抗菌型苯丙氨酸基聚酯脲靜電紡復合納米纖維敷料的制備及性能

2022-05-13 01:36:32李夢娜王學利李發學吳德群

東華大學學報(自然科學版) 2022年2期

李夢娜，王學利，李發學,，吳德群,

(東華大學 a.紡織學院，b.紡織科技創新中心，上海 201620)

隨著糖尿病、癌癥等疾病發病率的逐年上升，皮膚傷口敷料已經成為創面護理的重要組成部分[1]。靜電紡納米纖維膜具有與細胞外基質相似的結構，能夠促進創面處細胞之間的相互作用，是一種理想的傷口敷料[2-3]，其具有比表面積大、柔韌性強、孔隙率高等優點，可以作為藥物的載體向傷口遞送藥物，在開發功能性敷料方面具有很大的潛力[4]。目前，抗菌型靜電紡納米纖維敷料引起了人們的關注。

姜黃素(curcumin，Cur)是一種天然的抗菌劑，已被廣泛用于多種類型傷口的愈合[5-6]。將Cur載入靜電紡納米纖維敷料中，并控制其局部釋放，可以改善Cur溶解度差、體內穩定性低等缺點[7]。聚己內酯(polycaprolactone，PCL)是靜電紡納米纖維膜中最常用的可生物降解聚合物，但是在使用負載Cur的PCL靜電紡納米纖維膜過程中發現，這種靜電紡納米纖維膜的力學性能差、結構穩定性低[8-9]。

苯丙氨酸基聚酯脲(phenylalanine-based poly(ester urea)s，PBP)的分子結構中含有大量的脲基，分子鏈和分子間存在大量的氫鍵能夠為聚合物提供優異的力學性能、熱穩定性和耐化學腐蝕性[10]。此外，PBP還能夠滿足各種傷口修復的需求，其應用范圍主要為藥物輸送、骨肌腱修復、血管組織再生等[11]。

將PBP和PCL結合在一起制備靜電紡復合納米纖維膜，以增強PCL靜電紡納米纖維膜的力學性能，提高其細胞相容性。在靜電紡絲液中加入的Cur賦予了靜電紡納米纖維良好的抗菌性能。因此負載Cur的PBP靜電紡復合納米纖維膜有望應用于感染性傷口的修復。

1 試驗部分

1.1 試驗原料與儀器

試驗原料：1,4-丁二醇、1,4-丁二胺(BDA)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、六氟異丙醇(HFIP)、甲苯、乙酸乙酯，均為化學純，國藥化學試劑有限公司；對甲苯磺酸一水合物(TsOH·H2O)、L-苯丙氨酸(Phe)、辛酸亞錫(Sn(Oct)2)、三乙胺(TEA)、六亞甲基二異氰酸酯(HDI)，均為分析純，阿拉丁試劑有限公司；PCL(分子量約80 000 g/mol)，濟南岱鋼有限公司；Cur，化學純，上海凌峰化學試劑有限公司。

試驗儀器：ME104 T/02型分析天平、MYP19-2型磁力攪拌器，上海梅穎浦儀器公司；LSP02-2B型靜電紡絲機，保定蘭格有限公司；SN210C型壓力蒸汽滅菌器，上海爾迪有限公司；BPN-80CH型二氧化碳細胞培養箱，上海一恒有限公司；Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)、Avance 400型核磁共振波譜儀(NMR)，瑞士Bruker公司；JSM-5600LV型掃描電子顯微鏡(SEM)，日本JEOL公司。

1.2 PBP的制備與表征

1.2.1 PB的制備

參照文獻[12]合成二胺二苯丙氨酸單體(PB)，合成路線如圖1所示。將9.1 g的1,4-丁二醇、35.0 g的Phe以及44.4 g的TsOH·H2O裝入含有650 mL甲苯的兩口燒瓶中。將燒瓶固定在單層玻璃反應釜中，待燒瓶中混合物在反應溫度為120 ℃時進行回流攪拌，持續反應16 h。反應停止后，待混合物溶液冷卻至室溫，過濾出溶液中的白色沉淀物。將沉淀物在500 mL的沸水中溶解，形成的溶液于室溫下靜置12 h。過濾出下層析出的固體，將其置于50 ℃的真空烘箱中干燥8 h，最終形成PB。

