靈芝多糖對心力衰竭大鼠心肌能量代謝和心肌纖維化的影響

朱嬌玉，姚 樂，趙 浩，江艷芬

心力衰竭主要是由于心臟組織結構或功能發生改變，導致心臟的射血能力或心室充盈能力降低而引起的心血管臨床綜合征[1]。隨著我國老齡化越來越嚴重，心力衰竭已經成為威脅人類生命健康的重要原因。研究顯示，心肌能量代謝異常、血流動力學改變能夠誘導心肌纖維化的發生，這被認為是心力衰竭發生的關鍵環節[2]。正常狀態下的心肌細胞能量代謝十分旺盛，而在心力衰竭病人體內，常常存在心肌線粒體功能改變，導致能量代謝異常[3]。靈芝屬于多孔菌科植物紫芝和赤芝干燥的子實體，有較多生物學活性，對機體免疫系統、氧化系統等均有治療功效[4]。靈芝多糖作為靈芝的活性成分，具有抗腫瘤、降血壓、調節免疫力、保護肝臟等作用[5]。以往研究發現，靈芝多糖對心肌損傷也有治療作用，其可以保護缺血引起的心肌損傷[6]。靈芝多糖對高血糖引起的心肌纖維化有抑制功效，對心臟有保護作用[7]。研究表明，靈芝多糖發揮生物學作用與信號通路有關[8]。靈芝多糖能夠通過降低p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號通路的激活水平改善急性肺損傷[9]。p38MAPK是一個多功能信號轉導通路，在很多生理和病理過程中發揮關鍵作用[10]。p38MAPK在心力衰竭中高表達，并且下調p38MAPK信號通路抑制心肌損傷[11]。本研究探討靈芝多糖對心力衰竭心肌能量代謝和纖維化的影響，以期為靈芝多糖治療心力衰竭提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 靈芝多糖購自西安明澤生物科技有限公司；線粒體分離試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；p38抗體、p-p38抗體購自北京義翹神州科技股份有限公司；轉化生長因子-β1(TGF-β1)抗體購自南京歐凱生物科技有限公司；RM6420生理信號采集處理系統購自成都儀器廠；Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司。SD大鼠(體重180～220 g)購自上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.2 模型構建和分組 根據文獻[2]構建心力衰竭大鼠模型。腹腔注射氯胺酮(50 mg/kg)及地西泮(5 mg/kg)將大鼠麻醉，然后將大鼠仰臥固定至手術臺上，剪去腹部的毛，消毒后，在腹部的正中間位置將皮膚切開，沿著腹部的白線將肌肉層切開，以生理鹽水浸泡后的紗布蓋住創面，將膈肌下的腎動脈分支分離，以棉線穿到腹主動脈下面區域，取直徑為1 mm的軟管放在腹主動脈上，然后用棉線把導管和腹主動脈結扎，將血流完全阻斷，抽出導管，導管直徑就是結扎以后的腹主動脈內徑。縫合創面，消毒，肌肉注射青霉素，觀察動物清醒以后送回動物房繼續飼養。將建模成功的心力衰竭大鼠模型分成模型組、靈芝多糖-1組、靈芝多糖-2組、曲美他嗪組。曲美他嗪組大鼠按5.4 mg/kg曲美他嗪灌胃，靈芝多糖-1組、靈芝多糖-2組大鼠按3.0 g/kg、6.0 g/kg靈芝多糖灌胃，每日1次，連續灌胃8周。設置對照組，對照組不結扎，其余同模型組。對照組、模型組用等劑量生理鹽水灌胃。將造模過程中死亡的大鼠剔除，最后各組均剩余9只大鼠。記錄對照組、模型組、靈芝多糖-1組、靈芝多糖-2組、曲美他嗪組大鼠心率。取檢測心率后的大鼠，測定心臟血流動力學指標，然后取心臟組織，最后將心肌組織分成3部分。

1.3 心臟血流動力學指標檢測 用30 mg/kg的2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，固定大鼠，分離右側頸總動脈，以絲線將距離心臟遠端結扎，然后用動脈夾把靠近心臟的位置夾住，從右頸總動脈將含有0.05%肝素的生理鹽水導管插入左心室。記錄大鼠左室壓力上升最大速率(-dp/dtmax)、左室壓力下降最大速率(-dp/dtmax)、左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)。

