基于數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討中藥復(fù)方治療特發(fā)性肺纖維化的組方規(guī)律和潛在機(jī)制

李雅馨 丁露 楊映映 萬潤之 宋思雨 趙佳超 李香艷 王澤玉

(長春中醫(yī)藥大學(xué) 1中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，吉林 長春 130017；2人參科學(xué)研究院；3北京中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院；長春中醫(yī)藥大學(xué) 4醫(yī)藥信息學(xué)院；5科研處)

特發(fā)性肺纖維化(IPF)是一種難治性、進(jìn)展性肺間質(zhì)疾病，肺移植是目前唯一可以改變IPF患者臨床結(jié)局的治療手段。IPF患者在臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難和肺功能進(jìn)行性惡化，預(yù)后差，中位生存期僅2～3年〔1〕。截至目前，IPF的發(fā)病原因和發(fā)病機(jī)制尚未有統(tǒng)一定論，普遍認(rèn)為其是多種因素共同作用的結(jié)果。吡非尼酮和尼達(dá)尼布是目前用于治療IPF的兩種藥物，但其療效不穩(wěn)定，且有致嘔、致皮疹等多種不良反應(yīng)〔2〕。另外，肺纖維化亦是慢性阻塞性肺病、病毒性肺炎等多種呼吸系統(tǒng)疾病進(jìn)展過程中的常見病理現(xiàn)象和結(jié)局〔3〕。新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)作為一種病毒性肺炎，其已經(jīng)成為一種波及全球的重大傳染病。諸多臨床研究表明，部分COVID-19恢復(fù)期患者的胸部CT結(jié)果顯示有肺纖維化征象，尤其是重癥患者〔4，5〕；針對COVID-19死亡患者的病理研究亦表明，在COVID-19死亡患者的肺組織中有明顯的肺纖維化征象〔6〕。中醫(yī)多將IPF歸于“肺痿”和“肺痹”范疇論治，并在辨治IPF方面具有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)和良好的臨床療效。但中醫(yī)對IPF的理法方藥認(rèn)知既有共性特征，亦有個性差異。通過對大量中藥復(fù)方的匯總分析，來挖掘中醫(yī)治療IPF的共性理論認(rèn)知和處方用藥，是探究中醫(yī)治療IPF臨證規(guī)律的重要手段。本文擬基于數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討中藥復(fù)方治療IPF的組方規(guī)律和潛在機(jī)制。

1 資料與方法

1.1研究資料 研究資料來源于中國知網(wǎng)、維普、萬方數(shù)據(jù)庫，以“特發(fā)性肺纖維化”為主題進(jìn)行檢索，納入了2010～2021年發(fā)表的學(xué)術(shù)期刊、學(xué)位論文等文獻(xiàn)，從中整理出中醫(yī)治療IPF的相關(guān)方劑及其藥物組成，最后篩選出209個中藥復(fù)方，涉及256味中藥。

1.2數(shù)據(jù)規(guī)范 根據(jù)2020版《中華人民共和國藥典》〔7〕和《中藥學(xué)》〔8〕教材，對209個方劑中出現(xiàn)的中藥進(jìn)行規(guī)范化處理：(1)將藥物的別名或俗稱統(tǒng)一規(guī)范為標(biāo)準(zhǔn)名。(2)對于炮制后藥物功效與原藥功效相似者將其規(guī)范為標(biāo)準(zhǔn)名。采用雙人雙錄入的方法將標(biāo)準(zhǔn)化處理的數(shù)據(jù)錄入Excel表中，建立基本信息數(shù)據(jù)庫，再由雙人對數(shù)據(jù)進(jìn)行審核。

1.3數(shù)據(jù)分析 基于Excel對209個處方中出現(xiàn)的藥物進(jìn)行頻次統(tǒng)計(jì)，剔除頻次為1的藥物。依據(jù)中國中醫(yī)出版社出版的第10版《中藥學(xué)》〔8〕教材，補(bǔ)充完善各味中藥對應(yīng)的功效、藥性、藥味、歸經(jīng)，利用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，挖掘出中藥復(fù)方治療IPF的核心藥物。

