基于網絡藥理學分析中醫藥防治宮腔粘連的作用機制

張麗美 劉云平 邱 麗 劉 瑾 鐘曉玲▲

1.深圳市中醫院婦科，廣東深圳 518033；2.深圳市中醫院超聲科，廣東深圳 518033；3.深圳市中醫院生殖健康科，廣東深圳 518033

宮腔粘連（intrauterine adhesion，IUA）臨床表現為經量過少、閉經腹痛、不孕或反復胚胎丟失等[1]。 宮腔手術的女性繼發IUA 的占比為25%～30%[2]。 西醫治療IUA 通常采用宮腔鏡下IUA 分離術及口服雌孕激素等方法，但中重度IUA 仍有一定的復發率[3]。 近年來， 許多文獻均報道，IUA 術后中西醫結合治療可明顯降低其IUA 復發率，且已有學者對該類文獻中核心處方進行數據挖掘[4-5]，但對中醫藥防治IUA 的具體機制及作用靶點仍不明確。 本研究選取治療IUA 的高頻中藥作為研究對象，通過網絡藥理學方法對其防治IUA 的作用機制進行進一步解析， 期望能為臨證配伍和進一步實驗研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 高頻中藥的統計

本研究以“宮腔粘連”“數據挖掘”或“組方規律”或“用藥規律”或“處方分析”作為檢索詞，收集建庫至2021年6月公開發表在中國知網、維普網、中國生物醫學文獻數據庫有關中醫藥治療IUA 的數據挖掘類文獻。 全文均有明確的藥物累計頻次信息，統計文獻中高頻次中藥。

1.2 高頻中藥化學成分及靶點預測

從文獻研究中獲得治療IUA 的高頻中藥，設置生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 為篩選條件，運用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinse Medicine Systerms Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）篩選高頻中藥的全部化學成分及靶點蛋白，將去重后的藥物靶點蛋白導入通用蛋白數據庫Uniprot（https://www.uniprot.org）中，獲得高頻中藥對應的人源基因靶點名稱。

1.3 IUA 疾病靶點篩選及靶點網絡

以“intrauterine adhesion”作為檢索詞，通過人類基因數據庫GeneCards（https://www.genecards.org/）獲得IUA 疾病靶點，作為IUA 疾病基因數據庫。將藥物、藥物有效成分及疾病基因導入Cytoscape 3.7.2 軟件中將其關系可視化。

1.4 藥物-疾病靶點蛋白互作網絡

通過Venny2.1 軟件獲得藥物與疾病的交集靶點，將其輸入STRING 數據庫（https://string-db.org/），來源設置為“Homo sapiens”，選擇minimum required interaction score 為high confidence 0.9，并勾選hide disconnected nodes in the network，獲取高頻中藥治療IUA 潛在作用靶點的蛋白互作網絡（protein-protein interaction，PPI），將結果導入Cytoscape 中進行可視化顯示。同時在該軟件的CytoNVA 插件中篩選核心靶標， 網絡拓撲分析篩選條件為：degree centrality（DC）、betweenness centrality（BC）、closeness centrality（CC）均大于中位數。

1.5 核心靶標基因本體富集分析及基因組百科全書通路分析

通過網絡拓撲分析獲得的核心靶標導入DAVID數據庫（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp），種屬和背景選擇 “Homo sapiens”， 分別進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析及基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG） 通路富集分析，兩者均設定P＜0.01，錯誤發現率（false discovery rate，FDR）＜0.01 作為篩選條件。 其中GO 富集內容包括：生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細胞組分（cellular component，CC）三個內容，GO 富集分析結果采用R4.1.0 軟件輸出直方圖，KEGG 分析以氣泡圖形式體現。

1.6 分子對接驗證

利用PDB 數據庫（https://www.rcsb.org/）下載Degree 值排列前3 位的核心靶點的3D 蛋白結構文件，設置以下選擇條件：①Homo sapiens 來源；②分辨率≤2.5 A；③小分子配體信息詳細，蛋白結構完整；④pH 值在人體正常生理范圍；⑤通過X-ray 方法解析。 將篩選后的蛋白結構通過PyMol 2.3.0 軟件進行預處理。 通過TCMSP 數據庫下載Degree 值排名前3位的化學成分結構文件。 將處理后核心蛋白結構和小分子結構導入Autodock 1.5.6 軟件進行分子對接。

