稻蝦共養病蝦腸道細菌群落變化與病原細菌分離及藥物敏感性

石曉媛 王麒 方明棵 王瑩 楊亞珍 朱建強

摘要：病害是影響稻蝦共養農民經濟收入的重要因素。為明確稻蝦共養發病塘口中致病菌的種類及其防治方法，以健康蝦和病蝦為研究材料，運用Illumina MiSeq全基因組測序技術，對健康蝦和病蝦腸道內細菌的群落組成進行測定和分析，預估出病原菌的種類。在此基礎上，使用選擇性培養基對病蝦腸道內疑似病原菌進行分離。將分離所獲疑似病原菌注射至健康蝦體腸道內，并觀察蝦體死亡情況，最終確定所選病原菌菌株。通過顯微觀察、16S rDNA序列分析，最終確定該病原菌的分類地位。最后利用藥敏性試驗，篩選出對該病原菌有抑制效果的抗生素和中草藥種類。試驗結果表明，健康蝦與病原蝦腸道內的細菌群落結構具有顯著性差異。在門水平上，健康蝦腸道內細菌主要是柔壁菌門，其相對豐度為74.23%;而病蝦腸道內細菌主要是變形菌門，其相對豐度為67.39%;在屬水平上，健康蝦腸道內主要是柔膜菌屬，其相對豐度為48.30%;病蝦腸道內主要是非保密氣單胞菌屬，其相對豐度為13.50%。分離結果顯示，所獲8株細菌均為革蘭氏陰性菌，在選擇性培養基上均呈黃色。病原菌回接感染結果表明，1.5×108 CFU/mL注射后1 d內，致死率高達100%。分子學鑒定結果表明，該病原菌為哈夫尼菌屬蜂房哈夫尼菌。該菌對所選的卡那霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星、氯霉素這5種抗生素比較敏感;對黃芩、苦參、艾葉等3種中草藥水提物比較敏感。本研究可為稻蝦共養流行病的診斷及防治，以及小龍蝦的健康養殖提供理論依據。

關鍵詞：克氏原螯蝦;病原微生物;分離鑒定;防治;藥物敏感性;蜂房哈夫尼菌

中圖分類號： S182;S945.1? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）08-0169-07

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）俗稱小龍蝦，原產于北美洲，1929年傳入我國，目前是我國主要經濟蝦類之一，在淡水甲殼動物養殖中位居第一[1]。由于長期的高密度養殖，以及養殖過程中使用大量的肥料和人工飼料，導致克氏原螯蝦養殖環境日漸惡化，病害頻繁發生，嚴重影響了小龍蝦產業的健康發展和農戶的經濟收入[2]。

克氏原螯蝦常見的病害有黑鰓病、爛尾病、纖毛蟲病、出血病等[3]。目前報道的病原菌主要有嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）[4]、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）[5] 、擬態弧菌（V. mimicus）[6]、螺原體（Spiroplasma）[7]、白斑綜合癥病毒（white spot syndrome virus）[8]、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）[2]、原螯蝦摩氏摩根菌（Morganella morganii）等[9]。雖然前人對克氏原螯蝦病原菌做過較多的研究，但不同養殖地區的氣候條件、養殖方式存在著差異，因而病原微生物種類應有典型性。

克氏原螯蝦等甲殼類動物的腸道是儲存食物、消化和吸收營養的重要器官。腸道內寄生著種類復雜、數量龐大的微生物類群。這些微生物對宿主的免疫、消化、吸收等多種生理活動起到了促進作用[10-11]。在健康條件下，腸道微生物類群之間處于平衡狀態，但在病害發生時，腸道內微生物類群之間的平衡會被打破。因此，研究病害發生時，小龍蝦腸道微生物的群落組成變化對小龍蝦疾病的診斷和預防均具有重要意義。

