姜黃素對嗜熱四膜蟲的氧化應激、凋亡誘導及線粒體損傷作用

葸靈娟, 張夢玘, 林志康, 趙宇俠,*

(1. 上海中醫藥大學 研究生院, 上海 200120; 2. 上海健康醫學院 醫學技術學院, 上海 201138)

姜黃素,是從草本植物姜黃的根莖中提取出來的酚類化合物,被廣泛地用于調味劑、食品色素及治療炎癥的中草藥.現代藥理學發現姜黃素具有多種生物活性作用,且價格低廉、廣泛易得,在臨床上有很好的應用前景,如治療炎癥、改善阿爾茲海默癥、改善胰島素抵抗、改善糖尿病腎病的病情、靶向治療癌癥、治療神經系統疾病、治療泌尿系統疾病、心血管疾病、代謝疾病、皮膚疾病等[1-8].然而,隨著姜黃素在食品中、日用化學品和醫學領域的廣泛應用,其毒性報道也日漸增多.姜黃素攝入增多,或許對正常組織細胞亦有毒性作用,有些或許有可能引起繼發腫瘤、肝、腎毒性及骨髓抑制、消化道反應等不良反應.

圖 1 姜黃素結構式

近年來,體外實驗研究發現姜黃素對許多腫瘤細胞株均有明顯的毒性作用,且一般的作用濃度范圍在10～100 μmol/L.同時,也已有相關研究發現姜黃素對CHO細胞株、人外周血淋巴細胞和胃黏膜細胞(GMC)等正常細胞也產生一定的毒性作用[9].并且在動物體內實驗中姜黃素毒性已被廣泛證實,包括高劑量姜黃素可以誘發雌性大鼠、雌雄小鼠致癌[10],姜黃素劑量≥20 mg/kg可導致狗劑量依賴性溶血[11],SD大鼠和Beagle犬經單次、多次給予姜黃素,可對脾、肝、腎產生一定的毒性作用[12],小鼠NOEL劑量(320 mg/kg bw)20倍姜黃素灌喂奧尼羅非魚,可增強奧尼羅非魚血清中SOD活性和前期CAT活性,顯著抑制T-AOC和后期CAT活性,對奧尼羅非魚產生一定的毒性[13].小鼠經口急性毒性姜黃乙醇提取物(ETE),改變小鼠心、肺等臟器重量,降低血中RBC、WBC水平[14]等.大量的研究表明,姜黃素的過量使用可能引起動物體內組織、臟器的改變及體外細胞的毒性,并且體內、體外實驗也探究了其姜黃素毒性的相關機制.

以各種哺乳動物細胞為模型研究姜黃素毒性,評價人體健康風險的報道已經有一些確定的結論,研究發現:姜黃素可通過抑制NF-κB而影響細胞信號通路途徑,進而抑制腫瘤細胞的生長增殖,細胞在低鈣濃度下,姜黃素可以提高生物體線粒體膜通透性,出現膜電位缺失、線粒體腫脹等,促進細胞的凋亡[15].所以姜黃素有可能通過產生過量的活性氧誘導氧化應激來影響嗜熱四膜蟲細胞的增殖、線粒體膜電位的變化,改變細胞膜通透性產生微量毒性誘導細胞凋亡.姜黃素用藥安全性及毒性問題值得高度關注.

姜黃素及相關產品的大量開發,其最終排放水體也引起生態系統的安全隱患,以水生生物為模式生物的關于姜黃素的報道還很少,嗜熱四膜蟲是重要的單細胞真核模式生物,隸屬于原生動物纖毛門,廣泛分布于世界淡水環境中.嗜熱四膜蟲對環境變化靈敏度高,是進行藥物、有機物、無機物、水污染物毒理學評價的一個方便模型[16].嗜熱四膜蟲包含了許多在一些真核生物(包括人類)中保存的基因,不同于其他廣泛使用的單細胞模型生物.例如,超過800個人類基因在四膜蟲中有同源基因,但在釀酒酵母中沒有,其中58個基因與人類疾病有關[17].在本研究中,嗜熱四膜蟲既可以作為單細胞生物擔當姜黃素的藥理學研究,也可以作為水生模式生物評價姜黃素的生態毒性風險.

本研究擬利用不同濃度姜黃素作用于嗜熱四膜蟲細胞建立細胞毒性模型,探究姜黃素對嗜熱四膜蟲細胞的毒性作用及相關機制,為姜黃素臨床合理應用提供科學實驗依據.考察其對嗜熱四膜蟲的形態變化及細胞數量的生長的影響,并進行對活性氧(ROS)的測定、乳酸脫氫酶(LDH)的測定和線粒體膜電位(JC-1)的測定,最后觀察到細胞凋亡的情況來檢測姜黃素對嗜熱四膜蟲細胞的毒性,為理解姜黃素的毒性活性成分及其作用機制提供線索.

