腦梗死急性期患者血清miR-493表達水平及其與溶栓后預后的關系研究

康梅娟, 溫昌明， 張保朝， 孫 軍， 劉義鋒， 張東煥， 黃 芳， 趙 磊

急性腦梗死(acute cerebral infarction，ACI)是一種發病率、死亡率、致殘率、復發率均高的神經血管性疾病，其發病率約占所有腦卒中的77%，具有起病急、進展快的特點，是影響人類身體健康的全球性健康問題[1,2]。

目前臨床治療ACI的原則是第一時間開通血管，盡早恢復缺血腦組織的血流灌注，促進神經功能損傷修復[3]。因此，如何促進ACI后血管新生、改善腦血流灌注成為了研究熱點。有報道[4]指出，微小RNA-493(microRNA-493，miR-493)具有調控腦梗死后血管新生的作用，可作為腦梗死后治療的新靶點。此外，靜脈溶栓治療是ACI患者唯一經批準的全身再灌注治療方法[5]，國內外相關指南[6,7]均推薦早期采用阿替普酶靜脈溶栓治療。實際工作中早期預測ACI預后，對臨床制定針對性治療方案、改善預后具有重要指導價值，基于此，本研究嘗試探究ACI患者血清miR-493表達水平及其與溶栓后預后的關系。報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 經我院倫理委員會審批通過，前瞻性選取2019年10月-2021年3月我院70例ACI患者作為研究組，納入標準：(1)參照《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[8]診斷為ACI；(2)發病至治療時間≤4.5 h；(3)首次患ACI；(4)無腦出血傾向；(5)對本研究藥物無禁忌；(6)患者知曉本研究，已簽署同意書。其中男42例，女28例；年齡47～72歲，平均(60.15±5.92)歲；體質量指數19.5～28.3 kg/m2，平均(25.21±1.54)kg/m2。依據1∶1配對試驗原則，另選同期70例健康體檢者作為對照組，納入標準：(1)于我院進行全身體檢未發現明顯異常；(2)自主行為能力良好，能配合完成研究；(3)無頭部嚴重創傷史、手術史及腦血管疾病史；(4)患者知曉本研究，已簽署同意書。其中男38例，女32例；年齡43～70歲，平均(58.83±5.58)歲；體質量指數18.9～27.8 kg/m2，平均(24.81±1.49)kg/m2。兩組排除標準：(1)血液系統疾病患者；(2)感染性疾病患者；(3)惡性腫瘤患者；(4)長期服用激素類藥物者；(5)自身免疫性疾病患者；(6)近期有嚴重創傷或手術史者；(7)心肺肝腎等臟器嚴重功能障礙者。

1.2 方法 阿替普酶靜脈溶栓：研究組患者入院后常規開展抗血小板凝聚、補液、補充電解質等對癥治療，發病4.5 h內行阿替普酶(德國勃林格殷格翰藥業有限公司，注冊證號S20110051)靜脈溶栓，總劑量0.9 mg/kg(最大劑量90 mg)，使用前用附帶的稀釋劑臨時配置，濃度為1 mg/ml，其中10%于1 min內靜脈推注，剩余部分60 min內靜脈滴注完成。溶栓24 h后檢查無出血，常規給予抗血小板藥物治療。溶栓治療3個月后，根據改良Rankin量表評分(modified Rankin scale，mRS)[9]評估預后，mRS總分0～6分，0分：無癥狀；1分：盡管有癥狀，但未見明顯殘障；2分：輕度殘障；3分：中度殘障；4分：重度殘障；5分：嚴重殘障；6分：死亡。本研究將mRS評分≤3分判定為預后良好，>3分判定為預后不良。

實驗室指標檢測：研究組分別于治療前、治療后3 d、7 d采集外周靜脈血3 ml，對照組于體檢時采集外周靜脈血3 ml，取血液標本，離心處理取血清，采用熒光聚合酶鏈式反應檢測血清miR-493水平，檢測試劑盒購自德國Qiagen公司，應用公式2-ΔΔct計算miR-493相對表達水平(Δct=ct目標-ct內參，ΔΔct=Δct實驗-Δct對照)；采用免疫比濁法測定血清血管內皮生長因子(vascular epithelial growth factor，VEGF)、血管生成素-2(Angiopoietin-2，Ang-2)水平，試劑盒購自廣州奧維斯生物技術有限公司；采用酶聯免疫吸附法測定血清C反應蛋白(Creactive protein，CRP)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)水平，試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司。以上檢測操作均由專業人員嚴格按照試劑盒說明書完成。

1.3 觀察指標 (1)兩組一般資料(性別、年齡、體質量指數、入院時收縮壓、舒張壓、血糖水平、吸煙、飲酒情況)、血清miR-493水平;(2)研究組不同神經功能缺損程度患者治療前血清血管生長因子(VEGF、Ang-2)、炎性因子(CRP、IL-6)及miR-493水平，分析miR-493水平與神經功能缺損程度、血清血管生長因子、炎性因子的相關性;(3)研究組不同預后患者治療前、治療后3 d、7 d血清miR-493水平，分析血清miR-493預測ACI患者溶栓治療預后的價值。

2 結 果

2.1 兩組臨床資料 血清miR-493水平比較 治療前、治療后3 d、7 d血清miR-493水平呈逐漸升高趨勢，但均低于對照組(P<0.05)(見表1)。

表1 兩組臨床資料、血清miR-493水平比較

2.2 研究組不同神經功能缺損程度患者血清各指標比較 研究組神經功能輕度缺損23例，中度缺損31例，重度缺損16例；不同神經功能缺損程度患者治療前血清miR-493、VEGF、Ang-2、CRP、IL-6水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)(見表2)。

