收獲期對高水分玉米籽粒濕貯品質及真菌毒素的影響

王興亞，張守梅，郭玉秋，張娜娜，陳利容，龔魁杰，劉開昌

（1.山東省農業科學院作物研究所，山東 濟南 250100；2.山東省農業科學院，山東 濟南 250100）

玉米收獲時籽粒含水量較高，一般在30%以上［1］，若直接脫粒胚部種皮易碎，為霉菌提供營養，入倉后存在存貯變質、毒素滋生、營養下降等諸多問題。為了降低籽粒含水量，玉米需要晾曬、烘干等環節，但成本較高［2］。因此，探索一種簡單、經濟、有效的貯藏方法是解決這些問題的關鍵所在。有研究表明，玉米籽粒濕貯能夠更好地貯存，防止發霉變質，保持營養成分，減少浪費，降低飼料成本，提高養殖戶的經濟效益［3］。

以往針對全株玉米青貯的研究表明，收獲期會影響青貯飼料的霉菌毒素、營養價值及發酵品質等［4-6］。過早收獲成熟度相對較低，玉米淀粉含量低，造成產量以及青貯飼料能值較低［7］。同時，容易造成梭菌繁殖，影響青貯品質［8］。收獲推后可以保證最佳的產量和營養價值［9］，但是真菌數量和真菌毒素含量隨著收獲期的延后而增加［10］。而且，收獲較晚會導致淀粉比例較高，難以實現高緊實度的青貯，限制乳酸菌的生長，青貯效果較差［11］。因此，適宜的收獲期是發酵的關鍵。

目前關于收獲期對玉米飼料發酵效果的研究主要集中在全株玉米和玉米秸稈，缺乏對玉米籽粒濕貯的研究。因此，本研究通過設置不同玉米籽粒收獲期，從霉菌毒素（嘔吐毒素）、營養價值、發酵品質方面探索最適玉米籽粒濕貯收獲期，以期為玉米籽粒濕貯的發展提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 濕貯玉米籽粒采集

濕貯玉米籽粒選用京農科728（JNK728）品種籽粒。2020年6月25日播種于山東省農業科學院濟陽實驗基地（117.22°E，36.98°N），10月15日收獲。

1.2 試驗設計

試驗共設3個處理，即分別在籽粒含水量20%～30%、30%～40%和40%～50%時收獲玉米并破碎，繼而采用厭氧發酵袋發酵，重復3次。玉米籽粒含水量用谷物水分測定儀測定。分別在濕貯前和濕貯后10、20、30、90 d取樣測定相關指標。

1.3 指標測定及方法

1.3.1 真菌分離、純化和鑒定 稱取5 g樣品于含有45 mL滅菌蒸餾水的三角瓶中，密封后置于智能恒溫培養振蕩器（HNY-100B，天津歐諾儀器股份有限公司）中150 r/min振蕩20 min，靜置5 min后，取1 mL上清液于裝有9 mL滅菌蒸餾水的離心管中，混勻后依次稀釋成10-2、10-3、10-4濃度梯度。取100μL稀釋液涂布于含有1%青霉素（10000 U/mL，）和硫酸鏈霉素（10 mg/mL）的PDA培養基上，每個濃度梯度設置3個重復。室溫下培養3～5 d，根據菌落形態進行計數和編號，并純化至單一菌落，用無菌保種管4℃保存。

將分離純化的菌落接種于PDA培養基上，室溫下培養3～5 d，待菌落直徑擴展到3～5 cm時，測量菌落大小，測定氣生菌絲狀態、菌落顏色和紋理形態以及是否產生可溶性色素等。在超凈工作臺（SW-CJ-2FD，蘇州凈化設備有限公司）上用無菌接種針挑取少量菌絲至滴有無菌水的載玻片上，于光學顯微鏡（IX51，日本OLYMPUS公司）下觀察菌絲和孢子形態。