1 材料與方法

1.1 細胞嗜熱四膜蟲SB210株系,來源于中科院水生生物研究所繆偉實驗室組饋贈,由本實驗室保種培養.

1.2 試劑與儀器立式壓力蒸汽滅菌鍋(申安LDZX-50KBS),電子天平(PL602-L北京賽多利斯天平有限公司),超凈臺(Haier HCB-900V),恒溫振蕩培養箱(一恒BPN-190CH),高速離心機(Eppendorf H1650-W德國),快速細胞分析儀(Multisizer 4eBeckman),光學顯微鏡(Leica),熒光酶標儀(SpectraMax?iD5),流式細胞儀(BD LSRFortessa)、臺式冷凍離心機(Allegra 64R).

姜黃素購自上海源葉生物科技有限公司(貨號:B20614,相對分子質量:368.38),蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖均購自碧云天生物技術研究所;NaOH購自國藥集團.二甲基亞砜、乳酸脫氫酶試劑盒(LDH)、線粒體膜電位試劑盒(JC-1)、活性氧試劑盒(ROS)均來自碧云天生物技術研究所,Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(美國BD公司).

1.3 實驗方法

1.3.1細胞培養與形態學觀察 將生長至對數生長期的嗜熱四膜蟲細胞接種于15 mL培養瓶中26 ℃、150 rpm條件下于恒溫搖床無菌培養液過夜后,將不同濃度的姜黃素分別加入15 mL錐形瓶中(終質量濃度:0、0.625、1.25、2.5 μg/mL)刺激2 h,每組吸取1 mL于離心管中,7 000 g離心5 min去除上清,用4 ℃預冷的1×PBS洗3次,最后加入100 μL的1×PBS懸浮細胞,取10 μL的細胞懸浮液滴到載玻片上,加入質量分數4%的多聚甲醛固定,蓋上載玻片在光學顯微鏡下觀察細胞形態.

1.3.2快速細胞分析儀檢測姜黃素對嗜熱四膜蟲細胞密度的變化 將生長至對數生長期的嗜熱四膜蟲細胞接種于15 mL培養瓶中26 ℃,150 rpm條件下于恒溫搖床無菌培養液過夜后,將不同濃度的姜黃素分別加入15 mL錐形瓶中(終質量濃度:0、0.625、1.25、2.5 μg/mL)刺激2 h,每組吸取1 mL細胞液體系加入到粒度儀儀器上的杯中稀釋檢測嗜熱四膜蟲數量的變化.每次吸10 mL,檢測3次,然后計算1 mL體系中四膜蟲的數量計算總得母液體系中的四膜蟲數量.本實驗重復3次[18].

1.3.3熒光酶標儀檢測嗜熱四膜蟲細胞內活性氧水平 將生長至對數生長期的嗜熱四膜蟲細胞接種于15 mL培養瓶中26 ℃、150 rpm條件下于恒溫搖床無菌培養液過夜后,將不同濃度的姜黃素分別加入15 mL錐形瓶中(終質量濃度:0、0.625、1.25、2.5 μg/mL)刺激2 h,將細胞懸浮離心,裝載探針液(1∶1 000)避光孵育搖晃20 min,1×PBS洗3次,熒光酶標儀定量檢測熒光強度,激發波長488 nm,525 nm發射波長,實驗重復3次.本實驗重復3次.

1.3.4乳酸脫氫酶(LDH)釋放的檢測 將生長至對數生長期的嗜熱四膜蟲細胞接種于15 mL培養瓶中26 ℃、150 rpm條件下于恒溫搖床無菌培養液過夜后,將不同濃度的姜黃素分別加入15 mL錐形瓶中(終質量濃度:0、0.625、1.25、2.5 μg/mL)刺激2 h,測定前1 h給樣品最大酶活性孔加入LDH釋放劑,加入量為原培養液體積的10%,反復吹打幾次混勻,然后繼續在培養箱中孵育.達到預定時間后,分別各組吸取1 mL于離心管中及無細胞的培養液孔,400 g離心5 min,取上清,分別取每管上清液120 μL加入96孔板,隨即樣品測定,每孔分別加入60 μL LDH檢測工作液,混勻,室溫避光孵育30 min,然后在490 nm處檢測吸光度.令RLDH為LDH釋放率,A0為樣品對照孔的吸光度，A1為處理樣品的吸光度，A2為細胞最大酶活性的吸光度，則

本實驗重復3次.

