T3 對甲狀腺乳頭狀癌細胞TPC-1 增殖的影響及機制研究

程雅楠 王 巖 孫榮欣 郎佳楠 曹 斌 楊龍艷 趙 冬

首都醫科大學附屬北京潞河醫院內分泌代謝與免疫性疾病中心，北京 101149

甲狀腺癌是世界范圍內和我國最常見的內分泌系統惡性腫瘤[1]。甲狀腺乳頭狀癌（papillary carcinoma of thyroid，PTC）更是占我國甲狀腺癌的99%以上[2]。其特點是易轉移，且復發率高達25%[3-4]。三碘甲腺原氨 酸（triiodothyronine，T3）作為甲狀腺激素（thyroid hormone，TH）的主要活性成分，能通過與TH 核受體形成復合物介導自身的生物活性，發揮重要的生理功能[5-6]。近年來研究發現，T3能促進人前列腺癌[7]、肺癌[8]、乳腺癌[9]細胞的增殖，增加腫瘤治療難度。然而目前，T3對PTC 細胞增殖的影響及其確切機制仍不清楚。有研究發現，TH 受體可以調節PDZK1 的表達[10]。PDZK1 能通過受體蛋白調控腫瘤細胞的增殖[11]。因此本課題組推測T3可能通過調節PDZK1 表達而調控PTC 細胞的增殖，本研究將對此科學問題進行探討論證，并期望為PTC 的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人甲狀腺乳頭狀癌細胞系TPC-1 購自國家生物醫學實驗細胞資源庫；RPMI-1640 培養基購自Gibco（貨號：C11875500BT）；胎牛血清購自Excell Bio（貨號：FND500）；活性炭處理過的胎牛血清購自HyClone（貨號：SH30068.03）；辣根酶標記的羊抗鼠免疫球蛋白（貨號：ZB-2305）、辣根酶標記的羊抗兔免疫球蛋白（貨號：ZB-2301）和anti-GAPDH 抗體（貨號：TA-08）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；anti-PDZK1 抗體（貨號：ab121248）購自Abcam；PDZK1 過表達慢病毒（滴度：2×108TU/ml，貨號：30038-J1）、陰性對照慢病毒（滴度：2×108TU/ml，貨號：CON335）和HitransG P（25×感染增強液，貨號：#REVG005）均購自上海吉凱基因；PDZK1 shRNA（h）慢病毒顆粒（貨號：sc-106840-V）和shRNA 慢病毒顆粒對照-A（貨號：sc-108080）購自Santa Cruz Biotechnology；T3（3，3，5-Triiodo-L-thyronine）（貨號：S5726）購自Sigma；2×Laemmli Sample Buffer（貨號：1610737）購自BIO RAD。

1.2 TPC-1 細胞培養和轉染

在含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI 1640完全培養基中培養TPC-1 細胞。將生長良好的處于對數生長期的TPC-1 細胞接種于6 孔板，待細胞密度約60%時進行后續實驗。

T3處理細胞：配置含不同濃度T3的細胞培養基：用含5%的活性炭處理過的胎牛血清的RPMI 1640 培養基稀釋T3儲液，使T3終濃度分別為0、12.5、50 ng/ml。對照組（0 ng/ml T3處理組）、12.5 和50 ng/ml T3處理組的培養基換成相應T3濃度的培養基（每組3 個復孔），在37℃，5%CO2恒溫細胞培養箱中培養48 h 后，PBS溶液洗滌細胞3 遍，用含β-巰基乙醇的2×Laemmli Sample Buffer 提取總蛋白，95℃金屬浴10 min 煮樣。