根據觀察結果，選取不同形態的菌株，采用熱裂解法［12］進行真菌DNA組提取。采用基于18S核糖體DNA的ITS通用引物進行DNA片段擴增［13］。

1.3.2 嘔吐毒素測定 嘔吐毒素采用酶聯免疫吸 附 法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定，按照試劑盒上的說明書逐步加樣進行反應。利用酶標儀（GENIOS Plus，瑞士TECAN公司）在450 nm和630 nm雙波長下檢測樣品反應，讀取各孔的吸光度值，計算百分吸光率。其公式如下：

式中，B為標準品或樣品的吸光度值，B0為空白對照吸光度值。

以標準品百分吸光率為縱坐標，以對應毒素標準品濃度（μg/kg）的對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。根據標準曲線，計算樣品嘔吐毒素含量。

1.3.3 營養價值指標測定 干物質（DM）和粗灰分（Ash）含量測定參考《飼料分析及飼料質量檢測技術》［14］進行測定。粗蛋白質（CP）含量測定采用凱氏定氮法。淀粉含量測定采用蒽酮比色法。

1.3.4 發酵指標測定 稱取20 g樣品，加入180 mL無菌蒸餾水，用榨汁機榨汁后過濾，取濾液用于發酵指標測定。使用pH計（LE438，METTLER TOLEDO）測定pH值。取濾液8 mL于10 mL離心管中，加入25%偏磷酸1.6 mL，置于-4℃冰箱過夜，10000 r/min離心，取上清液，于0.45μm孔徑水相濾膜下過濾用于指標測定。其中，乳酸含量采用對羥基聯苯比色法測定，氨態氮（NH3-N）含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定。費氏評分（FS）采用王國艮［8］的方法進行，計算公式：

1.4 數據處理與分析

采用Microsoft Excel 2019和SPSS 25.0軟件對數據進行統計分析，顯著水平設置為0.05，采用最小顯著法（LSD法）進行。SigmaPlot 10.0作圖。測序結果用Chromas軟件進行序列分析和校正，在Genebank中進行在線比對，獲得較高同源性的核苷酸序列，再初步確定其發育地位。

2 結果與分析

2.1 不同收獲期對玉米籽粒濕貯真菌數量的影響

玉米籽粒濕貯前，分離出的霉菌種類主要為鐮刀菌屬Fusarium、曲霉屬Aspergillus、青霉屬Penicillium。隨著收獲期的推遲，霉菌數量增加。玉米籽粒濕貯能明顯降低霉菌數量。發酵30 d，除20%～30%籽粒含水量下霉菌數量降低94.8%外，其余處理霉菌數量均降低100%，即降至零。發酵過程中，分離出的酵母菌以畢赤酵母Pichia kudriavzevii為主，酵母菌數量呈現先增加后減少趨勢，20%～30%籽粒含水量下酵母菌較活躍（表1）。

表1 不同收獲期玉米籽粒濕貯真菌數量變化

2.2 不同收獲期對玉米籽粒濕貯嘔吐毒素含量的影響

由圖1可知，收獲期對玉米籽粒嘔吐毒素含量有顯著影響。濕貯前，20%～30%含水量下籽粒嘔吐毒素含量為325.4μg/kg，顯著高于其它兩個處理。其它處理籽粒嘔吐毒素含量均較低，在1.5～31.5μg/kg之間。玉米籽粒濕貯能顯著降低嘔吐毒素含量。發酵10 d，20%～30%含水量下籽粒嘔吐毒素含量降低91%，降至30.5μg/kg。發酵90 d，各處理籽粒嘔吐毒素含量在1.7～32.3 μg/kg之間，均低于中國飼料衛生標準中植物性飼料原料的最高限量5 mg/kg（GB 13078—2017）。

圖1 不同收獲期玉米籽粒濕貯嘔吐毒素含量變化（干基）

2.3 不同收獲期對玉米籽粒濕貯營養品質的影響

由表2可以看出，不同收獲期玉米籽粒的干物質、粗灰分、蛋白質和淀粉含量均存在明顯差異。隨著收獲期推遲，籽粒干物質、蛋白質含量顯著增加（P＜0.05），粗灰分含量降低；20%～30%含水量下籽粒淀粉含量顯著高于其它兩個處理。