本研究主要針對2020年湖北省荊州地區稻蝦共養塘口中存在的病害現象進行研究，以期明確病害發生的原因，找到致病根源微生物，并尋找防治該病原菌的有效措施。該研究可為稻蝦共養生產中病原菌的診斷及防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病害和健康克氏原螯蝦體均采自湖北省公安縣沙場村稻蝦塘口。連翹、大蒜、黃柏、黃芩、陳皮、甘草、苦參、野菊花、當歸、紫蘇、蒲公英、丁香、秦皮、夏枯草、魚腥草、艾葉、石榴皮、虎杖等18味中草藥購自荊州市弘衛大藥房。抗生素藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。細菌基因組提取試劑盒、PCR Master Mix購自生工生物工程（上海）有限公司。氣單胞菌培養基配方：蛋白胨5.00 g/L，酵母粉3.00 g/L，L-賴氨酸鹽酸鹽3.50 g/L，L-精氨酸鹽酸鹽2.00 g/L，山梨醇3.00 g/L，肌醇2.50 g/L，乳糖1.50 g/L，木糖3.75 g/L，膽鹽3.00 g/L，硫代硫酸鈉10.67 g/L，氯化鈉5.00 g/L，檸檬酸鐵銨0.80 g/L，溴麝香草酚藍0.04 g/L，麝香草酚藍 0.04 g/L，瓊脂12.50 g/L，氣單胞菌培養基添加劑5.00 mL/L。

1.2 試驗方法

1.2.1 蝦體腸道DNA的提取與16S rDNA擴增

2020年5月16日，從湖北省公安縣沙場村健康稻蝦塘口和發病塘口中分別采集健康和發病克氏原螯蝦（以下簡稱為健康蝦、病蝦）各30尾，用75%乙醇擦拭蝦體表面，再用無菌生理鹽水沖洗2～3次，取其腸道物。使用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）方法提取克氏原螯蝦后腸總DNA，通過Nanodrop 2000和瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和純度。用無菌水將DNA稀釋至1 ng/μL用于 16S rDNA的擴增。使用16S V3～V4區引物341F（5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′）和806R（5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′）進行擴增。PCR反應程序：94 ℃ 預變性5 min;94 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27個循環。

1.2.2 高通量測序與數據分析

PCR產物經純化后制備文庫，測序使用IonS5TMXL測序平臺，利用單端測序（single-end）的方法，構建小片段文庫進行單端測序。通過對reads剪切過濾，將一致性（identity）大于97%的測序序列歸為1個操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）進行聚類和物種分析。利用豐富度指數（Chao1指數、ACE指數）以及多樣性指數（Simpson指數、Shannon指數）分析病蝦和健康蝦腸道內微生物群落的豐度和多樣性。同時在門、綱、目、科、屬5個分類水平上統計每個樣品的物種群落結構和豐度，根據分析結果，預判疑似病原菌的種類。

1.2.3 疑似病原菌的分離與純化

用無菌接種環挑取病蝦腸道物1環，接種到疑似病原菌（氣單胞菌）的選擇性培養基上，于培養箱中36 ℃培養24 h后，從培養基上挑取單菌落，純化2～3次后放入 4 ℃ 冰箱內保存備用。

1.2.4 回接感染試驗確定病原菌株

將所有分離菌株分別接種1環至150 mL氣單胞菌液體培養基中，培養3 d后，用無菌水將每1菌體的菌體濃度分別調至1.5×108、1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5×104 CFU/mL等5個濃度梯度。選取室內養殖活力較好、無明顯外傷的健康克氏原螯蝦150尾（每尾質量大約為12 g），隨機平均分為5組，在每尾克氏原螯蝦第2腹節處注射各濃度菌懸液100 μL，并以注射無菌生理鹽水100 μL作為對照組，對照同樣重復30尾。感染病原菌后的蝦體繼續飼養，記錄感染之后 7 d 內各處理組蝦體的臨床癥狀和死亡率。

克氏原螯蝦室內養殖條件：試驗于2020年6—9月在長江大學生命科學學院實驗樓內進行。小龍蝦采用白色塑料盆養殖，盆內徑長 125 cm、寬 75 cm、高37 cm。試驗用水為當地稻蝦共養塘口水，每箱水深10 cm。每天投喂飼料2次（08：00、19：00），投餌量為蝦體質量的3.5%。5 d為1個周期進行換水，溶解氧控制在5.5～5.7 mg/mL范圍內，室溫保持在23～25 ℃，箱內放置水草及覆蓋物。

