水稻抽穗期途徑基因的磷酸化、泛素化研究進展

王婧瑩 趙廣欣 邱冠凱 方軍, *

水稻抽穗期途徑基因的磷酸化、泛素化研究進展

王婧瑩1, 2趙廣欣1, 2邱冠凱1, 2方軍1, 2, *

(1中國科學院東北地理與農業生態研究所，黑龍江 哈爾濱 150081；2中國科學院大學，北京 100049;*通信聯系人, E-mail: fangjun@iga.ac.cn）

水稻是一種廣泛種植的兼性短日照植物。水稻抽穗期是直接影響產量和品種地域適應性的重要農藝性狀。因此，研究該性狀的影響因素并使植株在適宜的時間抽穗具有重要意義。水稻抽穗期作為一個復雜的數量性狀，受內在基因網絡和外界光溫等條件的共同調控。目前，已經鑒定和克隆出多個控制抽穗期的關鍵基因，發現磷酸化和泛素化修飾在抽穗期分子機制中起重要作用。本文介紹了水稻抽穗期光周期途徑的分子機制，重點闡述了磷酸化級聯反應和泛素26S蛋白酶體系統對抽穗期調控的研究進展，旨在為挖掘調控抽穗期的新作用機制和改良品種地域適應性提供理論依據和實踐指導。

水稻；抽穗期；磷酸化；泛素化

水稻(L.)作為全球重要的糧食作物之一，是一種兼性短日照植物，即在短日照(在24 h晝夜周期中，日照長度短于10 h)條件下早開花，長日照(日照長度長于14 h)條件下晚開花[1]。抽穗期(heading date，HD)是指從播種到稻穗從劍葉中伸出所需要的天數，由內在的多基因調控并受到外界光照、溫度等因素的影響[2]。水稻抽穗的時間直接決定著光合產物及營養物質積累程度，并且間接決定了植株在不同緯度的生長情況。因此，水稻抽穗期不僅對水稻籽粒的產量和品質有直接影響，還對其地域適應性起到了關鍵作用[3]。雙子葉模式植物擬南芥()主要通過6種途徑調控開花時間：光周期途徑(photoperiod pathway)、春化途徑(vernalization pathway)、赤霉素途徑(gibberellin pathway)、自主開花途徑(autonomous pathway)、溫度途徑(temperature pathway)和年齡途徑(age pathway)[4]。而現有對于單子葉模式植物水稻抽穗期的研究只有光周期調控機制相對清晰。

水稻抽穗期是一種復雜的數量性狀，各抽穗期基因（QTL）既相互獨立又協同互作，它們共同構成了水稻抽穗期途徑網絡。目前，Gramene網站上公布的數據顯示，研究人員已定位618個抽穗期相關的QTL（http://archive.gramene.org/qtl/, 2020），它們分布于水稻的12條染色體上[5]。早期研究認為控制水稻抽穗期途徑主要有兩條，具體如下：(,and) 信號通路是進化保守的，分別對應擬南芥(,and)的三個同源蛋白[6]。不同的是該擬南芥通路是長日照條件下最主要的光周期開花誘導途徑[7]，而在水稻中的通路則起到相反的作用。該通路受光感知和生物鐘調控，促進表達，結合啟動子并激活表達[8]。這種在長日照條件下抑制開花，在短日照條件下促進開花的活性改變是通過光敏色素介導的信號轉導途徑來完成的[9]。/--/(,,/)途徑是水稻特有的[10]，和在擬南芥基因組中沒有同源性，它們的表達受光敏色素(phytochromes)和隱花色素(cryptochromes)響應生物節律的調控，和在葉片中感知光周期信號后，由Hd3a和RFT1蛋白組成的長距離信號(成花素)傳遞到莖尖分生組織，進而刺激水稻花器官生殖發育[11]。

然而，隨著近年來研究的深入，越來越多的研究結果表明，這兩個途徑并不是完全獨立的，即調控抽穗期的關鍵基因常常以復合物的形式來通過這兩個途徑共同行使功能。核因子Y (NUCLEAR FACTOR Y, NF-Y)轉錄因子，又稱血紅素相關蛋白(Heme-associated proteins, HAPs)和CCAAT box-binding factors, CBFs)，NF-Y復合物是三聚體，由NF-YA (HAP2/CBF-B)、 NF-YB (HAP3/CBF-A)和NF-YC (HAP5/CBF-C)亞基組成，能夠與CCAAT盒的順式元件結合，調節基因表達[12]。水稻基因組包含10個，11個和7個基因[13]，其中(Days to Heading 8)即為[14]。Ghd7/Hd4和DTH8/Hd5都能與Hd1蛋白相互作用并形成復合物，在長日條件下通過下調和/，共同抑制水稻抽穗[15]。Hd1與DTH8還能夠和OsNFYC7互作形成三聚體復合物，該復合物能夠與Hd3a啟動子中的包含CCACA基序的保守應答元件OsCORE2 (CO-responsive element 2)結合[16]。Ghd7或OsPRR37 (Pseudo-Response Regulator37)/ Hd2(Heading date 2)/ DTH7(Days to heading 7)/ Ghd7.1(Grain Number, Plant Height, and Heading Date7.1)也可以和DTH8、OsNFYC2形成三聚體[17]。這是因為Hd1、OsPRR37和Ghd7都含有保守的CCT結構域，都能夠與NF-YB/YC二聚體形成三聚體復合物[18]。不同蛋白受外界條件影響參與到不同的信號途徑協同作用，這是植物進化智慧的體現。