圖1 PB的合成路線Fig.1 Synthetic route of PB

1.2.2 PBP的制備

利用PB、BDA和HDI反應制備PBP，合成路線如圖2所示。將5.8 g的PB加入裝有20 mL經減壓蒸餾除水的NMP的燒瓶中，將燒瓶固定在油浴鍋中，在溫度60 ℃下攪拌，使PB充分溶解。待PB溶液澄清后，再加入2.0 g除水的TEA，攪拌反應30 min。待油浴鍋溫度升高到70 ℃后，向燒瓶中加入Sn(Oct)2(質量分數為0.2%)作為催化劑。過一段時間后，使用恒壓分液漏斗將1.7 g的HDI(溶于5 mL NMP)逐滴滴加到含催化劑的PB溶液中進行預聚合反應，形成PBP的預聚物溶液。待聚合反應2 h后，將油浴鍋溫度升高至75 ℃，再向預聚物溶液里加入0.7 g的BDA(溶于5 mL NMP)繼續反應6 h，得到含PBP的黃色溶液，然后使該溶液在冷的乙酸乙酯中沉淀出產物PBP混合物，并在4 ℃冰箱里靜置過夜。最后過濾出PBP，將其置于50 ℃的真空烘箱中干燥8 h。

圖2 PBP的合成路線Fig.2 Synthetic route of PBP

1.2.3 PB和PBP的表征

PB和PBP的化學結構通過核磁共振氫譜(1H NMR)、傅里葉變換紅外光譜(FTIR)進行表征：NMR測試中，將5 mg的PB和PBP樣品分別溶解在1 mL的氘代二甲基亞砜(DMSO-d6)中，進行氫譜掃描；FTIR譜測試中，樣品掃描的波長范圍為500～4 000 cm。

1.3 靜電紡納米纖維膜的制備與表征

1.3.1 靜電紡納米纖維膜的制備

先用磁力攪拌器將PBP和PCL(質量比為2∶1)溶解在HFIP中形成質量分數為15%的混合溶液。再向混合溶液中加入質量分數為10%的Cur，將混合物在室溫下攪拌以獲得均勻的紡絲液。將制備的紡絲液轉移到裝配有23 G金屬針頭體積為20 mL的注射器里進行靜電紡絲,制備PBP/PCL/Cur納米纖維膜。紡絲溫度為25 ℃、相對濕度為45%，紡絲電壓為15 kV，接收距離為15 cm，流速為1 mL/h。制備好的PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜在真空干燥箱內干燥8 h除去殘留的溶劑。采用同樣的方法，制備了PCL和沒有添加Cur的PBP/PCL靜電紡納米纖維膜。

1.3.2 靜電紡納米纖維膜的表征

利用FTIR對PCL、PBP/PCL、PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜上的官能團進行表征，采用SEM對其外觀形貌進行表征。從每張SEM圖片中隨機選取100根纖維，用ImageJ軟件測量靜電紡納米纖維膜中纖維的平均直徑。

1.3.3 靜電紡納米纖維膜的力學性能的測定

采用萬能材料試驗機測試靜電紡納米纖維膜的力學性能。將 PCL、PBP/PCL、PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜裁剪成矩形條(50 mm×10 mm)，然后將這些矩形條的兩端分別固定于萬能材料試驗機的兩個夾頭上，夾頭的拉伸速度設置為 5 mm/min，啟動儀器以拉伸纖維膜直至斷裂，重復3次測試，求平均值。

1.3.4 Cur的釋放性能測定

將直徑為8 mm的PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜放入離心管中，向離心管中加入5 mL磷酸緩沖鹽(PBS)溶液(0.01 mol/L，pH=7.4)，將離心管放入恒溫振蕩水浴鍋中。每隔1 h，從離心管中取出100 μL PBS溶液，使用紫外分光光度計在波長為535 nm處測量溶液的光密度。借助Cur的標準圖表，根據光密度值計算從PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜中釋放出的Cur量[13]。