1.4網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析〔9〕①有效成分篩選：從中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP)數(shù)據(jù)庫(按照口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18的條件篩選)和中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(TCMID)數(shù)據(jù)庫中篩選出核心藥物的有效成分。②有效成分潛在治療靶點(diǎn)篩選：從PubChem數(shù)據(jù)庫中查到各成分對應(yīng)的簡化分子線性輸入規(guī)范(SMILES)和二維結(jié)構(gòu)式(SDF格式)。基于此，將二維結(jié)構(gòu)式上傳至Pharm Mapper網(wǎng)站、將SMILES上傳至Swiss Target網(wǎng)站，獲取各成分的潛在治療靶點(diǎn)。Pharm Mapper獲取的結(jié)果按照Fit Score≥3.5進(jìn)行篩選，Swiss target獲取的結(jié)果按照Probability≥0.1進(jìn)行篩選。然后，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫獲取每個靶點(diǎn)對應(yīng)的Uniprot ID，據(jù)此進(jìn)行去重。③疾病靶點(diǎn)篩選：從Gene cards數(shù)據(jù)庫中篩選IPF對應(yīng)的靶點(diǎn)，結(jié)合藥物治療靶點(diǎn)的數(shù)量依據(jù)Relevance score進(jìn)行篩選。④PPI分析：篩選疾病和藥物的交集靶點(diǎn)，并將交集靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫得到這些交集靶點(diǎn)的PPI關(guān)系，并通過Cytoscape軟件進(jìn)行可視化呈現(xiàn)和拓?fù)浞治觥＂莨δ芨患治觯簩⒔患悬c(diǎn)上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能富集分析〔生物學(xué)過程(BP)、分子功能(MF)和細(xì)胞組分(CC)〕和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(KEEG)通路分析。

2 結(jié) 果

2.1高頻藥物 209首治療IPF的方劑中共計(jì)出現(xiàn)256味中藥，剔除頻次為1的藥物后剩余209味，并對這209味中藥的使用頻次進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。其中，使用頻次前十的藥物依次為黃芪(193次，92.34%)、甘草(111次，53.11%)、丹參(103次，49.28%)、麥冬(99次，47.37%)、當(dāng)歸(95次，45.45%)、地龍(94次，44.98%)、川芎(89次，42.58%)、黨參(76次，36.36%)、桃仁(75次，35.89%)、半夏(71次，33.97%)；其次為浙貝母66次(31.58%)、茯苓65次(31.10%)、五味子60次(28.71%)、北沙參58次(27.75%)、白術(shù)54次(25.84%)、陳皮53次(25.36%)、桔梗51次(24.40%)、赤芍49次(23.44%)、黃芩45次(21.53%)、水蛭44次(21.05%)。高頻藥物功效歸類排名前三的功效依次為益氣養(yǎng)陰(686次，包括黃芪、甘草、麥冬、當(dāng)歸、黨參、北沙參、白術(shù))、活血通絡(luò)(405次，包括丹參、川芎、地龍、桃仁、水蛭)、化痰散結(jié)(188次，包括半夏、浙貝母、桔梗)，其次為清熱藥(94次，包括赤芍、黃芩)、利水滲濕藥(65次，茯苓)、收澀藥(60次，五味子)、理氣藥(53次，陳皮)。

2.2藥性統(tǒng)計(jì) 中藥的藥性包括寒、微寒、大寒、涼、溫、微溫、熱、大熱、平9種，每種藥物有且只有一種藥性。通過對這209味中藥藥性分布的統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)溫、寒、平是使用頻次較高的3種藥性，其中溫性藥物的使用頻率為24.40%(51次)，寒性為22.01%(46次)，平性為21.05%(44次)，另外，微寒性為14.35%(30次)，微濕性為8.13%(17次)，涼性為4.78%(10次)，熱性為3.35%(7次)，大寒性為0.96%(2次)，大熱性為0.96%(2次)。

2.3藥味統(tǒng)計(jì) 中藥的藥味包括酸、苦、微苦、甘、微甘、辛、微辛、咸、澀、平10種，每種藥可以有多種藥味。通過對209味中藥藥味分布的統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)甘、苦、辛為出現(xiàn)頻率最高的三種藥味，其中甘味藥共出現(xiàn)101次(29.71%)，苦味藥出現(xiàn)93次(27.35次%)，辛味藥出現(xiàn)78次(22.94%)；咸味藥19次(5.59%)，微苦味藥16次(4.71%)，酸味藥13次(3.82%)，澀味藥9次(2.65%)，淡味藥7次(2.06%)，微辛味藥3次(0.88%)，微甘味藥1次(0.29%)。