蛋白質翻譯后修飾(post-translational modifications，PTMs)是指蛋白質在翻譯中或翻譯后經歷的一個共價加工過程，即通過在一個或幾個氨基酸殘基上加入或水解剪去修飾基團從而改變蛋白質的性質和理化結構，從而直接改變蛋白的結合能力與功能，并實現蛋白質功能的指數級擴增的生物過程[19]。翻譯后修飾在植物體內是普遍發生的，且一個蛋白質會有多種修飾位點，這極大地豐富了蛋白質的種類和功能。目前已發現300多種不同的翻譯后修飾，主要形式包括磷酸化、泛素化、糖基化、乙酰化、琥珀酰化、巴豆酰化、羧基化、核糖基化以及二硫鍵的配對等[20]。蛋白質翻譯后修飾對蛋白功能影響具有多樣性，即同一氨基酸序列的不同氨基酸殘基發生同一種翻譯后修飾，產生不同種功能的蛋白質；或同一氨基酸序列發生不同種翻譯后修飾，產生更為豐富的多種功能的蛋白質，并參與更多的生物學過程[21]。蛋白質的翻譯后修飾是一種可逆反應，例如蛋白激酶和蛋白磷酸酶可分別通過磷酸化或去磷酸化調控蛋白質功能，而在這一磷酸化修飾過程中，該肽段的分子量剛好增加或減少一個或幾個磷酸根的分子量[22]。需要說明的是，蛋白質發生翻譯后修飾，顯著改變蛋白的理化及構象后，蛋白的表達水平不一定發生變化，但如果翻譯后修飾的狀態發生改變，蛋白的功能將發生顯著變化。蛋白質翻譯后修飾廣泛參與到植物中以能量代謝為主的多種生理生化過程中，因此研究翻譯后修飾對揭示蛋白質的生物學功能和作用機制具有重要意義。然而，相對于人類、動物和微生物的翻譯后修飾的鑒定和藥物靶向位點開發研究，翻譯后修飾在植物中研究較少，且主要集中在擬南芥、水稻、小麥等模式植物中[23]。在已有的光周期調控水稻抽穗期的報道中，只有磷酸化與泛素化的內容相對豐富，本文主要對這兩種翻譯后修飾對水稻抽穗期調控的影響作梳理與總結。

1 磷酸化級聯反應調控水稻抽穗期

蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的蛋白質磷酸化和去磷酸化是植物體內存在的最普遍且最重要的信號轉導調節方式。其中，蛋白激酶作為一類磷酸轉移酶，其主要作用是將ATP的γ磷酸基團轉移到底物特定的氨基酸殘基上，從而使被磷酸化的蛋白對下游基因的表達進行調控，進而影響細胞的生長、增殖和凋亡，最終使生命體代謝活動變化[24]。

根據植物蛋白激酶特異性底物蛋白被磷酸化的氨基酸殘基種類不同，可將其分為5類：絲氨酸/蘇氨酸的羥基被磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、酪氨酸的酚羥基被磷酸化的酪氨酸蛋白激酶、組氨酸、賴氨酸或精氨酸的咪唑環、胍基、ε-氨基被磷酸化的組氨酸/賴氨酸/精氨酸蛋白激酶、半胱氨酸的巰基被磷酸化的半胱氨酸蛋白激酶和酰基被磷酸化天冬氨酰基/谷氨酰基蛋白激酶[25]。

植物蛋白激酶由催化結構域、調節結構域和其他結構域構成。沒有活性的蛋白激酶全酶由催化亞基和調節亞基共同構成的四聚體結構。催化結構域由近300個氨基酸殘基構成，氨基酸序列高度保守，折疊起來在蛋白激酶內側形成核心結構域[26]。當調節因子與調節亞基結合后，催化亞基暴露出來形成游離態，進而磷酸化底物。

蛋白激酶通過兩種途徑參與植物體信號轉導：一是通過磷酸化調節蛋白質的活性，絕大多數信號通路激活可逆，有些蛋白質可以在磷酸化或去磷酸化后獲得活性；二是通過蛋白質的磷酸化級聯反應，磷酸化使信號逐級放大，進而引發生物進程[24]。