1.2.5 病原菌菌株的革蘭氏染色及分子鑒定

將致死率高的濃度梯度菌種接種于氣單胞菌培養基上，于培養箱中36 ℃培養24 h，挑取單菌落的一小部分進行革蘭氏染色。

按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明方法提取革蘭氏染色菌株的總DNA，以27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）為引物進行PCR擴增，采用DNA純化回收試劑盒純化回收16S rDNA產物，然后交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將所得16S rDNA序列在NCBI的GenBank和Blast中進行同源性比對分析，通過MEGA 7等軟件，采用鄰接法（neighbor-joining method）構建系統發育樹[2]。

1.2.6 病原菌對抗生素藥物的敏感性試驗

采用紙片擴散法進行藥物敏感性試驗。每種藥敏片直徑為6 mm，將1環病原菌接種至100 mL液體培養基中，于培養箱中36 ℃培養24 h后，用移液槍吸取 100 μL 菌懸液至固體培養基上，并用無菌玻璃棒涂布均勻，然后將藥敏紙片均勻放置于平板上，每個處理放置3個重復，于培養箱中36 ℃培養18 h后，用游標卡尺測定抑菌圈直徑，參照杭州微生物試劑有限公司提供的判定標準判定該菌對不同種類抗生素藥物的敏感性。

1.2.7 病原菌對中草藥水提物的敏感性試驗

分別稱取每種中草藥50 g，放入燒杯中，加入蒸餾水 1 000 mL，浸泡30 min，加熱至沸騰以后保持微沸狀態20 min，然后將其過濾至容器內，濾液濃度調至 1 g/mL。 藥敏試驗采用瓊脂擴散法，將培養至對數生長期的菌懸液稀釋至濃度為1×107 CFU/mL，用移液槍吸取100 μL菌懸液至固體培養基上，再用無菌刮鏟將菌液涂抹均勻，然后用打孔器（直徑為6 mm）在平板上均勻打3個孔，挑出孔內瓊脂并用空白瓊脂封底，做好標記。在每孔內加入100 μL藥液，放入36 ℃培養箱中培養24 h，然后用游標卡尺測定抑菌圈直徑。依據《中藥藥理學》中敏感性的判斷標準，抑菌圈直徑≥20 mm屬于極敏，抑菌圈直徑在15～19 mm之間為高敏，抑菌圈直徑在10～14 mm 之間為中敏，抑菌圈直徑<10 mm為低敏，沒有抑菌圈為不敏，判定病原菌對各種中草藥水提物的敏感性[12]。

2 結果與分析

2.1 健康蝦與病蝦腸道內細菌多樣性差異

Shannon指數和Simpson指數反映了微生物的多樣性，而Chaol指數和ACE指數反映了微生物的豐富度。從表1可知，健康蝦與病蝦相比，Simpson和Shannon指數差異并不顯著，但健康蝦的Chaol和ACE指數顯著高于病蝦。

2.2 健康蝦與病蝦腸道內細菌群落結構差異

在門水平上，健康蝦主要以柔壁菌門（Tenericutes）為主，相對豐度為74.23%;而病蝦主要以變形菌門（Proteobacteria）為主，相對豐度為67.39%（圖1）。在屬水平上，如圖2所示，柔膜菌綱的柔膜細菌（Unclassified Mollicutes）（48.3%）和RsaHF231（18.5%）為健康蝦腸道內的優勢菌群，二者相對豐度共占細菌類群的66.8%;而病蝦腸道內這2種菌體含量僅占細菌總量的12.7%。但病蝦中氣單胞菌目的氣單胞菌（Unclassified Aeromonadaceae）相對豐度較高，為13.5%，而在健康蝦中，這種菌幾乎沒有，因此初步推斷該菌為主要致病菌，并做進一步的分離。

2.3 疑似病原菌的分離

將病蝦腸道物接種于氣單胞菌選擇培養基上，于培養箱中36 ℃培養24 h后，共獲得8株菌體（編號為N1～N8）。如表2所示，這8株菌體菌落均呈現黃色、圓形、表面光滑、邊緣平整、菌落突起的特征，革蘭氏染色為陰性，因此推斷這8株菌可能為同一菌種。