2 結果

2.1 高頻中藥篩選結果

檢索得到2 篇中醫藥治療IUA 的數據挖掘類文獻[4-5]，分別統計兩篇文獻中排名靠前的高頻次中藥，結果見表1。 結果顯示，兩者的共同高頻中藥是當歸、熟地黃、川芎、桃仁、紅花、牛膝，后文將以此作為研究對象。

表1 治療IUA 中藥復方中的藥物頻次統計

2.2 高頻中藥化學成分篩選

將高頻中藥當歸、熟地黃、川芎、桃仁、紅花、牛膝分別作為檢索詞，運用TCMSP 數據庫獲得全部化學成分， 去重并去除無對應靶點成分后共納入50 個藥物活性化學成分，結果見表2。

表2 高頻中藥化學成分信息表

2.3 IUA 相關基因靶點及與藥物交集靶點

通過GeneCards 數據庫獲取IUA 疾病靶點共3743 個。將“2.2”項下納入的50 個藥物化學活性成分導入Uniprot 數據庫中，去重后獲得202 個人源基因靶點名稱。 運用Venny 軟件選取交集，得到147 個高頻中藥治療IUA 的潛在作用靶點，結果見圖1。

圖1 藥物-疾病潛在作用靶點

2.4 藥物-有效成分-疾病靶點網絡

將數據導入Cytoscape 軟件中將其關系可視化。結果顯示， 按照Dgree 值排列前3 位的是豆甾醇、山奈酚、槲皮素，三者分別是高頻中藥治療IUA 的主要活性成分（圖2）。

圖2 藥物-有效成分-疾病靶點網絡圖

2.5 藥物-疾病靶點PPI 網絡圖

將交集基因輸入STRING 數據庫， 得到藥物-疾病的PPI 網絡，結果見圖3，包括138 個節點、492 條相互作用線，平均節點度為7.13，平均局部聚類系數為0.423。

圖3 高頻中藥治療IUA 的PPI 網絡圖

采用CytoNCA 插件篩選核心靶標， 其中各項中位數為：DC=5、BC=61.968、CC=0.174，共獲得64 個核心靶點。 按DC 排名前3 位的基因靶點是：TP53、STAT3、MAPK1， 提示這些靶點在高頻中藥治療IUA中尤為重要。 排名前5 位核心靶點結果見表3。

表3 按DC 排名前5 位的網絡拓撲分析結果

2.6 GO 富集分析

將核心靶點導入DAVID 數據庫，結果顯示：BP92條，MF 22 條，CC 12 條，主要涉及凋亡過程、細胞增殖調控、藥物反應等生物過程，胞質、核漿、細胞外區域等細胞結構以及蛋白結合、酶結合、轉錄因子結合等分子功能， 篩選排名前10 位的GO 富集進行可視化處理，結果見圖4。

圖4 排名前10 位GO 富集分析直方圖

2.7 KEGG 信號通路分析

核心靶點導入數據庫共獲得117 條富集通路，篩選后有83 條信號通路符合條件。 分析提示核心靶點與T 細胞受體信號通路、PI3K-Akt 信號通路、Toll 樣受體信號通路等有關， 運用微生信網站（http://www.bioinformatics.com.cn）對篩選后的前30 條KEGG 通路結果進行可視化處理，見圖5。

圖5 核心靶點的KEGG 信號通路分析（前30 位）

2.8 分子對接結果

利用Autodock 軟件將主要成分豆甾醇、山奈酚、槲皮素與排名前3 位的核心靶點TP53、STAT3、MAPK1 進行分子對接，結果見表4，結果顯示，相互間的結合能均<-5.0 kcal/mol，提示核心靶點與化學成分間的對接均有較好的結合能力。并將結合活性強烈的豆甾醇與MAPK1 組輸入PyMol 軟件進行可視化，結果見圖6。