1.3.5細胞線粒體膜電位(MMP)的測定 將生長至對數生長期的嗜熱四膜蟲細胞接種于15 mL培養瓶中26 ℃、150 rpm條件下于恒溫搖床無菌培養液過夜后,將不同濃度的姜黃素分別加入15 mL錐形瓶中(終質量濃度:0、0.625、1.25、2.5 μg/mL)刺激2 h,每組吸取1 mL細胞液于離心管中,將細胞液7 000 g離心5 min,棄掉上清液,加入提前配好的JC-1工作液,避光孵育搖晃20 min,離心棄上清,用1×的JC-1染色緩沖液洗滌2次,600 g,4 ℃離心4 min,再加入1倍的JC-1染色緩沖液重懸細胞.流式細胞儀和熒光分光光度計定量觀察熒光強度的變化.實驗重復3次.

1.3.6Annexin V/PI雙染法流式細胞術檢測細胞凋亡 將生長至對數生長期的嗜熱四膜蟲細胞接種于15 mL培養瓶中26 ℃、150 rpm條件下于恒溫搖床無菌培養液過夜后,將不同質量濃度的姜黃素分別加入15 mL錐形瓶中(終質量濃度:0、0.625、1.25、2.5 μg/mL)刺激2 h,離心5 min、2 000 rmp,用4 ℃的1×PBS洗滌3次,離心5 min,加入300 μL的Binding buffer懸浮細胞,在加入5 μL的Annexin V-FITC混勻后避光室溫孵育15 min,上流式儀器之前5 min加入PI染料,置于冰上操作,再補加300 μL Binding buffer,檢測細胞凋亡情況.實驗重復3次.

2 實驗結果

2.1 姜黃素對嗜熱四膜蟲細胞增殖變化的影響與空白對照組相比,姜黃素處理組的嗜熱四膜蟲的細胞數量依次降低并且呈現濃度依賴效應,濃度越大,姜黃素的毒性越大,抑制嗜熱四膜蟲細胞數量的變化生長.處理組(0.625、1.25、2.5 μg/mL)分別抑制了16%、32%、37%(P<0.001).說明姜黃素有明顯的抑制嗜熱四膜蟲增殖的效應(如圖2).

圖2 姜黃素對嗜熱四膜蟲細胞增殖變化的影響

2.2 姜黃素對嗜熱四膜蟲細胞形態的影響與空白對照組相比,姜黃素處理組(0.625、1.25 μg/mL)細胞形態基本無明顯現象,姜黃素(2.5 μg/mL)處理組細胞數量明顯變少,細胞形態由橢圓變為圓形,逐漸變小皺縮,里面的細胞出現空囊泡的形態,如圖3中箭頭所指.

圖 3 姜黃素對嗜熱四膜蟲形態學影響(光學顯微鏡×100)

2.3 姜黃素對嗜熱四膜蟲細胞活性氧的影響與空白對照組相比,姜黃素處理后的嗜熱四膜蟲細胞2 h后,姜黃素處理組(0.625 μg/mL)不能夠引起嗜熱四膜蟲細胞內的ROS增加(P>0.05),在姜黃素處理組(1.25、2.5 μg/mL)條件下隨著濃度的增加嗜熱四膜蟲細胞內的DCF熒光強度增大,分別增加了35%、44%(P<0.05).說明ROS的生成量增加(P<0.05),有統計學意義,結果表明高濃度條件下姜黃素能夠促進ROS的產生(圖4).

圖 4 姜黃素對嗜熱四膜蟲細胞ROS的影響

2.4 姜黃素對嗜熱四膜蟲細胞LDH釋放的影響與空白對照組相比,姜黃素(0.625、1.25、2.5 μg/mL)處理組隨著藥物質量濃度的增大,釋放在培養液里的乳酸脫氫酶(LDH)逐漸增多,呈現濃度依賴效應.從數據可以看出低濃度的姜黃素藥物組(0.625 μg/mL)和空白對照組相比釋放的低于姜黃素處理組(1.25、2.5 μg/mL),而質量濃度最大姜黃素處理組(2.5 μg/mL)釋放的最多,說明姜黃素破壞了嗜熱四膜蟲細胞膜提高了膜通透性,使得細胞內部的乳酸脫氫酶(LDH)釋放到了細胞培養液中.在這3個質量濃度的條件下,姜黃素能夠影響嗜熱四膜蟲的細胞膜影響嗜熱四膜蟲細胞的生長,三者與對照組相比增加了10%、17%、45%,具有統計學意義(見圖5).