1.3.5 PBP/PCL和PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜的抗菌性能表征

通過數菌落法和平板擴散法來表征PBP/PCL和PBP/PCL/Cur兩種靜電紡納米纖維膜的抗菌性能。首先，將大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌分別放在含有肉湯的玻璃瓶中，將玻璃瓶在空氣搖床中培養24 h。利用平板擴散法進行計數測試，取出1 mL細菌懸浮液(濃度1×106CFU/mL)均勻涂抹在10 mL凝固的瓊脂上面。其次，將直徑為8 mm的PBP/PCL和PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜輕輕黏附在瓊脂板的中間，置于細菌生化培養箱中培養24 h。最后，拍照記錄靜電紡納米纖維膜的抑菌圈。靜電紡納米纖維膜的抑菌圈直徑的計算如式(1)所示。

(1)

式中：D為抑制區的直徑，mm；d為靜電紡納米纖維膜的直徑，mm。

平板計數法測試中，分別將15 mg的PBP/PCL、PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜放在5 mL含細菌(金黃色葡萄球菌或大腸埃希菌)的PBS溶液中，在37℃的空氣搖床中培養12 h。取1 mL的細菌懸浮液涂抹在10 mL凝固的營養瓊脂上，再次培養24 h。取未經靜電紡納米纖維膜處理的瓊脂板作為對照組。計算出每組樣品中細菌的菌落數，靜電紡納米纖維膜的抑菌率計算如式(2)所示。

(2)

式中：A為對照組中細菌的菌落數；B為試驗組中細菌的菌落數。

1.3.6 PBP/PCL和PBP/PCL/Cur 靜電紡納米纖維膜的細胞相容性的表征

采用MTS法和細胞活死染色分析法來評估PBP/PCL和PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜對L929成纖維細胞的毒性。將兩種靜電紡納米纖維膜剪切成直徑為8 mm的圓形，分別放在24孔的孔板里。PBP/PCL 和PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜用PBS溶液沖洗3次后，依次在體積分數為75%的乙醇、高糖培養基浸泡30 min。將1 mL 培養基(含3×104個細胞)加入到每個孔中，在細胞培養箱中培養(溫度為37 ℃，CO2體積分數為5%)，培養基每隔24 h更換一次。

根據文獻[14]進行MTS測試，細胞在培養24、48、72 h后，棄去孔板中的培養基，向孔板中加入500 μL MTS工作液或培養基。再次培養4 h后，從每組樣品中取出150 μL液體，用酶標儀測定各孔在490 nm處的吸光度(C試驗)。其中只含培養基不含細胞組作為空白組的吸光度(C空白)，不含靜電紡納米纖維膜只含細胞組作為對照組的吸光度(C對照)。靜電紡納米纖維膜上細胞存活率的計算如式(3)所示。

(3)

細胞活死染色測試中，用PI和Calcein-AM染料對靜電紡納米纖維膜上的細胞進行染色，用激光掃描共聚焦顯微鏡采集細胞熒光圖片。

2 結果與討論

2.1 PB和PBP的表征

圖3 PB和PBP的核磁圖譜和紅外光譜圖Fig.3 1H NMR and FTIR spectra of PB and PBP

2.2 不同靜電紡納米纖維膜的表征

圖4 反應物和不同靜電紡納米纖維膜的紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectra of reactants and different electrospun nanofiber mats

不同靜電紡納米纖維膜的形貌圖以及纖維的直徑分布圖如圖5所示。由圖5可知，PCL、PBP/PCL、PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜的表面均光滑且平整，纖維隨機排列構成多孔的三維結構，并未見到明顯的纖維團聚現象。從PCL、PBP/PCL、PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜的纖維直徑分布圖可以看出，其直徑均是正態分布。PCL靜電紡納米纖維膜中纖維的平均直徑為(434±95)nm，PBP/PCL靜電紡納米纖維膜中纖維的直徑比PCL靜電紡納米纖維膜略有縮小，其平均直徑為(375±159)nm。PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜中纖維的直徑與PBP/PCL靜電紡納米纖維膜中纖維的直徑相比略微增加，其平均直徑為(407±168)nm。