1.1 蛋白激酶CKⅠ與CK2α調控OsPRR37/Hd2和Ghd7/Hd4

Ⅰ型及Ⅱ型酪蛋白激酶(CKⅠ及CKⅡ)均屬于真核生物中普遍存在的高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，主要定位于細胞核、細胞質、細胞膜和線粒體等部位，能夠催化肽鏈中鄰近酸性氨基酸殘基的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化的酶，具有廣譜底物特異性及多種生物功能，在真核生物的生長發育、生命節律、細胞周期、囊泡運輸、胞間通訊等生命活動中都起到重要的作用[27]。二者在結構上有所不同，CKⅠ以單體形式存在，而CKⅡ能夠形成α2β2異源四聚體，其中α亞基是一種催化亞基，而β是調節亞基[28]。在擬南芥中，CKⅠ主要調控開花時間和晝夜節律。藍光誘導的條件下，CKⅠ的兩個成員CK1.3和CK1.4能夠磷酸化藍光受體CRY2 (Cryptochrome 2)，并促進其降解，從而影響擬南芥藍光信號轉導和晝夜節律[29]。此外，高度保守的生物鐘成分CKⅡ還可以與生物鐘核心振蕩器蛋白CCA1(Circadian clock associated 1)相互作用并使其磷酸化，從而獲得DNA結合活性并調控晝夜節律[30]。

在水稻中，()/能夠磷酸化擬南芥晝夜振蕩器組件LHY (Late elongatedhy pocotyl)的同源物OsLHY (late elongatedhy pocotyl)[31]；()/()編碼酪蛋白激酶CKⅠ，是長日照條件下抽穗期負調節因子，其自然突變有利于長日照下粳稻早開花[32]。同一基因在不同品種中存在不同的基因型。越光背景的基因型與其他品種不同，所有其他基因型在這個位置編碼一個丙氨酸氨基酸，只有越光等位基因在非同義置換的核苷酸位置編碼蘇氨酸。的這一非同義替代能夠導致水稻的光周期敏感性降低[32]。Hd6和Hd16都能夠磷酸化OsPRR37/Hd2，Hd16還能夠磷酸化Ghd7/Hd4，且本身也能自磷酸化。Hd6和Hd16分別與OsPRR37互作并磷酸化，但磷酸化OsPRR37的殘基不同。Hd6和Hd16均使OsPRR37的中段磷酸化，而含CCT結構域的OsPRR37的C端只能被Hd16磷酸化。此外，Hd6和Hd16均未使包含PR結構域的N端磷酸化[33]，磷酸化的確切位點以及這些位點對抽穗期影響的程度仍需要進一步研究。

/是水稻中主要的長日照開花抑制子，屬于PRRs家族，是擬南芥的同源物。所有植物中的PRRs都能被磷酸化。水稻中含有5個擬南芥PRR基因的同源蛋白：OsPRR1/OsTOC1、OsPRR37、OsPRR59、OsPRR73和OsPRR95[34]。抑制的表達，從而抑制水稻成花素和的表達，或直接下調的表達，從而調控水稻抽穗[35]。受光敏色素B ()的調控，無論是長短日照，突變體中的表達水平大幅下降[36]。

/含有CCT結構域，同時控制水稻的每穗粒數、株高和抽穗期性狀，是一因多效基因[10]。是水稻在長日照條件下最主要的開花抑制子之一，在擬南芥中沒有同源蛋白，在長日照條件下，的表達增強，抑制、和等下游基因的表達，進而推遲了抽穗期[37]。功能缺失的自然突變體使水稻能夠在溫帶和較冷的地區種植。因此，在提高全球水稻產量和適應性方面發揮了重要作用。

實驗數據表明，無論日本晴還是越光背景，均能與互作，與越光背景的相比，日本晴背景互作較強且與全長互作。在具有弱光周期敏感等位基因的近等基因系(日本晴背景越光基因型)中，長日照條件下、和的轉錄水平升高，均高于日本晴，短日照條件下和的轉錄水平降低。功能性Hd16重組蛋白在體外磷酸化Ghd7。網站預測Ghd7的Ser-68為Hd16磷酸化位點[38]。這說明Hd16通過磷酸化修飾調控激活蛋白Ghd7，并使其與Hd1互作，進而下調、和等下游基因，最終顯著推遲開花。

和在長日照條件下的開花抑制效應是加性的，OsPRR37在突變體中促進抽穗，反之，它會通過與Ghd7相互作用，共同抑制的表達從而延遲抽穗，這兩種主要的開花抑制因子和的自然變異使其降低甚至喪失感光性，對水稻在最北部地區生長的季節和區域適應性具有重要意義[39]。

1.2 蛋白激酶OsK4與蛋白配體HDR1結合調控Hd1/Ehd1

Ehd1是細胞分裂素信號通路中的B型反應調節RR(response regulator)蛋白家族，含有受體R(Receiver)結構域和保守的脫氧核糖核酸G (GARP DNA)結合結構域[11]，其中R結構域的磷脂酰肌醇蛋白聚糖酶D-D-K(Asp-Asp-Lys)基序中間的Asp被磷酸化能夠增強Ehd1的轉錄激活活性[40]。Asp-63是Ehd1的磷酸化位點，當該位點被谷氨酸替代時(D63E)，其抽穗期顯著縮短，即與野生型植株相比，在短日照條件下提前3 d，在長日照條件下提前21 d，成花基因和的轉錄水平也較高。這說明Asp在第63位殘基的磷酸化對于Ehd1誘導成花至關重要[40]。