2.4歸經(jīng)統(tǒng)計(jì) 每種中藥可以有多種歸經(jīng)，通過對209味藥物歸經(jīng)分布的統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)歸肺經(jīng)藥物的使用頻次最多，占22.73%(100次)；其次為歸肝經(jīng)藥物，占22.27%(98次)；歸脾經(jīng)和腎經(jīng)藥物均占15.23%(67次)，歸胃經(jīng)62次(14.10%)，歸心經(jīng)51次(11.59%)，歸大腸經(jīng)23次(5.23%)，歸膀胱經(jīng)16次(3.64%)，歸膽經(jīng)9次(2.05%)，歸小腸經(jīng)7次(1.59%)，歸心包經(jīng)6次(1.36%)，歸三焦經(jīng)1次(0.23%)。

2.5關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 采用Rstudio對209首方藥進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，設(shè)支持度≥0.1，置信度≥0.5，關(guān)聯(lián)規(guī)則分析中，統(tǒng)計(jì)兩種藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則支持度前十，見表1，其中8組藥物中含有黃芪。利用plot函數(shù)以提升度(含有某藥的情況下含有另一味藥的概率)為標(biāo)準(zhǔn)可視化關(guān)聯(lián)規(guī)則，見圖1，明顯可見核心藥物為黃芪。

表1 209首治療特發(fā)性肺纖維化的方劑中各藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析(%)

2.6網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析 通過對209首治療IPF中藥復(fù)方的綜合分析，發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方主要通過益氣養(yǎng)陰(黃芪，甘草，麥冬)、活血通絡(luò)(丹參，地龍，川芎)、化痰散結(jié)(半夏、浙貝母、桔梗)發(fā)揮對IPF的治療作用。因此，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對核心藥組(以上分析所得之核心藥物)治療IPF的機(jī)制和靶點(diǎn)進(jìn)行探索。

2.7有效成分篩選 按照OB≥30%，DL≥0.18的篩選條件，從TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選了黃芪、甘草、丹參、川芎、半夏、浙貝母、桔梗的有效成分；從TCMID數(shù)據(jù)庫中篩選了麥冬、地龍的有效成分。最終，益氣養(yǎng)陰組共計(jì)得到有效成分158個，活血通絡(luò)組共計(jì)得到有效成分81個，化痰散結(jié)組共計(jì)得到有效成分27個。

2.8有效成分潛在治療靶點(diǎn)和IPF疾病靶點(diǎn)篩選 結(jié)合從PubChem數(shù)據(jù)庫中所獲得的各成分對應(yīng)的SMILES和二維結(jié)構(gòu)式，從Pharm Mapper網(wǎng)站和Swiss target網(wǎng)站獲取了各成分對應(yīng)的潛在治療靶點(diǎn)。依據(jù)Uniprot ID去重后益氣養(yǎng)陰組共得到374個靶點(diǎn)，活血通絡(luò)組共得到643個靶點(diǎn)，化痰散結(jié)組共得到572個靶點(diǎn)。另外，將從Gene cards數(shù)據(jù)庫中獲取了IPF對應(yīng)的疾病靶點(diǎn)，按照Relevance score≥11.63進(jìn)行篩選，共計(jì)得到644個靶點(diǎn)。