圖5 不同靜電紡納米纖維膜的SEM圖和纖維直徑分布Fig.5 SEM images and diameter distribution of different electrospun nanofiber mats

2.3 不同靜電紡納米纖維膜的力學性能的測定

不同靜電紡納米纖維膜的應力-應變曲線如圖6所示。由圖6可知，PCL靜電紡納米纖維膜的拉伸斷裂強度為(1.15±0.23)MPa，斷裂伸長率為(79.81±3.40)%，PBP/PCL靜電紡納米纖維膜的拉伸斷裂強度為(2.14±0.36)MPa，斷裂伸長率為(108.34±5.10)%。由于PBP中含有大量的脲鍵和氫鍵，具有很好的穩定性，因此PBP和PCL混紡后制備的靜電紡納米纖維膜的力學性能顯著提高。PBP/PCL靜電紡納米纖維膜在負載Cur后力學性能并未受到影響，斷裂強度和斷裂伸長率稍微增加。PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜的拉伸斷裂強度為(2.37±0.18)MPa，斷裂伸長率為(117.45±4.50)%。

圖6 不同靜電紡納米纖維膜的應力-應變曲線Fig.6 The stress-strain curves of different electrospun nanofiber mats

2.4 Cur的釋放性能測定

PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜利用Cur來達到抗菌目的，因此測試了PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜釋放Cur的性能。PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜的Cur釋放曲線如圖7所示。由圖7可知，PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜可以在72 h內持續穩定地釋放Cur。文獻[19]研究表明，含有Cur的PCL靜電紡納米纖維膜的Cur釋放曲線在初始階段會顯示出爆發釋放的趨勢。相比而言，PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜卻不會出現這一情況，其在初始的12 h內可以快速并且平穩地釋放Cur，Cur的累計釋放率達到49.9%，在隨后的60 h內仍可以穩定地釋放Cur。文獻[20]制備的負載Cur的PCL/殼聚糖靜電紡納米纖維膜在16 d內Cur的累計釋放率為75%，而PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜的Cur釋放率更高，在72 h內Cur的累計釋放率可達85.1%。這一高效釋放Cur的特征能夠以極大限度發揮抗菌功效，更有利于感染性傷口的愈合。

圖7 Cur的釋放曲線圖Fig.7 The release curve of Cur

2.5 不同靜電紡納米纖維膜的抗菌性能

由于PCL靜電紡納米纖維膜沒有抗菌性能[19]，因此測試PBP/PCL和PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜的抗菌性能，其結果如圖8所示。由圖8可知，經PBP/PCL靜電紡納米纖維膜處理的瓊脂板表面附著大量細菌，而經PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜處理的瓊脂表面細菌明顯減少。通過式(2)計算，PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑制率分別為(93.3±1.3)%、(94.5±2.1)%。平板擴散法的測試結果顯示：在PBP/PCL靜電紡納米纖維膜處理的金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的瓊脂板上均未觀察到抑菌圈；PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜處理的金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的瓊脂板上形成了清晰的抑菌圈，其中含大腸埃希菌的瓊脂板上的抑菌圈為(3.5±0.3)mm，含金黃色葡萄球菌的瓊脂板上的抑菌圈直徑為(5.6±0.4)mm。試驗結果與文獻[21]研究結果一致,由此表明，Cur可以破壞細菌的細胞膜來抑制細菌的生長。因此PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜具有良好的抗菌性能。

圖8 PBP/PCL與PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜的抗菌性能Fig.8 The antibacterial activity of PBP/PCL and PBP/PCL/Cur electrospun nanofiber mats

2.6 不同靜電紡納米纖維膜的細胞相容性

L929成纖維細胞在PBP/PCL與PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜上培養72 h的細胞存活率如圖9所示。由圖9(a)可知，細胞在兩種靜電紡納米纖維膜上的存活率均高于85%。由圖9(b)可知，細胞活/死熒光圖(綠色代表活細胞，紅色代表死細胞)中僅有少數死亡的細胞，大部分的細胞都存活下來。這表明PBP/PCL和PBP/PCL/Cur靜電紡納米纖維膜具有很好的細胞相容性，并且釋放出的Cur對細胞無毒。