蛋白激酶OsK4與蛋白配體HDR1結合可以調控和。HDR1是一種起源古老的蛋白配體，能夠編碼一個由210個氨基酸組成的分子量約為23 kD的蛋白質，是苔蘚中SNF1/AMPK/SnRK1激酶配體PpSKI的同源物。蛋白激酶PpSKI作為能量計量器，通過關閉耗能過程和調動能量儲備來幫助細胞適應低能量條件，該功能不僅局限于對代謝的影響，還對發育和模式形成也有顯著影響[41]。而在水稻中，主要表現為開花負調控因子：在長日照條件下，比野生型早30 d開花；而在短日照條件下，二者差異不顯著。編碼的核蛋白在葉片和花器官中最活躍。與和表達模式相似，即在短日照條件下和長日照條件下，均在黃昏后積累，黎明前達到峰值，之后迅速衰減。因此認為，有可能通過不同途徑調控水稻開花，上調，抑制表達，或獨立參與通路[42]。是另一個水稻開花的抑制因子。體內外實驗均表明，蛋白激酶OsK4和其同源蛋白OsK3都直接與HDR1相互作用。表現出與相同的調控模式，即在中，表達量增加，表達量急劇下降進而導致的上調，而僅在長日條件下表達量上調[43]。OsK4在體內可以磷酸化Hd1，且HDR1是OsK4磷酸化Hd1所必需的[44]。OsK4在擬南芥中的同源蛋白AtSnRK1是一種非典型AMPK，該家族成員包括催化α亞基和非催化β和γ亞基，每個亞基類型存在多種同型異構體，并產生各種同工酶[45]。HDR1可能在水稻中扮演非催化的β或γ亞基的功能。事實上，HDR1、OsK4與Hd1可相互作用進而形成復合物從而調控長日條件下水稻開花。

1.3 蛋白激酶參與成花復合物

Hd3a和RFT1分別為水稻在短日照和長日照行使主要功能的成花素[46]，二者均以復合物的形式行使功能，即FAC (Florigen Activation Complex)模型，FAC的晶體結構由2個Hd3a/RFT1蛋白、1個14-3-3蛋白二聚體和1個OsFD1蛋白二聚體共同組成的異源六聚體[47]。在水稻葉片感知光周期等信號后，在體內進行一系列復雜的信號級聯反應，首先Hd3a/RFT1在細胞質中與14-3-3蛋白結合，此時，14-3-3二聚體蛋白的兩側各結合1個Hd3a/RFT1單體，形成一個厚而深的W形結構，Hd3a/RFT1- 14-3-3復合物進入細胞核后，位于復合物中心的OsFD1二聚體再通過與14-3-3蛋白的磷酸化絲氨酸結合位點相互作用，進而激活下游開花基因轉錄，最終該復合物組成的長距離信號(成花素)通過韌皮部傳遞到莖尖分生組織，刺激水稻花器官生殖發育，誘導成花[48]。

OsFD1包含1個保守的bZIP結構域和2個功能基序：SAP (RXXSAP) 和LSL[T(A/V)LSLNS]，而當SAP基序中的第192位絲氨酸殘基突變為丙氨酸(SI92A)后，OsFD1蛋白彌散在細胞質中，14-3-3與磷酸化OsFD1的磷酸絲氨酸產生的特征性緊密轉彎被破壞，OsFD1不能與14-3-3互作，轉錄水平急劇下降，這表明OsFD1蛋白磷酸化是FAC形成與花分生組織基因表達的前提和關鍵[48]。這種情況不是個例，RFT1也能與成花素受體14-3-3蛋白相互作用，但關鍵位點E105K自然突變后會使RFT1失去功能，不能與14-3-3蛋白相互作用[49]。基因突變能夠導致抽穗期延遲。實驗數據顯示，20個品系在武漢自然短日照條件下的抽穗期推遲了16.97±0.51 d，在人工短日照條件下的抽穗期推遲了9.10±0.54 d；-OE植物的抽穗期(81.00±1.56 d)早于野生型中花11(89.00±0.82 d)，而()-OE植物的抽穗期與野生型不存在顯著性差異[50]。