2.9病藥重疊靶點(diǎn)確定 分別將益氣養(yǎng)陰組、活血通絡(luò)組、化痰散結(jié)組的治療靶點(diǎn)跟IPF的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行取交集操作。益氣養(yǎng)陰組跟IPF重疊的靶點(diǎn)有58個，活血通絡(luò)組跟IPF重疊的靶點(diǎn)有85個，化痰散結(jié)組跟IPF重疊的靶點(diǎn)有81個。基于此，3組與IPF的重疊靶點(diǎn)進(jìn)行取交集操作，發(fā)現(xiàn)3組藥皆能調(diào)控到的IPF疾病靶點(diǎn)有42個：血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)1、胰島素樣生長因子受體1(IGF1R)、非受體型蛋白-酪氨酸磷酸酶(PTPN)11、間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子(MET)、胱天蛋白酶 (CASP)3、MMP12、白細(xì)胞介素(IL)-2、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAF)1、巨噬細(xì)胞移動抑制因子(MIF)、趨化因子配體(CCL)5、MMP2、非受體型酪氨酸蛋白激酶(JAK)2、RARβ基因(RARB)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β2、細(xì)胞分裂周期蛋白(CDC)42、MMP3、血管內(nèi)皮細(xì)胞表面受體(KDR)、腎素基因(REN)、H-Ras 基因(HRAS)、表皮生長因子受體(EGFR)、MMP8、干細(xì)胞生長因子受體(KIT)、核糖核酸酶(RNASE)3、過氧化物酶體增生激活受體γ(PPARG)、中性白細(xì)胞彈性蛋白酶(ELANE)、MMP9、凝集素(LGALS)-3、鈣衛(wèi)蛋白(S100A9)、凝血酶原(F2)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(NOS)2、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)激酶(MAP2K)1、E選擇素(SELE)、酪氨酸激酶(TEK)、成纖維細(xì)胞生長因子受體(FGFR)1、核受體(NR)1H4、MAPK1、非受體酪酸激酶(SR)C、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)1、磷酸二酯酶(PDE)5A、MAPK14、MAPK8。因此，本研究將這42個靶點(diǎn)認(rèn)定為中藥復(fù)方核心藥組治療IPF的關(guān)鍵靶點(diǎn)，并對此進(jìn)行PPI和功能富集分析。

2.10PPI分析 將42個關(guān)鍵交集靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，得到了這42個靶點(diǎn)的PPI關(guān)系，并通過Cytoscape軟件對其進(jìn)行了可視化呈現(xiàn)，如圖2所示，圖中的綠色圓圈表示靶點(diǎn)，連線表現(xiàn)靶點(diǎn)之間的聯(lián)系。同時，運(yùn)用拓?fù)浞治龅姆椒ǎ瑥倪@42個靶點(diǎn)中篩選出了“度值”前10的靶點(diǎn)：MMP9、CASP3、MAPK1、MAPK8、EGFR、MMP2、SRC、HRAS、IL-2、MAPK14，均是這42個關(guān)鍵靶點(diǎn)中的核心靶點(diǎn)。

圖1 關(guān)聯(lián)規(guī)則可視化分析

圖2 42個關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI關(guān)系和拓?fù)浞治?/p>

2.11功能富集分析 將42個關(guān)鍵靶點(diǎn)上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能富集分析(BP、MF和CC)和KEEG通路分析，得到了83個KEEG通路項(xiàng)目、222個BP項(xiàng)目、52個MF項(xiàng)目和30個CC項(xiàng)目，并按照P值篩選出各組的前20項(xiàng)進(jìn)行可視化呈現(xiàn)，見圖3、圖4。KEEG通路富集結(jié)果顯示，中藥復(fù)方參與調(diào)控多種信號通路，如癌癥相關(guān)信號通路(膀胱癌、胰腺癌、腎細(xì)胞癌、黑素瘤、癌癥的中樞碳代謝)、感染性疾病信號通路(乙型肝炎、肺結(jié)核、幽門螺桿菌感染的上皮細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo))、激素調(diào)節(jié)信號通路(促性腺激素信號通路、催乳激素信號通路)、VEGF信號通路、TNF信號通路、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信號通路、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子(FoxO)信號通路、MAPK信號通路、Rap1信號通路、Ras信號通路等。功能富集結(jié)果顯示，中藥復(fù)方參與的BP主要包括正調(diào)控MAP激酶活性、正調(diào)控PI3K、負(fù)調(diào)控凋亡過程、調(diào)控細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)1、ERK2級聯(lián)、正調(diào)控細(xì)胞的增殖、遷移和生長、正調(diào)控蛋白磷酸化及參與細(xì)胞外基質(zhì)分解、蛋白質(zhì)自身磷酸化、膠原蛋白分解代謝、蛋白水解等；參與的MF主要包括蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、肽鏈內(nèi)切酶活性、蛋白激酶活性、金屬內(nèi)肽酶活性、ATP結(jié)合、酶結(jié)合、受體結(jié)合、蛋白結(jié)合、蛋白磷酸酶綁定等。

