基于網絡藥理學探討植物雌激素類中藥單體對心肌缺血再灌注損傷的作用機制

王禹萌，壽鑫甜，范宗靜，崔 杰，薛棟華，吳 旸

溶栓及經皮冠狀動脈介入治療(PCI)等及時有效的再灌注治療可以最大限度地縮短心肌缺血時間，使心肌灌注得到改善，降低ST段抬高型心肌梗死(STEMI)的發病率和病死率，但該過程也可使心肌功能失調、結構損壞，誘發心肌電活動紊亂，進一步加重缺血心肌的損傷和死亡[1]。目前，仍無有效方法預防、治療心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)。近年來多項研究表明，心血管疾病風險的增加與絕經期間雌激素水平的迅速降低有關，雌激素在冠心病的預防和發生發展中具有重要作用[2-4]。雌激素可多方面地減輕心肌缺血再灌注損傷[5-7]、保護心臟，但大量、長期的使用會增加婦科腫瘤及中風的風險[8]，因此不被臨床廣泛使用。

植物雌激素是一類天然的非甾體類化合物，可與雌激素受體結合發揮類雌激素樣作用，同時其副作用的發生率低。目前，多項研究報道了中藥類植物雌激素單體或含有植物雌激素的中藥可顯著改善心肌缺血再灌注損傷，植物雌激素因其作用多靶點、副作用少等優點成為目前針對心肌缺血再灌注損傷的研究熱點。源于中藥的植物雌激素包括黃酮類、木脂素類、香豆素類、萜類、甾體類等，在人參、三七、葛根、丹參、川芎等益氣活血中藥中廣泛存在。本研究擬通過網絡藥理學方法對植物雌激素類中藥單體治療心肌缺血再灌注損傷的潛在靶點和作用機制進行分析，以期為該角度進行心肌缺血再灌注損傷的實驗研究及臨床用藥提供依據。

1 資料與方法

1.1 數據檢索 檢索PubMed、中國知網全文數據庫(CNKI)自建庫至2020年12月在植物雌激素范疇內查找已通過動物實驗或臨床研究驗證的對心肌缺血再灌注損傷有積極干預作用的中藥單體，在PubChem數據庫查詢并匯總其結構圖。

1.2 對相關中藥單體成分的靶點預測 PharmMapper數據庫可以用藥效團映射的方法識別給定探針的小分子化合物的潛在候選靶點[9-11]。使用PharmMapper數據庫對以上中藥單體成分進行靶點預測。將中藥單體的結構圖分別上傳，得到與其最佳匹配的靶點信息，取Normalized Fit≥0.7的所有靶點作為對心肌缺血再灌注損傷有效的中藥類植物雌激素靶點。

1.3 對疾病靶點的預測 在GeneCard、OMIM數據庫中以“myocardial ischemia-reperfusion injury”和“myocardial reperfusion injury”為關鍵詞進行疾病的靶點篩選。

1.4 共同靶點的獲得 通過 R 軟件VennDiagram程序包，繪制Venn圖獲得中藥類植物雌激素治療心肌缺血再灌注損傷的潛在靶點。

1.5 相關中藥單體成分-核心靶點網絡構建 將共同靶點輸入至軟件Cytoscape 3.6.1中，繪制中藥單體與交集靶點的網絡圖。

1.6 蛋白質相互作用網絡的構建 蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)是體現蛋白與蛋白之間相互關系的網絡圖。將交集靶點在線導入STRING數據庫，得到蛋白與蛋白間的互作信息導入Cytoscape3.6.1軟件，通過network analysis功能分析得到各網絡節點間的拓撲關系，對靶點篩選后得到最終的PPI網絡。

1.7 基因本體(GO)與京都基因和基因組百科全書(KEGG)富集分析 設置R軟件P<0.05，從“org．Hs．eg．db”數據庫進行 GO與KEGG富集分析。安裝“clusterProfiler”“pathview”“DOSE”等程序包，利用R軟件運行GO和KEGG腳本，得到GO分析柱狀圖和數據結果、KEGG的氣泡圖和相關數據。