OsCIPK3是一個鈣調神經磷酸酶B類似蛋白(CBL)相互作用的蛋白激酶，含有445個氨基酸，包含1個蛋白激酶結構域和1個NAF結構域(一種允許鈣傳感器與其靶激酶相互作用的新型蛋白質相互作用結構域)，與擬南芥中的AtCIPK26和AtCIPK3同源，在水稻中能夠與OsFD1互作并磷酸化[51]。OsCIPK3 N端的蛋白激酶結構域與OsFD1的C端的bZIP結構域的完整性是二者相互作用的必備條件[50]。蛋白激酶OsCIPK3可以在體外自磷酸化，也能直接與OsFD1相互作用，使OsFD1磷酸化，使包含RFT1的FAC形成，最終啟動水稻的開花。突變導致長日條件下抽穗期較晚，比野生型推遲了20.25 d，而短日照條件下與野生型一致。將3個逆轉錄轉座子Tos17插入到的第13內含子中，可獲得o突變體[49]。和均優先在莖尖和幼葉中表達。

PMF1 (Calcineurin B-like Interacting Protein Kinase)也是CIPK家族蛋白激酶，同樣含有1個蛋白激酶結構域和1個NAF結構域。PMF1與OsFD1共定位于細胞核，能通過N端的蛋白激酶結構域與OsFD1直接互作并磷酸化修飾OsFD1。此外，二者的組織表達模式高度統一，都在莖尖組織表達最活躍。PMF1同樣在長日條件下行使功能，能夠影響基因表達并調控水稻成花轉換，也能負調控和表達[52]。

綜上，磷酸化的OsFD1是水稻在長日條件下開花的前提，而或許有另一個未知的蛋白激酶在短日照條件下磷酸化OsFD1，這還需進一步研究。

2 泛素26S蛋白酶體系統介導水稻抽穗期

泛素(Ubiquitin，Ub)是一種高度保守的由76個氨基酸組成的小分子蛋白質[53]。泛素化是指通過一系列酶的催化作用，泛素共價結合到底物蛋白上的過程[54]。泛素化級聯反應過程通常需要3種酶的協同作用：E1泛素激活酶(ubiquitinactivating enzyme)、E2泛素偶聯酶(ubiquitinconjugating enzymes)和E3泛素連接酶(ubiquitin-ligase enzymes)[55]。

一般來說，E1首先利用ATP提供的能量活化泛素分子生成Ub-E1復合體。該復合體通過轉酯作用將Ub轉移到E2上形成Ub-E2復合體。Ub-E2復合體將Ub轉移到底物蛋白有兩種途徑：第一種是E3特異性識別底物蛋白后直接將Ub的C端連接到底物蛋白賴氨酸(Lys)殘基ε-氨基上；第二種是先將Ub通過轉酯作用轉移到E3上，再由E3特異性識別底物蛋白后將Ub的C端連接到底物蛋白賴氨酸(Lys)殘基ε-氨基上[53]。與磷酸化相似，泛素化也同樣是一個可逆過程，去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)可以通過水解泛素分子間或泛素與底物蛋白之間的肽鍵或異肽鍵，從而逆轉泛素化修飾，再通過26S蛋白酶體催化各種蛋白質底物的泛素化，實現靶向降解[56]。

26S蛋白酶體是由20S核心顆粒(Core protease，CP)和19S調節顆粒(Regulatory particle，RP)組成的蛋白酶復合體，主要分布在細胞核與細胞質中。CP呈明顯中空的圓柱形狀，以不依賴于ATP和泛素的方式行使蛋白水解酶功能，將底物蛋白降解成小肽或游離的氨基酸。RP結合到CP兩端，形成26S蛋白酶體，它依賴于ATP水解提供的能量，其功能為將已結合泛素的目標蛋白遞送到蛋白酶體進行降解[57]。泛素26S蛋白酶體系統(ubiquitin 26S proteasome system，UPS)能夠改變植物的蛋白質組，參與如細胞周期調控、信號轉導、生物與非生物脅迫等重要生命活動過程，在植物的生長過程中發揮著重要且廣泛的作用[58]。

2.1 E3泛素連接酶泛素化抽穗期主效基因Hd1

E3泛素連接酶家族龐大、種類繁多，根據其結構，可分為單亞基和多亞基兩大類[59]。其中，單亞基E3根據結構域又主要分為HECT (homologous to e6-associated protein carboxyl terminus)、U-box、RING (really interesting new gene)以及CRLs (cullin-RING ligases)4類[60]；而多亞基E3復合體主要包含4個亞類，分別為APC、BTB、DDB、SCF復合體[61]。

HAF1 (Heading date Associated Factor 1)是一個包含C3HC4 RING結構域的E3泛素連接酶，能夠精確調節水稻中積累的時間和確保短日照條件下的適當光周期響應[62]。RING結構域是一個由約50個氨基酸組成的富含Cys的結構域，通過含有8個空間保守的Cys和His殘基的金屬配體，以螯合2個鋅離子來實現泛素向底物蛋白的轉移[63]。在水稻中，HAF1能夠與Hd1相互作用。實驗數據表明，Hd1的第2個B-box鋅指結構域是與HAF1相互作用所必需的，而Hd1的CCT結構域是非必需的[61]。HAF1形成同源二聚體可能是Hd1泛素化的先決條件，HAF1在形成一個二聚體后，才能具有E3泛素連接酶活性，行使泛素化功能[64]。HAF1以Hd1為靶點，通過26S蛋白酶體實現泛素依賴性降解，從而調控Hd1在植物體內的富集豐度。無論長短日照，突變體開花時間都較晚，而雙突變體在短日照條件下的抽穗期晚于，但在長日照條件下抽穗期與相似。在短日照條件下，通過Hd1高水平的積累，從而延遲開花。在長日照條件下，可能通過泛素化除外的其他開花基因參與穗期調控。也有報道說明，可能與相互作用，并參與水稻光周期調控生長的新途徑[62]。