圖6 豆甾醇與MAPK1 分子對接結果

表4 不同核心靶點與化學成分分子對接的結合能（kcal/mol）

3 討論

腎虛血瘀為IUA 最主要病機[6]，數據挖掘類文獻統計出中醫學者治療IUA 時選取當歸、 熟地黃、川芎、桃仁、紅花、牛膝等藥物的用藥頻次高，與腎虛血瘀病機相呼應。 其中，位居首位的當歸為補血要藥，同時具有行血之效，熟地黃為“至陰之藥”，善于滋補肝腎陰血；兩者互用補而不滯。 川芎、桃仁、紅花、牛膝為血府逐瘀湯的重要組成部分， 該方為治療血瘀證的經典名方，除心腦血管疾病外，婦科疾病的應用亦頗多[7]，且活血類中藥具有促進血管新生、改善血液流變學、促進內膜局部血液循環、阻止粘連再次發生的效果[8-9]。 現代中醫學者選取此類中藥防治IUA，臨床療效十分滿意[10]。

中藥配伍后防治IUA 的具體作用機制不明，本研究利用網絡藥理學發現高頻中藥治療IUA 的有效成分主要是豆甾醇、山柰酚、槲皮素等，三者主要涉及炎癥-免疫反應、細胞周期調控。豆甾醇可明顯抑制白介素（interleukin，IL）-1、IL-6 等以達到抗炎作用，且可下調相關信號通路起到抑制腫瘤的作用[11]。 山柰酚可抑制蛋白激酶活性，影響細胞增殖周期[12]。 槲皮素是最有效的抗氧化劑，可穿過細胞膜發揮抗炎及抑制細胞周期的作用[13]。 主要化學成分與TP53、STAT3、MAPK1 等靶點基因的關系尤為密切， 且通過分子對接驗證主要化學成分與前三者均有較好的結合能力。 其中TP53 可促進DNA 修復、使細胞周期停頓或凋亡[14]，STAT3 可促進促血管生成的關鍵調節信號的生成，介導細胞的生長、凋亡等過程[15]。激活MAPK 家族可促進子宮內膜上皮細胞增殖，改善子宮內膜容受性[16-17]。 核心靶點基因亦涉及炎癥反應、細胞周期調控，與高頻中藥的主要化學成分藥效不謀而合。 而目前IUA 的治療方法中， 除了物理隔離外， 包括干細胞、透明質酸鈉的宮腔注射及血管擴張劑、雌激素的口服應用等均可促進內膜細胞增殖分化、 抑制內膜局部炎癥的作用[18]。 通過GO 富集分析可預測，這些核心靶標主要在胞質、核漿、細胞外區域等位置發揮作用，并通過藥物反應、凋亡過程、細胞增殖調控等生物過程發揮蛋白結合、酶結合、轉錄因子結合等分子功能。

KEGG 富集分析發現，高頻中藥治療IUA 可能通過上述核心靶標誘導下游轉錄因子，激活T 細胞受體信號通路、PI3K-Akt 信號通路、Toll 樣受體信號通路等發揮作用。 其中T 細胞受體信號通路、Toll 樣受體信號通路均為炎癥-免疫反應通路，Toll 樣受體信號通路不僅參與炎癥反應，對內源性損傷模式分子亦有識別作用，參與非特異性免疫[19]。 PI3K-Akt 信號通路生理狀態下表達低下，當細胞損傷后，會迅速激活促進細胞增殖[20]。

綜上所述， 現代中醫學者防治IUA 選取的高頻中藥可能通過調控內膜細胞周期、 局部炎癥-免疫調節等生物環節起到預防IUA 復發的作用。 本研究為中醫藥治療IUA 臨證選藥及實驗提供數據支持，但本研究同時存在一定不足， 如未對文獻質量進行評價、文獻中臨床藥方有限，研究樣本量少，尚處于理論層面， 對高頻中藥治療IUA 的作用機制仍需開展實驗研究加以證實。