2.4 疑似病原菌的回接感染驗證

由于所分離的8株疑似病原菌，菌落形態和革蘭氏染色結果相同，因此選擇N1菌株作為回接感染的出發菌株，以注射方式感染健康蝦，注射后蝦體出現不同程度的死亡，死亡率隨菌液濃度的增大而增加。高濃度試驗組（1.5×108 CFU/mL）在注射后1 d內，小龍蝦發生急性死亡現象，死亡率高達100%。1.5×107 CFU/mL注射組在3 d內死亡率達到90%，隨后的4 d未見蝦體死亡。1.5×106 CFU/mL 注射組感染5 d后，死亡率達56.67%，而1.5×105 CFU/mL和1.5×104 CFU/mL注射組死亡率較低。各處理組的小龍蝦發病癥狀均類似于分離前病蝦癥狀，表現為蝦體活力下降、攝食量降低、尾彈反應減弱、應激能力變差等。感染試驗中注射生理鹽水的對照組未出現發病和死亡情況（表3），表明分離的菌株N1為導致本次蝦體發病和死亡的致病菌之一。

2.5 病原菌N1菌株的分類地位確定

利用Blast工具將N1菌株所得16S rDNA序列與 GenBank 數據庫中已知微生物的 16S rDNA 序列進行同源性比對后發現，該菌株16S rDNA序列與Gen Bank中的部分序列有較高的相似性（100%）。系統發育分析結果顯示菌株N1（以S00664X1表示）的16S rDNA基因與JX267126.1聚為同一分支，同源性為100%，根據江楓的研究可知，細菌的16S rDNA序列相似度大于98%，可將它們菌體認定為是相同的種[13]，因此該菌株被認定為蜂房哈夫尼菌（圖3）。

2.6 病原菌N1菌株對抗生素藥物的敏感性試驗結果

病原菌對所選11種抗菌藥物敏感性試驗結果表明，菌株N1對卡那霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星等4種抗生素較為敏感，對氯霉素中介，對慶大霉素、新霉素、青霉素、四環素、多西環素、紅霉素等6種藥物耐藥（表4）。

2.7 病原菌N1菌株對中藥水提物的敏感性試驗結果

瓊脂擴散法試驗結果表明，病原菌N1菌株對黃芩極度敏感，對苦參、艾葉高度敏感，對甘草中度敏感，對當歸低敏，對其他13種中藥水提液不敏感（表5）。

3 討論與結論

克氏原螯蝦因其營養豐富，商業價值高被廣泛養殖。隨著養殖面積和密度的增加導致克氏原螯蝦疾病感染日益嚴重[14-15]。有關小龍蝦致病菌的報道也越來越多，如副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、擬態弧菌、弗氏檸檬酸桿菌、維氏氣單胞菌[16]。本試驗從病蝦腸道中分離出的主要病原菌為蜂房哈夫尼菌。蜂房哈夫尼菌是一種常見的革蘭氏陰性菌，該菌存在于蔬菜、植物以及哺乳動物的胃腸道環境中，可以直接引發感染或者在一些慢性病癥的條件下引起疾病發生[17]。王霞研究發現，蜂房哈夫尼菌可以引起人的化膿性腦膜炎[18]。趙淑芳等報道，蜂房哈夫尼菌能感染棘胸蛙致其產生嚴重的腹瀉和腹脹等腸道類疾病[19]。閆艷新等報道，蜂房哈夫尼菌能夠引起人類泌尿系統和呼吸道的感染，甚至會引起敗血癥的發生[20]。蜂房哈夫尼菌還能引起錦鯽體表出現血點、腸道腫脹潰爛的癥狀，也會引起小白鼠身體抽搐、眼睛分泌黃色黏稠物，以及胃部脹氣、腸部腫脹等一系列的癥狀[21]。本研究發現蜂房哈夫尼菌能夠感染克氏原螯蝦，引起其活力下降、攝食量降低、尾彈反應減弱、應激能力變差，進而發生死亡。