表2 不同收獲期玉米籽粒濕貯營養品質變化（干基） （%）

隨著發酵時間延長，相同含水量下籽粒干物質無明顯變化；30%～40%和40%～50%含水量下粗灰分含量降低，20%～30%含水量下粗灰分含量增加；發酵30 d，蛋白質含量明顯增加；淀粉含量呈現先增加后降低趨勢。

2.4 不同收獲期對玉米籽粒濕貯發酵品質的影響

由表3看出，濕貯前，20%～30%含水量下pH值顯著低于其它兩個處理，40%～50%含水量下NH3-N含量顯著低于其它兩處理（P＜0.05）。

表3 不同收獲期玉米籽粒青貯發酵品質變化（干基）

隨著發酵時間延長，各處理玉米籽粒pH值整體呈降低趨勢，高水分含量下pH值降速較快。發酵30 d，除20%～30%含水量外，其它兩處理pH值均降至4.3以下；發酵90 d，20%～30%含水量下pH值仍為4.71。發酵90d，30%～40%和40%～50%含水量下乳酸和NH3-N含量顯著高于20%～30%含水量（P＜0.05）。發酵30 d和90 d，30%～40%含水量下費氏評分最高。

3 討論與結論

3.1 不同收獲期對玉米籽粒濕貯真菌及嘔吐毒素的影響

本研究中，隨著收獲期推遲，霉菌數量以及嘔吐毒素含量均增加。主要是因為作物生育后期，隨著收獲期推遲，真菌感染、生長以及毒素積累的風險 將 會 增 加［10，15］。本 研 究 中，發 酵30 d，20%～30%含水量下霉菌數量降低94.8%，其它兩處理均降低100%，即降至零，這可能是乳酸菌在發揮作用。因為發酵過程中起主導作用的是乳酸菌，乳酸菌通過產生乳酸使濕貯玉米籽粒變為酸性，逐漸形成不利于腐敗菌生長的條件［16］。但是，收獲期會影響發酵過程中的乳酸菌生長，含水量較低時乳酸菌生長受到抑制，而此時酵母菌與乳酸菌爭奪糖分，快速繁殖［17］。因此，20%～30%含水量下酵母菌含量較高。本研究中，發酵10 d，20%～30%含水量下嘔吐毒素含量降低91%。有研究表明，乳酸菌和酵母菌均可以結合或降解發酵飼料中的霉菌毒素，使濕貯過程中真菌毒素含量下降［18］。但是，嘔吐毒素下降的具體原因以及機理還需要進一步探索。

3.2 不同收獲期對玉米籽粒濕貯營養品質的影響

隨著收獲期的改變，玉米籽粒的營養成分也發生差異性變化［19］。本研究中，隨著收獲期推遲，玉米籽粒濕貯前后均表現為干物質、蛋白質和淀粉三者含量增加。這和以往研究結果一致［20］。因為籽粒形成期葉片光合產物和莖葉中貯存的干物質集中向籽粒轉運，籽粒干物質量逐漸增加，其淀粉和蛋白質含量也均在蠟熟后期至成熟階段呈現最大值。

3.3 不同收獲期對玉米籽粒濕貯發酵品質的影響

研究表明，收獲期對玉米籽粒濕貯具有顯著影響，過低的籽粒含水量不利于發酵［21］。本研究中，發酵90 d，20%～30%含水量下pH值仍為4.71，未達到發酵要求標準，并且其乳酸和NH3-N含量顯著低于高含水量處理。主要是因為適宜的水分是乳酸菌生長發酵的必要條件，較高水分含量乳酸菌比較活躍，而水分含量低會使物料難以壓實，乳酸菌發酵緩慢，產酸較少，pH值也降低的相對緩慢［19］。微生物的蛋白質水解過程會影響發酵玉米的NH3-N含量，高水分玉米由于發酵比較活躍，因此NH3-N含量高，這與Schmidt等（2009）［22］的研究結果一致。費氏評分主要由干物質含量和pH值計算得到，是評估發酵效果的標準之一［5］。本研究中，30%～40%含水量下費氏評分最高，與20%～30%含水量相比，其pH值降速較快，pH值較低，同時干物質含量高于40%～50%含水量處理。

綜上所述，濕貯玉米籽粒最佳收獲期為含水量30%～40%。