2 結 果

2.1 有效成分的選擇 通過檢索中英文文獻，最終在植物雌激素范疇內共發現10個中藥單體對心肌缺血再灌注損傷有效，分別是染料木素[12](genistein)、槲皮素[13](quercetin)、三七皂苷R1[14](notoginsenoside R1)、白藜蘆醇[15](resveratrol)、葛根素[16](puerarin)、丹參酮ⅡA[17](tanshinone ⅡA)、人參皂苷Rb1[18](ginsenoside Rb1)、人參皂苷Rb3[19](ginsenoside Rb3)、人參皂苷Re[20](ginsenoside Re)、人參皂苷Rg1[21](ginsenoside Rg1)。

2.2 中藥單體靶點的獲得 通過在PharmMapper上對以上單體進行檢索，共獲得515個Normalized Fit≥0.7的中藥單體靶點，其中染料木素96個、槲皮素52個、三七皂苷R1 35個、白藜蘆醇26個、葛根素66個、丹參酮ⅡA 50個、人參皂苷Rb1 51個、人參皂苷Rb3 58個、人參皂苷Re 41個、人參皂苷Rg1 40個。

2.3 疾病靶點的獲得 通過GeneCard數據庫及OMIM數據庫進行心肌缺血再灌注損傷靶點的查找，剔除重復靶點后共預測出1 069個疾病靶點。詳見圖1。

2.4 共同靶點的獲得 將上述所有中藥單體靶點進行合并，并剔除重復靶點后共獲得144個作為植物雌激素類中藥單體的核心靶點，通過Venn圖獲得57個交集靶點。詳見圖1。

圖1 植物雌激素類中藥單體-疾病靶點Venn圖

2.5 中藥單體-交集靶點網絡的構建 繪制中藥單體成分與交集靶點的網絡見圖2。圖中共有67個節點(10個有效成分，57個交集靶點)和186條邊，其中，染料木素對應靶點16個、槲皮素23個、三七皂苷R1 19個、白藜蘆醇12個、葛根素27個、丹參酮ⅡA 25個、人參皂苷Rb1 20個、人參皂苷Rb3 22個、人參皂苷Re 15個、人參皂苷Rg1 17個。其中雌激素受體1(ESR1)對應7個中藥單體，分別是染料木素、槲皮素、白藜蘆醇、丹參酮ⅡA、葛根素、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3；表皮生長因子受體(EGFR)對應7個中藥單體，分別是染料木素、槲皮素、白藜蘆醇、丹參酮ⅡA、葛根素、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rg1。

圖2 植物雌激素類中藥單體-交集靶點的網絡圖

2.6 PPI網絡的構建 將交集靶點導入STRING數據庫得到蛋白間互作信息，再導入Cytoscape 3.6.1軟件，通過度值(Degree)來調整節點大小、顏色。共55個節點、275條邊，節點越大、顏色越深，代表該靶點蛋白與其他靶點蛋白的相互作用越多，前12位依次是血清清蛋白(ALB)、EGFR、胱天蛋白酶3(CASP3)、絲裂原激活的蛋白激酶1(MAPK1)、絲裂原激活的蛋白激酶8(MAPK8)、熱休克蛋白90AA1(HSP90AA1)、內皮一氧化氮合成酶(NOS3)、原癌基因酪氨酸蛋白激酶(SRC)、膜聯蛋白A5(ANXA5)、絲裂原激活的蛋白激酶14(MAPK14)、ESR1、血管內皮生長因子受體2(KDR)。詳見圖3。

圖3 植物雌激素類中藥單體治療心肌缺血再灌注損傷靶點的PPI網絡

2.7 GO和KEGG富集分析 對57個靶點進行GO功能富集分析，所涉及的生物過程有85個，如內肽酶活性(endopeptidase activity)、核受體活性(nuclear receptor activity)、配體激活轉錄因子活性(ligand-activated transcription factor activity)、絲氨酸型內肽酶活性(serine-type peptidase activity)。對所富集的基因數排序后前20位進行可視化分析，詳見圖4。柱狀長度越長提示所富集的基因越多，顏色越紅提示P值越小，富集程度越高。