2.2 E3泛素連接酶調控節律表達

是一種擬南芥的開花抑制因子[65]，它不是生物振蕩器的中心元件，而是ELF3-ELF4-LUX ARRHYTHMO (LUX)調節晝夜節律的晚間復合物的重要組成部分，主要作用為介導光信號調控生物鐘[66]。在光周期途徑中，位于和的上游[67, 68]，無功能的能夠縮短花期，并降低擬南芥的光敏感性[65]。

水稻主要通過抑制和的表達來促進開花，在中花11背景下，其突變會導致水稻在長日照條件下的抽穗期延遲[69]。雙突變體的抽穗期與相同，說明在長日照條件下，主要通過影響下游的從而調控抽穗期。此外，一些生物鐘相關基因的節律性表達模式在中有所改變，、、和等基因的轉錄水平明顯降低。因此，與擬南芥相似，也是生物鐘基因節律性表達所必需的[69]。

HAF1是OsELF3蛋白降解的特異性分子，通過26S蛋白酶體途徑介導OsELF3蛋白的泛素化。OsELF3的C端558殘基(L558S)上的亮氨酸被絲氨酸取代，從而終止了與HAF1的相互作用。這個在OsELF3與HAF1互作域內的氨基酸變異是導致粳稻抽穗期變異的主要原因。GWAS數據表明，攜帶(L)型等位基因的粳稻品種分布在高緯度地區，而攜帶(S)型等位基因的品種分布在低緯度地區，而絕大多數包含(L)等位基因的材料比包含(S)等位基因的材料更早開花；粳稻品種中花11攜帶(L)型等位基因，而秈稻品種珍汕97攜帶(S)型等位基因，只有中花11葉片的總蛋白提取物中提取的HAF1可以降解MBP-OsELF3(L)，這進一步表明OsELF3(L)蛋白在粳稻材料中發揮了作用，并可能有助于其提前開花。HAF1只能將OsELF3(L)泛素化和降解，而不能將OsELF3(S)泛素化，這種存在著秈粳差異的調控模式，對研究不同水稻品種地理分布差異的原因具有積極意義[70]。

2.3 OsGI通過26S蛋白酶體降解Ghd7

水稻中含有3個光敏色素基因，即()、()和()[71]，均可與下游信號中間體直接互作，調節下游基因表達和生理反應[72]。OsPHYA和OsPHYB能夠直接與Ghd7相互作用，而OsPHYC不與Ghd7互作。在突變體中，Ghd7蛋白含量下降[73]，這說明Ghd7蛋白的穩定性可能受光敏色素的調節。

OsGI與水稻中的Ghd7在光照下共同定位于細胞核并直接相互作用。OsPHYA和OsPHYB僅與全長Ghd7相互作用，與Ghd7-N或Ghd7-CCT不相互作用；而OsGI不僅與全長Ghd7相互作用，還與Ghd7-N和Ghd7-CCT相互作用。這表明光敏色素可能與OsGI競爭與Ghd7的相互作用，從而干擾了OsGI與Ghd7的相互作用。然而，OsGI不僅與全長Ghd7相互作用，還與Ghd7-N和Ghd7-CCT相互作用。這些結果表明，光敏色素可能與OsGI競爭與Ghd7的相互作用，從而干擾了OsGI與Ghd7的相互作用[74]。促進長日照條件下的轉錄[75]。自然長日照條件下日本晴背景共過表達和植株的抽穗期早于單獨表達的株系4～7 d，且在共過表達和植株中，下游基因和的表達水平高于單過表達。然而，盡管共過表達植株中的基因的轉錄水平較高，無論在長日照還是短日照條件下，其Ghd7蛋白質濃度比單過表達低得多，這可能是因為OsGI參與了Ghd7蛋白穩定性的控制。經過26S蛋白酶體特異性抑制劑MG132處理后的單過表達和共過表達、植株中的Ghd7蛋白濃度均顯著升高，表明OsGI可能通過26S蛋白酶體促進Ghd7蛋白的轉換，從而消除對長日照條件下開花的抑制作用[74]。