圖3 功能富集通路

圖4 42個靶點(diǎn)功能富集分析結(jié)果

3 討 論

通過對209首抗IPF中藥復(fù)方的多維度統(tǒng)計(jì)分析，可視化地展現(xiàn)出了中醫(yī)對IPF的理法方藥認(rèn)知。高頻藥物及高頻功效的分析結(jié)果，展現(xiàn)出氣陰兩虛、痰瘀阻絡(luò)是中醫(yī)對IPF的共性病機(jī)認(rèn)知，其中用于補(bǔ)氣的藥物主要包括黃芪、甘草、黨參、炒白術(shù)，用于養(yǎng)陰的藥物主要包括麥冬、北沙參，用于養(yǎng)血的藥物主要包括當(dāng)歸、丹參、川芎，用于活血化瘀通絡(luò)的藥物主要包括當(dāng)歸、川芎、丹參、桃仁、地龍、水蛭，用于化痰散結(jié)的藥物主要包括半夏、浙貝母、桔梗，其核心藥物為黃芪。高頻藥性的分析結(jié)果，展示出IPF寒熱錯雜的證候特征。高頻藥味的分析結(jié)果，也展示出甘、苦、辛是治療IPF藥物的主要藥味，甘味能補(bǔ)、能緩，主要指補(bǔ)中益氣、補(bǔ)肺之母；苦味能降，主要指肅肺；辛味能散，主要指宣肺。高頻歸經(jīng)反映出從肺、肝、脾、腎著手是中醫(yī)論治IPF的切入點(diǎn)。因此，綜合以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，從肺、肝、脾腎著手，運(yùn)用甘、苦、辛之藥，發(fā)揮益氣養(yǎng)陰、化瘀通絡(luò)、宣肺化痰的效力，是中醫(yī)治療IPF的核心切入點(diǎn)。

通過對209首抗IPF中藥復(fù)方的多重?cái)?shù)據(jù)挖掘，總結(jié)出了中醫(yī)治療IPF的3個核心藥組，分別為益氣養(yǎng)陰組，其核心藥物為黃芪、甘草、麥冬；活血通絡(luò)組，其核心藥物為丹參、地龍、川芎；化痰散結(jié)組，其核心藥物為半夏、浙貝母、桔梗。為進(jìn)一步探究核心藥組治療IPF的潛在藥理學(xué)機(jī)制，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對其進(jìn)行了探究。通過對藥物潛在治療靶點(diǎn)與IPF疾病靶點(diǎn)的多重交叉分析，可以發(fā)現(xiàn)3個核心藥組在微觀分子層面針對IPF具有多個共同靶點(diǎn)。現(xiàn)代研究表明，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所富集到靶點(diǎn)、通路、生物功能大多與臟器纖維化的發(fā)生、發(fā)展及治療有關(guān)，如槲皮素可以通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路預(yù)防肝纖維化〔10〕，miR-15a-5p可以通過靶向調(diào)控VEGF抑制大鼠腹膜透析誘導(dǎo)的腹膜纖維化〔11〕，粉塵可通過IL-2的上調(diào)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的耗盡誘發(fā)小鼠肺部的炎癥和纖維化〔12〕，TNF-α誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB激活可促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞分化、加劇博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化〔13〕。

綜上，中醫(yī)藥主要通過益氣養(yǎng)陰(黃芪、甘草、麥冬)、活血通絡(luò)(丹參、川芎、地龍)、化痰散結(jié)(半夏、浙貝母、桔梗)發(fā)揮抗IPF作用，藥性主要為溫、寒、平，藥味多為甘、苦、辛，歸經(jīng)多為肝、肺、脾和腎，關(guān)聯(lián)規(guī)則顯示核心藥物為黃芪。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究反映出中藥復(fù)方通過多成分-多靶點(diǎn)-多通路發(fā)揮抗IPF作用，關(guān)鍵靶點(diǎn)包括MMPs、CASP3、MAPKs、EGFR、SRC、HRAS、IL-2，關(guān)鍵通路包括癌癥相關(guān)信號通路、感染性疾病信號通路、激素調(diào)節(jié)信號通路、VEGF信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路等。