圖4 植物雌激素類中藥單體治療心肌缺血再灌注損傷的GO功能富集分析柱狀圖

對57個靶點進行KEGG通路分析，所涉及的信號通路有73條。顯著性較高的有雌激素信號通路(estrogen signaling pathway)、流體剪切應力與動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、細胞凋亡(apoptosis)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、血管內皮生長因子(VEGF)信號通路(VEGF signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)。以P值排序，顯著性程度由高到低前20條所示如圖5。氣泡越大，說明富集基因越多，顏色越紅代表P值越小，相關性越高。

圖5 植物雌激素類中藥單體治療心肌缺血再灌注損傷的KEGG通路富集分析氣泡圖

3 討 論

隨著醫療技術水平的提升，我國急性心肌梗死病人閉塞血管開通率明顯上升，心肌缺血再灌注損傷增加，減輕心肌缺血再灌注損傷已成為此類疾病防治研究的重點，尋找有效的治療方法更是成為了研究熱點[22]。中醫藥在治療心肌缺血再灌注損傷方面發揮了重要作用。本課題組前期臨床研究發現，含有黃芪、丹參等藥物的益氣活血生肌方可以改善氣虛血瘀證冠心病病人PCI術后胸悶、氣短、乏力等癥狀，降低西雅圖心絞痛量表評分，從而提高病人生活質量[23-24]。劉元梅[25]研究發現，含有三七、葛根、仙茅、淫羊藿等藥物的逍遙二仙湯可輔助改善絕經后冠心病伴抑郁的女性病人心絞痛癥狀及心電圖缺血表現。動物實驗方面，二仙湯能增強去卵巢大鼠心肌的抗氧化能力，降低鈣超載和補充大鼠體內雌激素水平，改善心肌功能，從而減輕心肌缺血再灌注損傷[26]。不同的中藥方劑可通過辨證論治從不同的中醫理論角度或通過實驗從不同的分子機制改善心肌缺血再灌注損傷，特別是對于缺乏雌激素保護機制的心肌缺血再灌注損傷，而這些方劑大多包括了三七、葛根等以植物雌激素為主要成分的中藥，說明植物雌激素可能在心肌缺血再灌注損傷的治療中發揮了潛在作用。

本研究通過檢索中英文文獻數據庫，在植物雌激素范疇內發現10味中藥單體對心肌缺血再灌注損傷有效，且已經得到實驗驗證。其中，染料木素、槲皮素、葛根素是黃酮類的植物雌激素，是葛根、川芎、甘草等中藥的主要成分；三七皂苷R1、丹參酮ⅡA以及人參皂苷Rb1、Rb3、Re、Rg1成分是三七、丹參、人參等益氣活血中藥的組成成分，屬于萜類；而白藜蘆醇是鞣質類的植物雌激素，存在于虎杖、桑白皮等中藥中。在中藥單體-交集靶點網絡中，葛根素對應的靶點最多，為27個，其次是丹參酮ⅡA、槲皮素、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rb1，對應靶點均在20個以上，提示以上5種中藥單體可能對心肌缺血再灌注損傷的治療有較好的作用。大量實驗研究表明，葛根素可通過抑制炎癥反應[16]、減少氧化應激[27]、抑制細胞凋亡[28]等發揮抗心肌缺血再灌注損傷的作用；丹參酮ⅡA則可抑制氧化應激和炎癥反應[17]；槲皮素可以減少氧化應激和鈣超載[29]，降低炎性因子水平[13]，改善心肌細胞凋亡[30]，從而減輕心肌缺血再灌注損傷。人參皂苷Rg1成分則可通過調節能量代謝的途徑改善心肌缺血再灌注損傷[21，31]。而氧化應激、鈣超載、能量代謝障礙、炎癥反應、細胞凋亡等已被證實是心肌缺血再灌注損傷的重要發病機制[32-33]。