光周期敏感基因()編碼一個血紅素加氧酶，參與光敏色素發色團生物合成，短日照條件下能促進水稻提早開花[76]。在突變體制備的原生質體中，OsGI和Ghd7的相互作用強于野生型。在連續光照條件下，野生型原生質體中的原定位于細胞質中的OsPHYA和OsPHYB向細胞核中遷移，表明光照促進了OsPHYA和OsPHYB的核導入，這與擬南芥中的情況相符[77]，而在突變體背景下，光敏色素不能有效導入細胞核抑制OsGI和Ghd7之間的相互作用，因此，在依賴于OsGI的進程中，Ghd7的降解速度更快。這些結果表明，OsPHYA和OsPHYB可能通過阻斷OsGI和Ghd7之間的相互作用來促進Ghd7的穩定[75]。

2.4 26S蛋白酶體調控成花素運輸

擬南芥FTIP1與韌皮部伴生細胞中的FT相互作用，并特異性地介導FT蛋白從伴生細胞向韌皮部篩管細胞的運動[78]。水稻OsFTIP1是擬南芥FTIP1最接近的同源蛋白，包含三個C2結構域和一個PRT_C磷酸核糖基轉移酶C端結構域，同樣是水稻成花素RFT1從伴生細胞輸出到篩管細胞的必需蛋白，在調控長日照條件下水稻開花時間中發揮了重要作用[79]。

OsFTIP1是多個C2結構域和跨膜區蛋白(MCTPs)家族的成員[80]，僅包含3個C2結構域的截斷的OsFTIP1的N端與RFT1相互作用，而全長的OsFTIP1與之沒有相互作用。進一步實驗表明，第三個C2結構域是OsFTIP1與RFT1相互作用所必需的[79]。OsFTIP1特異性地介導了RFT1從韌皮部伴生細胞向篩管細胞的輸出，從而影響了RFT1通過韌皮部向SAM的運輸。雙突的開花時間晚于各自的單個突變體，這表明兩種蛋白可能對水稻開花產生協同效應，或與其他參與調控水稻開花時間的未知共調控因子獨立作用[79]。

磷脂酰肌醇3-/4-激酶(PI3/4K)家族蛋白OsUbDKg4，包含2個N端的UBL結構域和1個C端的PI3/4K結構域[81]，可與OsFTIP1相互作用，通過26S蛋白酶體OsRPN10調節OsFTIP1在葉片中的降解，進而影響RFT1向莖尖分生組織轉運[82]。這些結果為水稻成花素運輸提供了一種機制上的理解，并揭示了一種迄今為止未知的機制，該機制動態調節水稻成花素的運輸[83]。

2.5 RNA代謝與泛素化調控水稻開花

在動物、植物和真菌中存在包含與RNA結合相關結構域的E3連接酶蛋白[84]，這表明泛素化和RNA代謝之間的聯系是一種古老的、進化上保守的機制。水稻花斑葉基因()編碼一個U-box結構域/ARM重復型E3泛素連接酶，參與調節水稻的程序性細胞死亡(programmed cell death, PCD)、防御和開花時間[85]。U-box結構域包含大約70個氨基酸, 其組成成分與RING指結構域類似, 但缺少鋅螯合Cys和組氨酸(His)殘基[86]。

SPIN1 (SPL11-interacting protein1)是一種能夠與RNA/DNA結合的含有KH結構域的STAR家族蛋白[87]。STAR域是一個三部基序，一個KH域兩側有兩個子域，稱為QUA1和QUA2[87]。SPL11和SPIN1在細胞核內發生互作，SPIN1的N端區域和SPL11的ARM區域的完整性是二者相互作用的先決條件[88]。SPIN1的N端區域與現已知的任何結構域沒有同源性，或可認為其編碼了一個新的蛋白-蛋白相互作用域。

SPL11在體外既泛素化SPIN1，又負調控mRNA水平。突變體在短日照條件下的開花時間與野生型IR64相比沒有顯著差異，而在長日照條件下卻延遲開花；而無論在長短日照條件下，-RNAi的抽穗期都與野生型無顯著差異(水稻中已發現包括SPIN1在內的7個旁系同源物，它們之間可能存在功能冗余，這可能是沉默沒有顯著影響開花時間的原因)，過表達開花延遲，這說明在水稻中，作為開花時正向調節因子，作為開花抑制因子，負調節的表達[89]。SPL11與SPIN1的互作調節了水稻開花時間控制的翻譯后修飾機制。

RBS1 (RNA-binding and SPIN1-interacting 1)是一種新型的水稻hnRNP-R型RNA結合蛋白，包含三個RRM結構域，在體外具有RNA結合活性。RRM是異質核糖核蛋白(hnRNP)[90]中最常見的結構域之一。RBS1在細胞核中與SPIN1相互作用，作為介導的信號通路中的組分，同樣負調控水稻開花過程。

在短日照條件和長日照條件下，過量表達都會導致水稻開花延遲，但其敲除突變體和基因沉默植株均未有抽穗期表型。在過表達植株中，的表達量與野生型相似，但的表達量降低進而影響水稻成花素Hd3a的產生，最終延遲抽穗。這表明可能通過抑制介導的機制來調控水稻開花[91]。蛋白質印跡分析顯示，在過表達植物和突變體中的RBS1蛋白積累量增加，在過表達植物中SPIN1的蛋白積累量同樣增加，這些結果表明RBS1和SPIN1之間存在正相關，而SPL11和RBS1之間存在負相關。與是水稻開花抑制因子，而是水稻開花時間的正調控因子。

由于上述內容中僅有OsFD1和HAF1蛋白具有在短日照條件下影響抽穗期的功能，且調控途徑尚不明朗，故不在圖中呈現。

Fig.1.Phosphorylation and ubiquitylation regulation network of rice flowering under long daylight condition.