細胞轉染：共分為四組，敲減PDZK1（shPDZK1）組、敲減對照（shNC）組、過表達PDZK1（PDZK1）組、過表達對照（Vector）組。棄培養基，RPMI-1640 雙無培養基洗滌細胞1 遍。配制病毒轉染混合液：A 液為40 μl 感染增強液（25X）用RPMI-1640 雙無培養基稀釋成1 ml。B 液為40 μl PDZK1 shRNA（h）慢病毒顆粒（或shRNA 慢病毒顆粒對照-A，或PDZK1 過表達慢病毒，或陰性對照慢病毒）。A 液和B 液混合后即為轉染混合液，將上述轉染混合液按分組加入6 孔板內，放入培養箱24 h 后換成RPMI-1640 完全培養基。48 h 后傳代至10 cm 培養皿培養。待細胞密度為80%～90%時，將PDZK1 過表達慢病毒及陰性對照慢病毒感染的TPC-1 細胞利用流式細胞分選儀（購自美國BD 公司，型號：FACScantoll）分選出帶有綠色熒光蛋白標簽的細胞，用RPMI-1640 完全培養基繼續培養。

1.3 實時無標記細胞功能分析技術（real-time unlabeled cell function analysis technique，RTCA）和克隆形成實驗檢測細胞的增殖

RTCA 實驗：TPC-1 細胞以2000 個/孔接種于E-plate 16 孔板中，貼壁后對照組（0 ng/ml T3處理組）、12.5 和50 ng/ml T3處理組培養基換成相應T3濃度的培養基（每組3 個復孔），實時無標記細胞分析儀（購自艾森生物科學公司，型號：xGElligene rtca）記錄細胞指數（細胞指數可實時反映細胞的生長增殖情況）。將更換為相應T3濃度細胞培養基的時刻計為0 點，共持續記錄28 h。

克隆形成實驗：TPC-1 細胞以1500 個/孔接種于6 孔板中，貼壁后對照組（0 ng/ml T3處理組）、12.5 和50 ng/ml T3處理組培養基換成相應T3濃度的培養基（每組3 個復孔）。細胞培養箱中培養10 d。組織細胞固定液固定細胞，0.1%結晶紫染色后拍照，計數克隆形成數（含有10 個細胞以上的集落為1 個克隆）。

1.4 Western blot 檢測

提取的蛋白樣品用10%SDS-PAGE 分離后轉PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h。anti-PDZK1（1∶1000）抗體、anti-GAPDH（1∶3000）抗體4℃孵育過夜，TBST洗4 次，分別用辣根酶標記的羊抗兔免疫球蛋白（1∶3000）、辣根酶標記的羊抗鼠免疫球蛋白（1∶3000）室溫孵育1 h，TBST 洗4 次，用Bio-Rad XRS 化學發光檢測系統測量信號強度。

1.5 細胞轉染效率的測定

shPDZK1 組及shNC 組細胞感染48 h 后，PDZK1組及Vector 組細胞感染48 h 分選后，均接種于6 孔板上，待細胞密度達90%時，PBS 洗滌細胞3 遍，用含β-巰基乙醇的2×Laemmli Sample Buffer 提取總蛋白，95℃金屬浴10 min 煮樣，Western blot 檢測PDZK1 的表達。

1.6 T3 對shPDZK1 組、shNC 組、PDZK1 組和Vector組細胞增殖的影響

shPDZK1 組、shNC 組、PDZK1 組 和Vector 組 細胞分別以1500 個/孔接種于6 孔板，各組內再分為3 個不同T3濃度的處理組（0、12.5、50 ng/ml），每個處理組設3 個復孔，細胞貼壁后培養基替換為相應T3濃度的培養基，細胞培養箱中培養10 d。組織細胞固定液固定細胞，0.1%結晶紫染色后拍照，計數克隆形成數。

1.7 統計學方法

選擇GraphPad Prism 8 對所得數據進行統計分析作圖，計量資料采用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組間比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 T3 對TPC-1 細胞增殖和克隆形成的影響

RTCA 實驗結果顯示，12.5 及50 ng/ml T3處理組TPC-1 的細胞指數明顯高于對照組，差異均有高度統計學意義（P ＜0.01）。克隆形成實驗顯示，12.5 及50 ng/ml T3處理組TPC-1 的克隆形成數明顯多于對照組，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。12.5 ng/ml T3處理組與50 ng/ml T3處理組細胞指數及克隆形成數比較，差異均無統計學意義（P ＞0.05）。見圖1。