PPI網絡拓撲分析篩選得到的12個核心靶點均存在著相互作用關系。ESR1(ERα)是心臟中的3種雌激素受體之一，在心肌細胞的胞質、胞核和膜室及心肌成纖維細胞中廣泛存在，在心房中的分布更為密集[34-35]。Booth等[36]證實，ESR1的激活是雌激素發揮心臟保護作用的重要環節。Wang等[37]研究也證明，基因敲除ESR1(ER1KO)的雌性小鼠心肌缺血再灌注后損傷較野生型小鼠重，可見ESR1在心肌缺血再灌注損傷中十分重要。NOS3主要分布于冠狀血管及心腔面的內膜，其過表達可減輕氧化應激；還可以減輕鈣超載、抑制炎性反應，改善心肌缺血再灌注損傷；雌激素及雌激素受體選擇性激動劑可以增強NOS活性從而加強一氧化氮信號傳導，保護心臟[38]。EGFR(ErbB)是一種受體型酪氨酸激酶，與血管新生有重要關系[39]。研究發現，心肌缺血再灌注損傷會出現EGFRmRNA上調，而心肌特異性人表皮生長因子受體(ERBB1)信號傳導在心肌缺血再灌注損傷中具有心臟保護作用[40-41]。此外，研究還發現，大鼠心肌缺血再灌注損傷的發生同時伴有p38 MAPK磷酸化，且使Bax/Bcl-2比值、Caspase-3水平升高，這也是細胞凋亡的標志，而MAPK抑制劑可以抑制該過程從而減輕大鼠的心肌缺血再灌注損傷[42]。由此可見，以上靶點蛋白在心肌缺血再灌注損傷的發生與治療的不同過程中起重要作用，不僅單獨發揮作用，還相互協作形成一個復雜的調控網絡，通過減少氧化應激、減少細胞凋亡等機制對心肌缺血再灌注損傷進行干預。

GO功能富集分析提示靶點基因主要富集在內肽酶活性、核受體活性、配體激活轉錄因子活性、絲氨酸型內肽酶活性等生物過程，KEGG分析則篩選出了20條重要的信號通路，如雌激素信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、VEGF信號通路、MAPK信號通路等。雌激素在體內可通過與雌激素受體(ER)結合和基因組信號傳導兩種途徑發揮心血管保護作用。經典的ER轉導途徑是配基依賴型ER激活方式，雌激素與ER結合后調節細胞核中的基因轉錄，或激活胞質中的激酶；ER信號還可與胞內其他信號轉導通路產生交叉對話，如ER可以激活Src/Ras/ERK通路，ERα可直接作用于c-SRC使其活化，隨后通過磷酸化MAPK通路分為Erk1和Erk2；同時MAPK通路可磷酸化ER，雌激素能夠激活MAPK信號通路的上游環節Src/Ras/ERK通路；反之，活化的MAPK通路又能通過磷酸化作用，調節ER的轉錄活性，再如，活化的EGFR也可激活MAPK通路，使ER非配基依賴性活化[43]。而MAPK/p38/JNK/ERK通路的激活可抑制炎性相關因子的表達，保護心肌細胞，改善心肌缺血再灌注損傷[44]。此外，流體剪切應力可以激活內皮型一氧化氮合酶(eNOS)，提高其活性，也可以激活血管內皮生長因子A(VEGFA)，可改變內皮細胞的形態和生物力學效應，從而恢復心肌缺血再灌注損傷所致的內皮功能紊亂情況[45-46]。IL-17A的抑制作用會顯著降低心肌缺血再灌注損傷后相關因子的表達，從而減輕炎癥反應和細胞損傷，提示抑制Hmgb1-IL-23/IL-17通路可以在心肌缺血再灌注損傷中起保護作用[47]。綜上所述，植物雌激素類中藥單體可能是通過多種重要信號通路發揮抗心肌缺血再灌注損傷的作用，雌激素信號通路與各信號通路發生著各種各樣的交叉對話，由此可推測雌激素信號通路可能是關鍵通路，但目前仍待進一步實驗研究證實。

本次研究基于植物雌激素理論，利用網絡藥理學方法多角度地研究了相關中藥單體治療心肌缺血再灌注損傷可能的靶點及信號通路。研究發現其核心靶點為EGFR、MAPK1、SRC、ESR1等，參與的主要生物過程包括核受體活性、配體激活轉錄因子活性，推測作用機制的核心是通過雌激素受體信號通路的兩種途徑，以及其他信號通路多靶點、多通路而發揮作用。本研究為闡明植物雌激素類的中藥單體治療心肌缺血再灌注損傷機制提供了研究切入點，為其后續實驗研究和臨床用藥提供思路和科學依據。