并對各部位總糖含量進行了定量分析.

綜上,皂角中富含多種可開發利用的有效成分.在4種皂角物質中,皂角米和皂角刺含有大量的生物堿類、黃酮類化合物,這類化合物的藥用價值很高,有很好的抗癌、抗腫瘤和消炎鎮痛等功效,可進一步深究其具體藥理作用,增加其在臨床治療中的使用范圍.皂莢外殼和皂角胚含有豐富的氨基酸成分,可用于生產洗發水、洗衣液和潔面膏等系列洗護用品.