基于網絡藥理學和分子對接探討真武湯治療擴張型心肌病的作用機制

孫斯嘉，冼紹祥，楊忠奇，尹克春，袁天慧

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一種以心室擴大和心肌收縮功能降低為特征的異質性心臟病，臨床上常可引起心力衰竭、心律失常和猝死[1]。由于擴張型心肌病初診后5年內病死率高，以及可能需要進行心臟移植，對社會和家庭造成了巨大的經濟負擔[2]。

黃春林教授認為，本病的主要病機為本虛，在于心、腎、脾陽虛，涉及氣、血、水三者病變，主張結合現代醫學研究治療，在通陽化氣的基礎上，將本病分為心氣虛弱、陽氣虛脫、陽虛水泛、水氣凌心、痰熱困肺、心脈不整、心血瘀阻7種證型，其中陽虛水泛證，治以溫陽利水，多用真武湯加減，黃春林教授在運用真武湯加減治療擴張型心肌病時，還特別注重心腎并調，氣血水同治，故臨床療效尤為顯著[3]。鞠靜等[4]研究表明，真武湯能夠明顯改善病人心臟功能，減輕臨床癥狀及并發癥，提高生活質量，且優于單純西藥治療。李崢等[5]通過觀察真武湯對轉基因擴張型心肌病小鼠心肌組織Atp2a2、Col1a1基因及蛋白的表達變化，得出真武湯能明顯上調轉基因擴張型心肌病小鼠心肌組織中Atp2a2 mRNA及蛋白表達，下調Col1a1 mRNA及蛋白表達，結果表明真武湯通過抑制心肌細胞凋亡、抑制心肌纖維化，改善心室重構，進而改善心功能，達到治療擴張型心肌病的作用。雖然，目前單一藥物及靶點模型研究已取得了較大成功，但同時也存在局限性，由于疾病在病理上是與多種途徑、多種基因及多種蛋白的相互作用，因此，在許多情況下，治療是無法通過靶向單一通路或基因、蛋白來實現的[6]。本研究借助網絡藥理學及分子對接的方法，旨在通過研究疾病、藥物、靶點和作用途徑之間的復雜多樣關系，為進一步探討真武湯治療擴張型心肌病提供理論依據及數據支持。

1 資料與方法

1.1 真武湯活性化合物成分的篩選及作用靶點 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php)依次檢索真武湯中的5味中藥(附子、茯苓、白術、生姜、白芍)，并設置口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18[7]，篩選出化學性質穩定且藥代動力學良好的化合物，作為真武湯的有效成分。并通過TCMSP和Swiss Target Prediction對有效成分進行靶點預測。最后利用UniProt數據庫(https：//www.uniprot.org/)中的Retrieve/ID mapping將收集的靶點蛋白統一轉換成基因名。

1.2 擴張型心肌病的作用靶點及潛在靶點的獲取 分別檢索在線人類孟德爾遺傳數據庫(OMIM，online mendelian inheritance in man，https：//www.omim.org/)、基因名片數據庫(GeneCard，http：//www.genecards.org/)、TTD數據庫(therapeutic target database，http：//db.idrblab.net/ttd/)、毒性與基因比較數據庫(CTD，the comparative toxicogenomics database，http：//ctdbase.org/)、遺傳藥理學和藥物基因組學數據庫(PharmGKB，https：//www.pharmgkb.org/)獲取擴張型心肌病的相關基因，設置關鍵詞為“dilated cardiomyopathy”，將檢索獲取的靶點整理去重，得到的靶點即為擴張型心肌病相關靶點。將真武湯有效成分靶點和擴張型心肌病的靶點上傳至Venn平臺(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制韋恩圖，并保存取交集的基因，即為真武湯治療擴張型心肌病的潛在靶點。