注:與空白對照組相比,*P<0.05與空白對照組相比,**P<0.01;***P<0.001

2.5 姜黃素對嗜熱四膜蟲細胞線粒體膜電位的影響熒光分光光度計結果分析,JC-1聚合物最大發射波長為595 nm,在這個條件下,嗜熱四膜蟲體內的線粒體膜電位處于高電位,產生的紅色熒光強度強,隨著姜黃素的濃度增大,紅色熒光強度逐漸降低,姜黃素處理組(2.5 μg/mL)的紅色熒光強度最弱,說明姜黃素的作用能夠影響嗜熱四膜蟲線粒體膜電位去極化.結合流式細胞儀對紅綠色熒光光強度的比值結果分析,在姜黃素處理組(0.625、1.25 μg/mL)的條件下嗜熱四膜蟲能夠保持線粒體膜電位的穩定變化,不破壞線粒體膜電位的動態平衡.

流式細胞儀分析,與空白對照組對比,姜黃素處理組(0.625、1.25 μg/mL)在2 h這個時間段內不能夠引起嗜熱四膜蟲細胞的線粒體膜電位發生去極化(P>0.05),而姜黃素處理組(2.5 μg/mL)這個質量濃度條件下才能引起線粒體膜電位發生去極化,引起線粒體膜電位的降低(P<0.05),產生了輕微的毒性作用,有統計學意義(如圖6).

注:與空白對照組相比,*P<0.05

2.6 姜黃素對嗜熱四膜蟲細胞凋亡的影響流式細胞分析,由于PI和FITC在488 nm激發光的激發下可以發出橙色和綠色熒光,儀器收集熒光信號并進行分析,熒光強弱就代表熒光染料標記的多少.Annexin-V與PI雙標流式細胞儀檢測結果如圖7所示.

注:與空白對照組相比,**P<0.01,***P<0.001

實驗結果分析,在與對照組相比,姜黃素處理組(0.625、1.25 μg/mL)在2 h這個時間段內不能引起嗜熱四膜蟲細胞產生凋亡(P>0.05),FITC-Annexin-V與PS結合能力弱,而在這兩個質量濃度的條件下不能使細胞膜外翻,在這2個濃度的處理條件下PI的熒光強度比較弱,而姜黃素處理組(2.5 μg/mL)這個濃度條件下能夠引起嗜熱四膜蟲細胞的凋亡,凋亡率7.42%(P<0.001),具有統計學意義.結合圖7分析,與對照組相比,細胞膜被破壞,發生外翻,使得FITC-Annexin-V與PS結合,PI因與DNA結合量比較少,熒光強度弱,所以姜黃素(2.5 μg/mL)在這個條件下對嗜熱四膜蟲產生了毒性作用.

3 討論

在我國的傳統醫藥文化中,姜黃素常被用于驅蚊蟲、祛風活血、行氣活血、通經止痛等,具有良好的醫療保健效果.姜黃素因深厚的藥用價值與生物活性而備受關注,但姜黃素尚未被批準用作藥物.關于姜黃素的臨床使用的安全性以及其潛在的毒性還需要更深入廣泛的研究支持,同時姜黃素的大量生產使用也帶來環境風險,其對于水生生態的擾動和毒性也值得關注.本研究以嗜熱四膜蟲為模式生物,研究姜黃素的藥物毒性作用豐富其臨床應用的安全性評價的數據,同時嗜熱四膜蟲作為水生模式生物,其毒性效應也能為姜黃素可能的水生生態風險評價提供依據.

本研究選定質量濃度為0.625、1.25、2.5 μg/mL的姜黃素在急性毒性實驗中呈現出計量依賴效應,2.5 μg/mL的姜黃素導致四膜蟲細胞數量生長抑制率達到37%.這與以往研究的姜黃素對HepG2細胞、HT-29細胞、293細胞和SK-MEL-20細胞的生長具有抑制作用,抑制率隨姜黃素濃度的增加而增大,呈明顯的量效關系,生長受到抑制對細胞產生的毒性的結果相似[9,19],雌性Swiss小鼠和Wistar大鼠分別進行體內研究姜黃素的毒性,發現高劑量(質量濃度5%)的小鼠和大鼠均出現明顯的體重增長減緩,相對或絕對的肝重量改變和肝臟毒性如局部壞死(或伴再生的);而在低劑量(質量濃度0.2%或1%)14 d組中僅小鼠出現了肝臟毒性[20].體外細胞還研究發現姜黃素不僅顯著增加阿霉素、博萊霉素等抗癌藥物和Y射線誘導體外中國地鼠卵巢細胞(CHO細胞)染色體畸變的發生率,而且單獨的姜黃素15 mg/mL也能引起CHO細胞染色體畸變[21].實驗結果證明姜黃素的使用過程中在一定的濃度范圍內對細胞具有毒性作用.有研究說姜黃素可誘導DNA損傷,可使細胞周期時相改變,影響細胞的增殖,可能也是本研究中影響細胞增殖的機制[22].