1.4 心肌線粒體蛋白濃度和Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶檢測 取大鼠心肌組織，分離線粒體，分離步驟完全按照線粒體分離試劑盒進行，檢測線粒體蛋白濃度，然后根據試劑盒操作說明分析ATP酶活性(每毫克每1 h組織蛋白內的ATP酶將ATP分解生成1 μmol無機磷定義為一個酶活力單位)。

1.5 右室、左室質量指數檢測 取大鼠心臟和左心室、右心室，用電子天平稱量重量，然后計算右室質量指數(右心室重量/全心重量)、左室質量指數(左心室重量/全心重量)。

1.6 膠原容積分數檢測 將大鼠心肌組織用4%多聚甲醛固定，按常規方法制作病理切片，然后進行Masson染色，以IPP6.0系統檢測膠原容積分數。

1.7 TGF-β1、p38、p-p38蛋白檢測 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測蛋白表達，收集心肌組織，按照每0.1 g的組織中添加5倍體積的裂解溶液，在4 ℃中過夜。4 ℃，1 000 g離心5 min，吸取上清溶液即為電泳蛋白樣品。在蛋白樣品中加入等量體積的2×SDS上樣緩沖液，放在沸水浴中結合10 min。再將蛋白放在冰水混合物上備用。根據10%分離膠和5%濃縮膠常規配方制備SDS-PAGE凝膠，然后在每個孔內加入40 μg的蛋白樣品，首先將電泳儀的電壓調整到60 V，觀察溴酚藍已經進入到分離膠以后，將電壓調整到120 V繼續電泳，等到溴酚藍染料進入分離膠的底部邊緣以后，將凝膠拆下。再將凝膠放在轉移緩沖液中平衡。在冰浴條件下以200 mA的電流轉膜100 min。取出硝酸纖維素(NC)膜，然后放在5%牛血清白蛋白溶液中，在室溫條件結合1 h。NC膜置于1∶1 000稀釋之后的一抗溶液(抗體以封閉液稀釋)中，放在4 ℃條件下結合過夜。NC膜再置于1∶2 000稀釋以后的二抗溶液(用封閉液稀釋)中，在室溫中結合1 h。滴加ECL顯色試劑。Image J分析目的條帶TGF-β1、p38、p-p38的灰度值以及內參條帶甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的灰度值，以目的條帶灰度值÷內參條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。

2 結 果

2.1 各組大鼠心率比較 模型組大鼠心率明顯高于對照組，靈芝多糖-1組、靈芝多糖-2組、曲美他嗪組大鼠心率明顯低于模型組，且靈芝多糖-2組大鼠心率低于靈芝多糖-1組，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心率比較(±s) 單位：次/min

2.2 各組大鼠血流動力學指標比較 與對照組比較，模型組大鼠LVSP、LVEDP水平較高，+dp/dtmax、-dp/dtmax水平較低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，靈芝多糖-1組、靈芝多糖-2組、曲美他嗪組大鼠LVSP、LVEDP水平較低，+dp/dtmax、-dp/dtmax水平較高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與靈芝多糖-1組比較，靈芝多糖-2組LVSP、LVEDP水平較低，+dp/dtmax、-dp/dtmax水平較高，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠血流動力學指標比較(±s)

2.3 各組大鼠心肌線粒體蛋白濃度和Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶水平比較 與對照組比較，模型組大鼠心肌線粒體蛋白濃度和Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶水平較低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，靈芝多糖-1組、靈芝多糖-2組、曲美他嗪組大鼠心肌線粒體蛋白濃度和Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶水平較高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與靈芝多糖-1組比較，靈芝多糖-2組心肌線粒體蛋白濃度和Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶水平較高，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠心肌線粒體蛋白濃度和Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶水平比較(±s)

2.4 各組大鼠右室、左室質量指數、膠原容積分數和TGF-β1蛋白水平比較 與對照組比較，模型組大鼠右室質量指數、左室質量指數、膠原容積分數和TGF-β1蛋白水平均較高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，靈芝多糖-1組、靈芝多糖-2組、曲美他嗪組大鼠右室質量指數、左室質量指數、膠原容積分數和TGF-β1蛋白水平均較低，差異均有統計學意義(P<0.05)。與靈芝多糖-1組比較，靈芝多糖-2組大鼠右室質量指數、左室質量指數、膠原容積分數和TGF-β1蛋白水平均較低，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖1、表4。