1.3 蛋白互作網絡的構建 將真武湯治療擴張型心肌病的潛在靶點導入STRING數據庫(https：//www.string-db.org/)，選擇Multiple proteins，物種限定為“Homo sapiens”，設置置信度“minimum required interaction score”為“high confidence(0.700)”，獲取治療靶點的蛋白相互作用網絡。將蛋白互作網絡導入Cytoscape 3.8.0進行可視化并分析。

1.4 真武湯中藥-潛在化合物-潛在靶點可視化網絡的構建 利用真武湯中藥、潛在化合物、潛在靶點構建中藥-潛在化合物-潛在靶點網絡，并將其導入Cytoscape 3.8.0軟件進行可視化分析。

1.5 潛在靶點的基因本體(GO)功能注釋和京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 應用RStudio的ClusterProfiler包對潛在靶點進行GO功能注釋及KEGG通路富集分析，并利用RStudio的ggplot2包繪制GO柱狀圖及KEGG氣泡圖，最后利用Pathview包進行代謝途徑整合和可視化。

1.6 分子對接驗證 利用分子對接實驗對關鍵蛋白和化合物的結合活性進行驗證，主要步驟包括配體小分子的處理和受體蛋白的準備以及利用AutoDock Vina對潛在化合物成分和關鍵靶點進行分子對接實驗。①配體小分子處理：首先從TCSMP數據庫下載潛在化合物成分的3D結構文件，并保存為mol2格式，利用Open Babel為分子結構加氫原子，選擇PH7.2、MMFF94力場，進行加電荷和能量最小化，最后利用Autodock Tools將處理過的化合物轉化為pdbqt格式文件。②受體蛋白的準備：首先從RCSB蛋白質結構(PDB)數據庫(http：//www.rcsb.org/)獲取等待對接的靶點蛋白的晶體結構，然后將晶體結構導入軟件PyMol 2.4.0，去除溶劑分子和雜質，并將關鍵靶點蛋白與配體分離，最后利用PyMol插件GetBox確定對接盒子的中心及大小。③利用AutoDock Vina依次將潛在化合物成分與關鍵靶點蛋白進行分子對接，并獲取對接打分，選取負數絕對值最高的潛在化合物與關鍵靶點蛋白的對接模式，最后利用PyMol對結合模式作結合模式圖。

2 結 果

2.1 真武湯活性化合物篩選及作用靶點收集 通過TCMSP數據庫依次檢索真武湯中5味中藥，設置OB≥30%及DL≥0.18后，得到真武湯活性化合物共59種，其中附子含有活性成分21種，茯苓含有活性成分15種，白術含有活性成分7種，生姜含有活性成分5種，白芍含有活性成分13種，β-谷甾醇是白芍和生姜共有的活性成分，谷甾醇是附子和白芍共有的活性成分(見表1)。通過TCMSP及Swiss Target Prediction數據庫檢索到相應的靶點共259個，其中附子對應的靶點有144個，茯苓對應的靶點有69個，白術對應的靶點有31個，生姜對應的靶點有69個，白芍對應的靶點有111個。

表1 真武湯活性化合物成分

(續表) 真武湯活性化合物成分

2.2 擴張型心肌病的靶點收集及潛在靶點的獲取 通過OMIM、GeneCards、TTD、CTD、PharmGKB數據庫檢索擴張型心肌病的相關基因，去重整理后得到擴張型心肌病的靶點共980個。將擴張型心肌病相關靶點與真武湯藥物相關作用靶點分別導入Venn平臺得到交集基因47個，這47個交集基因即為真武湯治療擴張型心肌病的潛在靶點。詳見圖1。