氧化應激是指體內氧化作用與抗氧化作用失衡,引起細胞膜中不飽和脂肪酸發生脂質過氧化,產生大量氧化產物,從而對機體產生損傷作用的過程.關于姜黃素的氧化應激的報道中,姜黃素在氧化性損傷過程中可能起雙重作用,抗氧化作用可能與氧化應激損傷作用并行[23].抗氧化作用一直是姜黃素被廣泛報道的保健作用.大量研究表明,姜黃素能清除超氧離子及氫氧自由基,抑制脂質過氧化,體外細胞實驗證明姜黃素通過抑制ROS的生成而減輕苯并毗或過氧化氫引起的損傷;另一方面,姜黃素的毒性研究中又有很多關于其氧化應激的報道,姜黃素能使人胃黏膜細胞和人外周血淋巴細胞ROS水平升高,進而造成DNA損傷[9,24].

本研究中ROS的測定結果發現,姜黃素在(1.25、2.5 μg/mL)的條件下,能夠促進ROS的產生,而超過一定量的ROS會進一步與生物膜的磷脂、酶和膜受體相關的多不飽和脂肪酸的側鏈及核酸等大分子物質發生脂質過氧化反應而形成脂質過氧化產物，從而使細胞膜的流動性和通透性發生改變，最終導致細胞結構和功能的改變.通過測定乳酸脫氫酶(LDH)的釋放發現，姜黃素能夠引起細胞內發生脂質過氧化，增加細胞膜通透性.說明在本研究的濃度范圍內姜黃素能夠通過氧化應激破壞細胞膜結構,同時形態學的觀察發現,姜黃素處理組(2.5 μg/mL)嗜熱四膜蟲的細胞形態發生了變化,細胞膜是完整的,但是里面出現了空囊泡的的現象.

研究發現,氧化應激和細胞凋亡的關系密切,氧化損傷被證實是細胞凋亡的誘因之一.細胞凋亡是細胞在一系列內源性基因調控下發生的自然或生理性死亡過程,是多細胞有機體維持內環境穩定、控制細胞衰老、調控機體發育的重要機制[25].線粒體途徑是細胞凋亡的主要途徑之一,細胞氧化應激產生過量ROS,線粒體既是ROS的主要來源,也是ROS氧化損傷的主要靶位,過量ROS導致線粒體分裂融合障礙,而損傷的線粒體可以通過產生過量ROS產生細胞毒性[26].線粒體作為細胞中特殊的結構,是多種環境毒物作用的敏感靶點,線粒體功能障礙可導致一系列疾病,如缺血再灌注損傷、敗血癥和諸多糖尿病并發癥等[27].

凋亡與線粒體及ROS之間的機制很復雜,本課題只是簡單初步的研究發現,在2.5 μg/mL下姜黃素能夠引起線粒體膜電位的降低同時也誘導細胞凋亡,研究結果中出現了這個現象,低質量濃度的姜黃素處理組(0.625、1.25 μg/mL)沒有誘導上述現象,而線粒體又是細胞凋亡的通路之一,所以推測凋亡很有可能是通過線粒體途徑來起作用,低濃度水平的氧化應激壓力細胞能夠自我修復平衡,在較高濃度下才會發生線粒體途徑誘導的細胞凋亡.

綜上所述,姜黃素存在一定的毒性,毒性體現在:嗜熱四膜蟲細胞的增殖抑制、細胞形態的改變、細胞膜的破壞、線粒體膜電位的影響、凋亡的誘導,但是這個現象存在濃度效應,不同的濃度體現的損傷范圍和效應不同,對不同的細胞器有不同的效果,所以在使用姜黃素的使用過程中要注意姜黃素的使用濃度范圍,低濃度的姜黃素沒有表現出明顯的毒性,但是也會有一定量的誘導ROS的產生,所以低濃度的姜黃素沒有產生表觀毒性,但是長期的累積效應會不會產生明顯的毒性,會不會對生態產生破壞,需要進行后期實驗的驗證.本研究初步闡明了姜黃素的毒性作用及機制,說明姜黃素在一定濃度范圍內存在毒性效應,為姜黃素的臨床用藥及安全合理應用提供了科學的實驗依據.更為精確完整的毒性機制尚需大量的研究繼續驗證.