測序結果表明，健康蝦與病蝦相比 Simpson指數和Shannon指數差異并不顯著;但健康蝦的Chaol指數和ACE指數顯著高于病蝦。表明病蝦和健康蝦腸道內微生物類群相似度不高，差異明顯。健康蝦腸道細菌的優勢類群是柔壁菌門，相對豐度為74.23%;病蝦腸道細菌類群主要為變形菌門，相對豐度為67.39%，其中γ-變形菌綱氣單胞菌和β-變形菌綱伯克霍爾德氏菌科非保密伯克霍爾德氏菌屬為優勢菌群，該研究結果與郁維娜等的研究結果[22]不盡相同。本研究發現，病蝦和健康蝦腸道內微生物多樣性差異不明顯，這與郁維娜等的研究結果[22]一致。但本研究發現病蝦腸道內細菌類群主要為γ-變形菌綱和β-變形菌綱，而郁維娜等的研究認為，病蝦中主要是γ-變形菌綱。分析原因認為，本研究材料為淡水小龍蝦，而郁維娜等的研究對象為淡水凡納濱對蝦，凡納濱對蝦樣品采自寧波市瞻岐椿霖對蝦養殖場（29.53°N，121.5°E），另外養殖地區和養殖習慣與本研究中的也不盡相同。

施用抗菌藥物是水產養殖中治療細菌性疾病使用最多亦是最有效的方法，由于養殖戶缺乏流行病的診斷和防治技術，導致抗菌藥物種類使用不當，抗菌物質濫用等現象較為普遍，造成了水產養殖環境中病原菌產生多重耐藥性，無法做到有針對性的科學用藥。另外，藥物會在水產動物體內發生殘留影響人類的健康，破壞生態的平衡以及影響小龍蝦的健康養殖[23]。而許多中草藥中含有豐富的生物堿、皂莢、多糖、蒽醌類等免疫調節物質，可以強化機體能力抵御病原體[24]。它們不僅具有天然、無毒副、無殘留等特點，還能補充機體營養，提高機體免疫力[25-26]，起到抗菌、抗病的作用，達到藥物性和營養性的兼并效果[27]，因此用中草藥來治療細菌性疾病逐漸受到人們的重視，同時也鼓勵采用抗生素中草藥聯合來抑制病原細菌的發生[28-29]。本試驗結果表明，該菌對黃芩、苦參、艾葉等中草藥比較敏感。另外，該菌對不同種類的抗菌藥物耐受性不同，該菌對喹諾酮類抗生素中的諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星高度敏感，對氨基糖苷類抗生素的卡那霉素比較敏感，對氯霉素類抗生素中的氯霉素有一定程度的抑制作用。

本試驗雖找到了病害發生的主要微生物根源，篩選出了幾種能有效防治該病原菌的抗生素和中草藥種類，可為病原菌的診斷及其防治提供一定幫助。但針對所選抗生素和中草藥聯合防治還未開展研究。另外，關于蜂房哈夫尼菌對克氏原螯蝦致病性相關的報道甚少，因此對于該病原菌的致病機制以及有效防治手段還需進一步研究闡明。

參考文獻：

[1]江紅霞，劉慧芬，馬 曉，等. 轉錄組測序篩選克氏原螯蝦卵巢發育、免疫和生長相關基因[J]. 水產學報，2021，45（3）：396-414.

[2]董 靖，張露珊，劉紹春，等. 1株克氏原螯蝦肺炎克雷伯菌的分離鑒定及藥物敏感性分析[J]. 華中農業大學學報，2021，40（1）：93-98.

[3]吳紅英.? 稻蝦綜合種養技術要點及病害防治[J]. 水產養殖，2020，41（11）：64-65.

[4]周冬仁，章文敏，李建應，等. 克氏原螯蝦細菌性病原的分離與鑒定[J]. 中國農學通報，2011，27（26）：102-105.

[5]Dong X，Li Z，Wang X，et al. Characteristics of Vibrio parahaemolyticus isolates obtained from crayfish （Procambarus clarkii） in freshwater[J]. International Journal of Food Microbiology，2016，238：132-138.

[6]馬小榮，薛 暉，唐建清，等. 克氏原螯蝦致病性嗜水氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 水產養殖，2012，33（8）：45-47.

[7]王 文. 蝦蟹新型病原螺原體的發現和研究[J]. 南京師大學報（自然科學版），2016，39（1）：1-13.

[8]Du H H，Fu L L，Xu Y X，et al. Improvement in a simple method for isolating white spot syndrome virus （WSSV） from the crayfish Procambarus clarkii[J]. Aquaculture，2007，262（2/3/4）：532-534.