圖1 藥物-疾病共有靶點韋恩圖

2.3 網絡的構建

2.3.1 蛋白互作網絡(PPI)的可視化分析 將獲取的47個潛在治療靶點導入STRING數據庫獲取蛋白互作網絡并導入Cytoscape 3.8.0軟件繪制蛋白互作網絡圖(見圖2)，節點的大小反映度值的大小，度值排名前11位的節點分別為白細胞介素6(IL6)、腫瘤壞死因子(TNF)、轉錄激活因子3(STAT3)、表皮生長因子受體(EGFR)、內皮一氧化碳合酶(NOS3)、轉錄激活因子1(STAT1)、胱天蛋白酶3(CASP3)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、磷脂酰肌醇-3激酶催化亞單位α(PIK3CA)、過氧化物酶增生激活受體(PPARG)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)(見表2)，這些靶點在蛋白互作網絡中具有重要的地位，可能是真武湯治療擴張型心肌病的關鍵靶點。

圖2 PPI蛋白互作網絡圖

表2 真武湯治療擴張型心肌病的主要作用靶點(度值)

2.3.2 中藥-有效成分-治療靶點的可視化分析 將構建的中藥-潛在化合物-潛在靶點導入Cytoscape3.8.0軟件中進行可視化處理(見圖3)。君藥附子對應的化合物有17個，潛在靶點有26個；臣藥茯苓和白術對應的化合物有14個，潛在靶點有14個；佐藥生姜和白芍對應的化合物有10個，潛在靶點有31個；其中化合物度值排名前7位的分別是山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、6-Demethyldesoline、去甲烏頭堿、3β-乙酰氧基蒼術酮、芍藥新苷(見表3)，這些化合物靶向了較多的擴張型心肌病相關基因，可能是真武湯治療擴張型心肌病的關鍵化合物。君藥(附子)和佐藥(生姜、白芍)，君藥(附子)和臣藥(茯苓、白術)，臣藥(茯苓、白術)和佐藥(生姜、白芍)均具有較多重疊靶點，說明真武湯各組藥物之間不僅單獨發揮治療作用，還具有相互協同的治療作用。

圖3 真武湯中藥-有效成分-潛在靶點網絡圖

表3 真武湯治療擴張型心肌病前7位關鍵化合物

2.4 潛在靶點的GO功能注釋和KEGG通路富集分析 應用RStudio的ClusterProfiler包對47個潛在靶點進行GO功能注釋和KEGG通路富集分析。GO富集分析得到生物過程(biology process，BP)共943條、細胞組分(cellular component，CC)共15條和分子功能(molecular function，MF)共40條，每部分排名前10位如圖4所示，由圖可知其中主要的生物過程是循環系統中的血管病變、血壓負調節、血壓調節、白細胞和細胞黏附、第二信使介導的信號通路、活性氧代謝過程、血液循環的調節、類固醇激素反應等。KEGG富集分析得到120條信號通路，其中排名前20位的通路如圖5所示，主要涉及晚期糖基化終末產物-糖基化終末產物受體(AGE-RAGE)信號通路(見圖6)、缺氧誘導因子-1(HIF-1)信號通路、弓形蟲病、脂肪細胞脂解調節、腎素分泌、鈣信號通路等信號通路。

圖4 GO富集分析

圖5 KEGG通路富集分析

圖6 AGE-RAGE信號通路圖

2.5 分子對接驗證 利用AutoDock Vina對篩選出的41個關鍵化合物與PPI網絡中度值排名前5位的關鍵基因(IL6、NOS3、TNF、EGFR、STAT3)依次進行分子對接驗證。其中，關鍵蛋白的晶體結構信息見表4。

表4 靶蛋白及原配體信息

結合能(affinity)是AutoDock Vina評價小分子與蛋白質結合程度的主要標準，結合能小于0說明配體與受體可以自發結合，且結合能絕對值越大，說明配體與靶蛋白受體結合越穩定，當分值大于 5 時說明分子與靶點有較好的結合活性，分值大于7則說明分子與靶點的結合構型具有強烈的活性[8-9]。本研究分子對接驗證表明，有效化合物均能很好地與5個關鍵基因進行對接，其結合能分值的最大值均大于7(見表5)，對關鍵殘基及其作用力分析后，選取結合能分值最大的化合物與靶點蛋白作結合模式圖(見圖7)。