表2 研究組不同神經功能缺損程度患者血清各指標比較

2.3 血清miR-493水平與神經功能缺損程度的相關性 經Spearman相關性分析，發現治療前血清miR-493水平與ACI患者神經功能缺損程度間存在負相關關系(r=-0.520，P<0.05)。

2.4 血清miR-493水平與血管生長因子、炎性因子的相關性 經Pearson相關性分析，發現治療前血清miR-493水平與ACI患者VEGF、Ang-2、CRP、IL-6水平間存在負相關關系(r=-0.565、-0.529、-0.475、-0.634，P<0.05)。

2.5 不同預后患者血清miR-493水平比較 溶栓治療3個月后，研究組預后良好患者51例，預后不良患者19例；預后良好患者治療前、治療后3 d、7 d血清miR-493水平均較預后不良患者高(P<0.05)(見表3)。

表3 研究組不同預后患者血清miR-493水平比較

2.6 血清miR-493預測ACI預后的價值 以預后不良患者為陽性樣本，預后良好患者為陰性樣本，繪制治療前、治療后3 d、7 d血清miR-493預測ACI患者溶栓治療預后為不良的ROC曲線，結果顯示其預測曲線下面積(Area under the curve，AUC)分別為0.748、0.851、0.879，其中治療后7 d血清miR-493預測的AUC最大(見圖1)。

3 討 論

ACI是由供血不足引起局部腦組織缺血缺氧導致的一系列神經功能障礙癥狀，其發病機制非常復雜，涉及動脈粥樣硬化、血管新生、炎癥反應等多方面[10]。近年來，國內外大量研究[11,12]指出，miRNA是一類長度為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，具有組織特異性及相對穩定性高、體液豐度高的特點，參與腦梗死等多種疾病的發生發展。

相關動物學研究發現，腦梗死后miR-493表達明顯降低，其表達下調可負向調控巨噬細胞游走抑制因子的下游AKT、ERK通路，從而促進梗死周圍血管新生，并指出miR-493可作為腦梗死后治療的新靶點[13]。但miR-493在ACI患者血清中的表達水平如何，截至目前尚無研究報道。本研究通過對比分析，發現ACI患者急性期血清miR-493水平明顯低于健康人群，而阿替普酶靜脈溶栓治療后3 d、7 d，血清miR-493水平呈逐漸升高趨勢，但均未恢復至正常水平。提示miR-493在ACI急性期的表達水平明顯降低，阿替普酶靜脈溶栓治療后患者血清miR-493水平逐漸上調。本研究通過相關性分析，發現ACI患者治療前血清miR-493水平與神經功能缺損程度呈負相關，即患者神經功能缺損越嚴重，miR-493表達的抑制作用越大，血清miR-493水平越低。

本研究還發現，ACI患者治療前血清miR-493水平與VEGF、Ang-2間存在負相關關系。其中VEGF是血管新生的關鍵因子，對血管內皮細胞具有較強的特異性親和作用，在機體血管生成的環節中起著不可替代的作用[14]。國外一項薈萃分析[15]顯示，缺血性腦卒中患者的血清VEGF水平明顯升高，且不同的檢測天數不會顯著影響其血清濃度。國內學者陳亞男等[16]研究指出，VEGF是ACI患病后血管新生的重要因子，具有擴張血管、增加血管通透性等多種生物學活性，從而促進梗死部位血流恢復，改善神經功能的作用。Ang-2同樣具有促進血管新生的作用，在腦梗死患病急性期其表達水平較高，與VEGF可發揮協同作用，共同促進血管重塑或新生[17]。ACI發生后，患者梗死腦部處于缺血缺氧狀態，在低氧、炎癥等因素刺激下，機體為保護腦組織大量釋放VEGF、Ang-2，二者含量增加均可促進梗死部位及其周圍血管生成，進而提高血流灌注水平，促進損傷神經元細胞的修復和再生[18,19]。筆者認為，隨著患者病情加重，miR-493表達的抑制作用越大，其表達下調可上調巨噬細胞游走抑制因子的下游AKT、ERK通路。而AKT、ERK通路是目前研究血管內皮細胞的信號傳導過程的主要途徑，其相關蛋白激酶的活性越強，提示VEGF濃度越高[20]。據此推測血清miR-493水平降低可負向調節VEGF、Ang-2的生成。

然而，血清miR-493水平越低提示患者神經根腦損傷越嚴重，雖然血清VEGF、Ang-2水平較高，可促進血管新生，改善局部血流灌注，但部分神經根腦損傷是不可逆的。且本研究結果顯示血清miR-493水平與血清CRP、IL-6水平同樣存在負相關關系，可見ACI急性期血清miR-493水平越低，患者炎癥反應越嚴重，而炎癥可加重神經根腦損傷，影響患者預后[21]。因此本研究結果中預后良好ACI患者的治療前、治療后3 d、7 d血清miR-493水平均高于預后不良患者。基于上述研究結果，本研究認為ACI患者急性期血清miR-493水平與患者預后有關，可能對預后情況進行預測，進一步通過ROC曲線分析發現治療前、治療后3 d、7 d血清miR-493預測ACI患者溶栓治療預后為不良的AUC均在0.7以上，其中治療后7 d血清miR-493預測的AUC達到0.879，預測效能較高，可為臨床早期預測患者預后轉歸方向提供一定參考。

綜上可知，ACI患者急性期血清miR-493表達水平明顯降低，其表達水平與患者神經功能缺損程度、血清血管生長因子、炎性因子水平密切相關，且能輔助臨床預測患者溶栓治療預后情況。但本研究未進行長期隨訪，且樣本量有限，一定程度上限制了研究結果的泛化，仍需通過大樣本的前瞻性研究進一步驗證。