圖1 Western Blot檢測大鼠心肌組織中TGF-β1蛋白表達條帶圖

表4 各組大鼠右室質量指數、左室質量指數、膠原容積分數和TGF-β1蛋白水平比較(±s)

2.5 各組大鼠心肌組織中p38MAPK信號激活程度比較 與對照組比較，模型組大鼠p-p38蛋白水平較高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，靈芝多糖-1組、靈芝多糖-2組、曲美他嗪組大鼠p-p38蛋白水平較低，差異均有統計學意義(P<0.05)。與靈芝多糖-1組比較，靈芝多糖-2組大鼠p-p38蛋白水平較低，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見圖2、表5。

圖2 Western Blot檢測大鼠心肌組織中p38、p-p38蛋白表達條帶圖

表5 各組大鼠心肌組織中p38、p-p38蛋白水平比較(±s)

3 討 論

靈芝內含有多種活性成分，具有降血脂、調節血壓、增加免疫力等藥理學作用。靈芝多糖是從靈芝內提取的多糖混合物，在很多疾病進展中發揮保護作用，例如：靈芝多糖可以通過抑制腫瘤細胞的生長發揮抗腫瘤作用；通過刺激單核巨噬細胞分泌細胞因子調控機體免疫功能；通過降低肝臟中的脂肪顆粒改善脂肪肝進程[12]。多項實驗表明，靈芝多糖對心血管系統疾病也有改善作用，經其治療后的缺血再灌注大鼠心臟功能得到改善[13]。靈芝多糖還可以抑制心肌纖維化，降低糖尿病心肌病心肌纖維化相關因子的表達[7]。本研究結果顯示，靈芝多糖干預后的心力衰竭大鼠心率明顯降低，LVSP、LVEDP水平下降，+dp/dtmax、-dp/dtmax水平升高，并且大鼠右室質量指數、左室質量指數均下降，說明靈芝多糖能夠改善心力衰竭大鼠心臟功能。

研究顯示，心力衰竭病人出現心肌能量代謝異常，進而導致血流動力學改變，誘導心肌纖維化[14]。線粒體是人體內的能量代謝場所，正常狀態下的線粒體內的能量代謝極為旺盛，為細胞功能發揮提供動力[15]。Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶能夠調控細胞內和細胞外Na+和Ca2+平衡，二者均是重要的蛋白酶[16]。Na+和Ca2+平衡是心房肌、心室肌以及蒲肯耶纖維動作電位的動力，也是調控細胞中鈣離子穩定的關鍵，而心肌細胞中Ca2+水平對于心肌正常功能的維持有十分重要的作用，當Na+-K+-ATP酶的活性降低后，細胞內的Na+水平增加，K+水平降低，Na+和Ca2+交換，導致細胞中的Ca2+水平增加，減弱心肌的收縮功能[17]。Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性的變化是細胞能量代謝變化的標志[18]。心肌纖維化是心力衰竭誘導的必然病理結果，心臟膠原含量升高是心肌纖維化的標志[19]。TGF-β1是心肌纖維化的標志因子，其表達升高后標志著纖維化程度升高[20]。本實驗結果表明，靈芝多糖處理后的心力衰竭大鼠心肌組織中心肌線粒體蛋白濃度和Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、心肌膠原含量和TGF-β1蛋白表達水平均降低，提示靈芝多糖能夠改善心力衰竭大鼠心肌能量代謝和心肌纖維化進程。

信號通路是存在于人體內的重要樞紐，在細胞分化、胚胎發育、疾病發生等過程中均發揮作用[21]。p38MAPK信號通路是MAPK信號通路的關鍵分支，而p38是該信號通路中的關鍵因子，其只有被磷酸化以后才能夠發揮作用[22]。p38MAPK信號通路與心力衰竭有關，其被過度激活后誘導心肌損傷，而下調p38MAPK信號通路的激活水平能夠改善心功能[23]。研究發現，靈芝多糖能夠降低p38磷酸化水平從而改善小鼠急性肺損傷[9]。本研究結果顯示，靈芝多糖能夠降低心力衰竭大鼠心肌組織中p-p38表達水平，表明靈芝多糖可能通過抑制p38MAPK信號發揮抗心力衰竭作用。

綜上所述，靈芝多糖能夠改善心力衰竭大鼠心功能、抑制心肌纖維化、改善心肌能量代謝、降低p38MAPK信號激活水平，目前尚未探討靈芝多糖通過何種靶向機制影響p38MAPK發揮作用，在以后的實驗中深入研究。