表5 分子對接結果

圖7 分子對接結合模式圖

3 討 論

真武湯出自張仲景的《傷寒雜病論》，主治脾腎陽虛、水飲內停之證以及太陽病發汗太過、陽虛水泛證。全方由附子為君，溫腎陽以化氣行水，并可散寒止痛兼暖脾陽以運水濕；茯苓、白術皆為臣，茯苓淡滲利濕，白術健脾燥濕；生姜、白芍為佐，生姜助附子溫陽散寒，合茯苓散水，又可和胃降逆止嘔，白芍則利小便行水氣，兼斂陰舒筋解肌肉瞤動，還可防附子燥熱傷陰之弊。

由于擴張型心肌病病因及病情較為復雜，目前尚無特異性治療方案，故臨床上多以對癥治療為主，西醫方面主要包括強心、利尿、擴血管治療，而對于終末期病人主要是采用左室減容術、人工心臟輔助機械泵裝置、心臟移植等外科手術治療[10-11]。沉重的醫療負擔及不良反應頻發，嚴重影響擴張型心肌病心力衰竭病人的治療效果[12]。中醫藥因其整體觀念和辨證論治的特點，其治療擴張型心肌病具有獨特優勢，且中西醫結合治療更是在改善預后方面療效明顯[13]，真武湯作為溫陽利水的代表方，現代藥理學研究表明附子不僅具有明顯的強心作用，還可以改善外周及冠狀動脈循環[14]；茯苓可以改善慢性心力衰竭大鼠尿潴留和心臟功能，還可以緩解腸道微循環障礙，阻止血小板聚集，避免微血栓形成[15]；白術具有免疫調節及抗炎作用，多作為臣藥應用于心血管病的治療[16]；生姜具有抗氧化、抗炎及抑菌作用[17]；白芍具有抗炎、保肝、鎮痛、養血等藥理作用[18]。然而以上5味中藥整體治療擴張型心肌病的作用機制尚不明確，因此，本研究借助網絡藥理學方法，以求更深入地探討真武湯治療擴張型心肌病的作用機制。

通過分析中藥-化合物-靶點網絡可知山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、去甲烏頭堿、3β-乙酰氧基蒼術酮、芍藥新苷是真武湯治療擴張型心肌病的關鍵化合物，研究表明，山奈酚具有抗氧化、抗病毒、抗菌、抗炎、增強免疫及保護損傷組織的作用[19]；β-谷甾醇、豆甾醇均屬于植物中最常見、最重要的甾醇類成分，其中β-谷甾醇除了抗炎及免疫調節作用，還具有很強的抗遺傳毒性及抗氧化活性[20]，而豆甾醇則能顯著降低炎性因子的表達，具有良好的抗炎活性[21]；去甲烏頭堿是附子主要的強心成分之一，其活性極強，可以增強心肌收縮力，加快心率，增強心臟輸出量及心肌耗氧量[22]；蒼術酮是白術揮發油中的主要物質之一，其對細胞炎癥反應具有顯著抑制作用[23]；現代藥理學研究證實芍藥新苷具有抗炎、免疫調節、鎮靜、鎮痛、耐缺氧、抗氧化、抗心肌缺血、抗血栓作用[24]。