2.2 T3 對TPC-1 細胞中PDZK1 表達的影響

Western blot 的結果顯示，12.5 及50 ng/ml T3處理組細胞中PDZK1 表達量明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。12.5 ng/ml T3處理組與50 ng/ml T3處理組PDZK1 蛋白表達比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見圖2。

2.3 shPDZK1 組與shNC 組中PDZK1 表達水平比較

Western blot 檢測結果顯示，與shNC 組比較，sh-PDZK1 組細胞中PDZK1 表達量明顯較低，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖3。

2.4 PDZK1 組與Vector 組中PDZK1 表達水平比較

Western blot 檢測結果顯示，與Vector 組比較，PDZK1 組細胞PDZK1 的表達量明顯升高，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。見圖4。

2.5 T3 對shPDZK1 組及shNC 組細胞增殖的影響

在0、12.5、50 ng/ml T3處理下，與shNC 組比較，shPDZK1 組細胞的克隆形成數均明顯減少，差異均有統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖5。

2.6 T3 對PDZK1 組及Vector 組細胞增殖的影響

在0、12.5、50 ng/ml T3處理下，與Vector 組比較，PDZK1 組細胞的克隆形成數均明顯增加，差異均有統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖6。

3 討論

甲狀腺癌根據組織學類型分為乳頭狀癌、濾泡狀癌、未分化癌和髓樣癌，以濾泡上皮細胞起源的PTC最常見[12-13]。最近一項數據庫分析顯示，PTC 發病率在過去幾十年里一直穩步上升[2]，雖然短期預后良好[14]，但是易轉移[3]且復發率高[4]仍是導致其死亡率升高的原因[15]。因此尋找能夠防治PTC 的有效靶點，將對提高PTC 患者的生活質量和生存率有重要意義。

TH 是甲狀腺濾泡上皮細胞分泌的重要調節因子，能調節機體的發育、代謝及細胞的增殖、凋亡和分化[5,16-17]，其中T3是主要發揮作用的TH，能與TH 核受體形成復合物[5]來發揮生理功能[6]，對腫瘤的增殖過程也產生重要影響[7-8]。在本研究中，利用不同濃度的T3處理PTC 細胞系TPC-1 細胞，發現T3促進TPC-1 細胞的增殖和克隆形成，這與之前的研究結果相類似[18-19]。

T3能作用于TH 受體發揮功能[5]，TH 受體可以調節PDZK1 的表達[10]。由此本課題組猜測T3可能通過PDZK1 調節PTC 的增殖。PDZK1 作為一種支架蛋白[20]，存在于甲狀腺組織在內的多種組織，根據組織的特異性[21-26]在癌癥過程中起雙重作用。在本研究中，采用不同濃度的T3處理PTC 細胞系TPC-1，Western blot 結果顯示T3能夠促進TPC-1 中PDZK1 的表達。TPC-1成功敲減PDZK1（或過表達PDZK1）后，克隆形成實驗結果顯示，與shNC 組比較，shPDZK1 組TPC-1 的克隆形成能力減弱，與Vector 組比較，PDZK1 組TPC-1的克隆形成能力增強，提示敲減PDZK1 抑制TPC-1的克隆形成；而過表達PDZK1 促進TPC-1 的克隆形成，提示PDZK1 在TPC-1 中有促克隆形成的作用。同時本研究發現，經12.5 及50 ng/ml T3處理后，shPDZK1組細胞的克隆形成能力較shNC 組明顯減弱，PDZK1組細胞的克隆形成能力較Vector 組明顯增強，提示敲減PDZK1 后，T3對細胞克隆形成的促進作用明顯減弱，而過表達PDZK1 后，T3對細胞克隆形成的促進作用明顯增強，提示T3可能通過上調PDZK1 的表達促進TPC-1 細胞的增殖和克隆形成。

綜上所述，T3可能通過調節PDZK1的表達影響PTC 細胞系TPC-1 的增殖，為PTC 防治提供理論依據。