[9]董 靖，劉永濤，胥 寧，等. 1株克氏原螯蝦摩氏摩根菌的分離鑒定及聯合藥敏試驗[J]. 華中農業大學學報，2021，40（1）：99-104.

[10]葉建勇，唐金玉，丁辰龍，等. 基于高通量測序的克氏原螯蝦腸道及其養殖環境菌群結構分析[J]. 青島農業大學學報（自然科學版），2020，37（2）：129-134.

[11]張立強，李 媛，鄧 平，等. 健康和患病克氏原螯蝦腸道微生物群落結構和多樣性分析[J]. 水產科技情報，2020，47（1）：37-40.

[12]胡 騫. 克氏原螯蝦源維氏氣單胞菌的鑒定、致病性研究及抗菌中草藥篩選[D]. 武漢：華中農業大學，2020：42-43.

[13]江 楓. 群體感應抑制劑對蜂房哈夫尼菌生物膜形成的影響[D]. 大連：大連工業大學，2017：26-27.

[14]Liu F，Qu Y K，Geng C，et al. Effects of hesperidin on the growth performance，antioxidant capacity，immune responses and disease resistance of red swamp crayfish （Procambarus clarkii）[J]. Fish & Shellfish Immunology，2020，99：154-166.

[15]Wu Z B，Zhang Q Q，Zhang T L，et al. Association of the microbiota dysbiosis in the hepatopancreas of farmed crayfish （Procambarus clarkii） with disease outbreaks[J]. Aquaculture，2021，536：736492.

[16]Yuan G L，Zhu L，Jiang X Y，et al. Diagnosis of co-infection with white spot syndrome virus and Aeromonas veronii in red swamp crayfish Procambarus clarkii[J]. Aquaculture，2021，532：736010.

[17]邱吉宇. 中蜂蜂房哈夫尼菌病的診斷與中西藥防治[D]. 貴陽：貴州大學，2018：12-13.

[18]王 霞. 蜂房哈夫尼菌引起化膿性腦膜炎病例報告[J]. 實用醫技雜志，2002（12）：920.

[19]趙淑芳，曹盧園，唐子晴，等. 棘胸蛙新型病菌蜂房哈夫尼菌的分離、鑒定與藥敏試驗[J]. 麗水學院學報，2019，41（5）：29-33.

[20]閆艷新，鄒 玲，劉文華，等. 一例水貂感染蜂房哈夫尼菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 經濟動物學報，2015，19（2）：74-76，79.

[21]袁 瑞. 中國大鯢主要病原菌的鑒定及皮膚分泌液抗菌活性成份的分離[D]. 楊凌：西北農林科技大學，2014：28-29.

[22]郁維娜，戴文芳，陶 震，等. 健康與患病凡納濱對蝦腸道菌群結構及功能差異研究[J]. 水產學報，2018，42（3）：399-409.

[23]吳亞鋒，王楠楠，王晶晶，等. 2017年和2018年江蘇省水生動物氣單胞菌分離鑒定及耐藥分析[J]. 江蘇農業科學，2020，48（24）：156-162.

[24]孟 愔，胡 騫，金玉立，等. 復方中草藥制劑對克氏原螯蝦生長、免疫功能及肝胰腺組織的影響[J]. 中國飼料，2019（21）：60-65.

[25]劉云寧，李小鳳，班旭霞，等. 中藥抗菌成分及其抗菌機制的研究進展[J]. 環球中醫藥，2015，8（8）：1012-1017.

[26]朱 淼，夏艷潔，李虹曄，等. 魚用中草藥飼料添加劑主要有效成分及其作用機制的研究進展[J]. 中國畜牧雜志，2020，56（2）：39-43.

[27]王洪彬，李永慧，朱利霞，等. 24味中草藥對舌鰨源嗜水氣單胞菌的體外抑菌效果[J]. 水產學雜志，2018，31（1）：21-24.

[28]郝晨光，冼健安，李軍濤，等. 中草藥飼料添加劑在克氏原螯蝦養殖中的應用[J]. 飼料研究，2021，44（2）：122-124.

[29]巫愛軍，趙 楠，李 浩，等. 一種中草藥配合飼料對小龍蝦的防病效果[J]. 水產養殖，2020，41（12）：66-69.