通過PPI網絡分析得到度值排名前5位的關鍵靶點為IL6、TNF、STAT3、EGFR、NOS3。現代研究表明，在病毒性心肌炎的感染早期，IL6通過增加巨噬細胞浸潤，降低TNF-α和單核細胞趨化蛋白-1水平，限制病毒復制和調節早期炎癥反應，從而減輕心肌損傷，但隨著炎癥持續蔓延，IL6過度表達則可加重心肌損害[25]。STAT3作為激酶信號轉導和轉錄激活因子家族的重要成員，對擴張型心肌病病程發展具有保護作用，有研究表明在用呋喃唑酮構建大鼠擴張型心肌病的模型中，由于鈣網蛋白表達，下調STAT3通路的磷酸化，因而導致了顯著心肌變性、間質纖維化和線粒體腫脹[26]。EGFR是一種廣泛分布于人體各組織細胞膜上的重要跨膜受體，EGFR通路的激活能夠促使心肌肥大、炎癥及纖維化的發生，最終發展為心力衰竭[27]。NOS3是一種內皮源性一氧化氮，其在調節血管壁功能和心血管穩態方面起著關鍵作用，心肌NOS表達的研究表明，擴張型心肌病終末期心力衰竭病人中NOS3表達上調[28]，可通過限制鈣離子內流對心肌有一定的保護作用，從而預防心律失常和心肌肥厚的發生[29]。上述靶點在PPI互作網絡中具有重要地位，在擴張型心肌病的發生發展中具有重要作用，因此，本研究推測真武湯可能是通過山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、去甲烏頭堿、3β-乙酰氧基蒼術酮、芍藥新苷等關鍵成分作用于上述5種關鍵靶點從而實現治療作用。

通過KEGG通路富集分析得到真武湯治療擴張型心肌病主要涉及AGE-RAGE 、HIF-1、弓形蟲、脂肪細胞脂解、腎素分泌、鈣離子等信號通路。晚期糖基化終產物受體RAGE是一種多配體的膜受體，與不同配體結合后可以啟動多條信號通路，引起細胞內氧化應激和炎癥反應，破壞細胞膜蛋白功能，引起鈣離子內流，從而導致細胞結構、功能及代謝的異常，甚至細胞凋亡[30]。研究表明，晚期糖基化終產物AGE及其細胞受體RAGE相互作用對心臟功能障礙和糖尿病性心肌病的發作至關重要[31]。缺氧誘導因子1α(HIF-1α)對機體內氧穩態平衡的調節起到維持作用，促使機體對缺氧產生代償適應。心力衰竭病人的心肌處于缺氧狀態，HIF-1α的表達增加，可通過調節血管內皮生長因子等促進新血管形成，增加低氧局部的血流量來增加氧供，以及參與葡萄糖的攝取和糖酵解，在低氧狀態下改善心肌細胞的能量代謝；此外，HIF-1α還能介導一氧化氮合酶、腎上腺素受體等參與血管張力的調節，發揮擴血管作用，從而實現心肌保護[32-34]。但也有研究表明，過度、持續地激活HIF-1α會導致心肌肥厚，降低心臟病病人的心功能，甚至加重心肌病的發生[35]。感染也被認為是擴張型心肌病的重要病因之一，其中柯薩奇B病毒、弓形蟲和其他某些病毒感染是主要的病因。有研究表明弓形蟲在免疫系統受損的病人中存在一種特殊的感染形式，該類病人通常在數年前就已獲得感染，其中緩殖子在組織囊腫中一直處于休眠狀態，直到免疫抑制再次激活感染，最終發展成為心肌病及心力衰竭[35-36]。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學及分子對接技術，初步探討了真武湯治療擴張型心肌病的多靶點、多通路的作用機制。真武湯可能通過β-谷甾醇、山奈酚、3β-乙酰氧基蒼術酮、去甲烏頭堿、芍藥新苷等關鍵活性成分作用于IL6、TNF、STAT3、EGFR、NOS3等關鍵靶點，通過調節AGE-RAGE 、HIF-1、弓形蟲、脂肪細胞脂解、腎素分泌、鈣離子等信號通路，產生抑制氧化應激及炎癥、改善心肌能量代謝、調節免疫功能等機制發揮綜合治療作用。但本研究同時也存在一定的局限性，如由于數據庫的限制及算法的差異，得出的結論不免有所偏差，因此，尚需進一步動物實驗或臨床驗證。