3 展望

關于磷酸化和泛素化的功能及其作用機制的研究已成為植物分子生物學等領域的研究熱點。該生物過程對于水稻抽穗期這一性狀起到積極作用。例如，主效基因的改變對于種質資源的遠途遷徙具有重要的調控作用，但當在相鄰省份或相近積溫帶進行種質資源引進時，我們就可以通過影響磷酸化

或泛素化過程，對該品種的抽穗期進行微調，以期更適應當地的地理環境和氣候條件，達到穩產、優質的效果。當然，對于整個水稻抽穗期調控網絡來說，關于這方面的研究還是較少且不夠深入，涉及到的許多機制尚不清晰。

首先，光周期是參與水稻開花時間的決定性因素，而溫度是決定開花時間的另一個重要的環境因素。在長日照和低溫條件下，、和的表達受到強烈抑制。有研究表明，適應高緯度地區的水稻品種具有光周期不敏感性和高溫響應[92]。然而，磷酸化與泛素化修飾是否參與到溫度調控水稻抽穗，我們尚不可知。

其次，在現已發現的磷酸化與泛素化修飾過程影響光周期途徑的調控機理有待深入研究。磷酸化與泛素化的研究尚未形成體系，糖基化等其他翻譯后修飾過程未報道。克隆更多的與抽穗期相關的基因，并開展他們之間的相互關系的研究，尋找新的修飾類型，深入研究其基因表達的分子機制應成為未來重點研究的對象。

再次，我們對現有的翻譯后修飾功能酶的認知仍局限在其結構和生理生化功能的表層認知，對于蛋白激酶磷酸化修飾等的具有廣譜性的下游底物挖掘，底物本身的信息和被修飾或去修飾之后所發生的變化，以及同一功能酶其在不同的信號通路中所發揮的重要作用的研究尚在初級階段。受翻譯后修飾的細胞周期變化和修飾蛋白豐度較低等因素影響，翻譯后修飾的位點時空特征仍不清楚；磷酸化與去磷酸化、泛素化與去泛素化等動態過程也為開展研究增加了難度；并且，由于同一蛋白可能受到多種翻譯后修飾，他們之間的相互關系與交叉作用也是非常值得探討的問題。

綜上所述，由于翻譯后修飾的普遍性、多樣性和復雜性等，對其在整體水平上認識還比較困難，所以對現已發現的磷酸化與泛素化修飾的作用機理以及生物學意義還有待進一步的研究。以上對參與水稻抽穗期的蛋白激酶、泛素連接酶、26S蛋白酶體等的結構、功能以及其作用的分子機制的分析將為水稻開花在翻譯后修飾水平上的調控研究提供新線索，并最終為完善水稻抽穗期的調控網絡提供新的思路和培育地域適應性強的水稻新品種提供理論依據。

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Advances in Research on the Modification of the Heading Date Genes in Rice by Phosphorylation and Ubiquitination Pathways

WANG Jingying1, 2, ZHAO Guangxin1, 2, QIU Guankai1, 2, FANG Jun1, 2, *

(1Northeast Institute of Geography and Agroecology, Chinese Academy of Sciences, Harbin 150081, China;2University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;*Corresponding author, E-mail: fangjun@iga.ac.cn)

Rice is a facultative short-day plant that is widely cultivated.Heading date (also known as flowering time) of rice is an important agronomic trait that directly affects grain yield and regional adaptability of rice varieties.Therefore, it is of great significance to study the influencing factors of this trait and make the plants bloom at appropriate time.Heading date, as a complex quantitative trait, is regulated by internal genetic network and exogenous factors such as photoperiod and temperature.At present, several key genes controlling heading date have been identified and cloned.It is found that phosphorylation and ubiquitylation play an important role in the molecular mechanism of rice heading date.This paper introduces the molecular mechanism of photoperiod pathway of heading date, and expounds the progress in research on the regulation of phosphorylation cascade and ubiquitin 26S proteasome system on flowering time, aiming at laying a theoretical basis and providing practical guidance for the new mechanism in regulating heading date, and for regional adaptability of improved varieties.

rice; heading date; phosphorylation; ubiquitylation

10.16819/j.1001-7216.2022.210707

2021-07-20;

2021-09-06。

國家自然科學基金資助項目(U20A2025); 省院科技合作專項(2021SYHZ0032)。