廈門市水產品中副溶血性弧菌和溶藻弧菌的污染狀況研究

◎ 翁琴云

（廈門市食品藥品質量檢驗研究院，福建 廈門 361012）

副溶血性弧菌是近幾年我國食源性疾病暴發(fā)的常見原因之一，人們常因食用被污染的生鮮、未充分煮熟或被交叉污染的水產品而引起副溶血性弧菌食物中毒。廈門是東南沿海重要的城市、港口及風景旅游城市，日常水產品消費比例較高[1]。根據已有的報道，由水產品中副溶血性弧菌引起的食物中毒事件占據了食物中毒事件的首位，已經成為廈門市主要的公共衛(wèi)生問題之一，嚴重危害人們的身體健康并造成經濟損失。而溶藻弧菌是一種人及水生動物共患的病原菌，不僅是養(yǎng)殖水產品的重要致病菌，爆發(fā)時可引起魚、蝦、貝類的大量死亡，給水產養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經濟損失，而且對人也具有致病性，國內曾有多地報道溶藻弧菌引起的食物中毒事件[2-4]。本研究通過了解廈門市市售水產品副溶血性弧菌、溶藻弧菌污染及毒力基因分布情況，為預防食源性疾病，確保消費者健康，以及為監(jiān)管部門制訂防控措施提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從廈門市各個區(qū)的零售店、超市、農貿市場以及批發(fā)企業(yè)采集210批鮮活水產品，其中海水魚72批，淡水48批以及90批貝類產品；3%堿性蛋白胨水、TCBS瓊脂、3%氯化鈉三糖鐵瓊脂（北京陸橋生物科技有限公司）；弧菌顯色培養(yǎng)基（法國科瑪嘉公司）；生化鑒定試劑盒VITEK GN鑒定卡、API 20E試劑盒（法國梅里埃公司）；副溶血性弧菌核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）、溶藻弧菌核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）、副溶血性弧菌（TDH、TRH、TLH）三重核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）（深圳生科原生物有限公司）。

1.2 儀器與設備

GNP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設備有限公司）；CFX96 Touch實時熒光PCR儀（美國伯樂公司）；VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定分析系統（法國梅里埃公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 檢測依據依據《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》（GB 4789.7—2013）和美國食品和藥品管理局（Food and Drug Administration，FDA）發(fā)布的細菌分析學手冊（Bacteriological Analytical Manual，BAM）第九章中弧菌的方法，進行前處理、增菌、分離及鑒定等檢測工作。同時應用熒光PCR方法與VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定分析系統對可疑菌落進行鑒定。

1.3.2 副溶血性弧菌和溶藻弧菌的毒力基因分析

應用副溶血性弧菌（TDH、TRH、TLH）三重核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）進行副溶血性弧菌和溶藻弧菌的毒力基因分析。提取DNA以及熒光PCR均按照試劑盒的說明書進行。

1.3.3 統計學分析

應用SPSS 23對各種數據進行分析，組間差異用χ2檢驗，P＜0.05差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 副溶血性弧菌和溶藻弧菌的污染狀況

經過檢測，在210批水產品中，除了11批樣品（包括7批淡水魚、3批淡水魚和1批貝類水產品）未檢出副溶血性弧菌及溶藻弧菌，其他199批（94.8%）樣品中至少檢出一種弧菌。其中，有148批（70.5%）樣品同時檢出副溶血性弧菌及溶藻弧菌。副溶血性弧菌和溶藻弧菌的檢出率大致相當，分別是81.9%（172/210）和81.4%（171/210），如表1。

表1 副溶血性弧菌和溶藻弧菌污染情況表

2.2 不同類別食品污染情況

從食品類別來看，各種弧菌的檢出率都是貝類水產品最高、海水魚次之、淡水魚最低。貝類產品、海水魚、淡水魚副溶血性弧菌檢出率之間并不存在統計學差異；貝類水產品、海水魚溶藻弧菌檢測率均顯著高于淡水魚，存在統計學差異（χ2=4.63，P＜0.05及χ2=13.225，P＜0.05)，但海水魚與貝類水產品檢出率不存在統計學差異，見表2。

表2 不同類別樣品的副溶血性弧菌和溶藻弧菌污染情況表

2.3 不同采樣地點副溶血性弧菌和溶藻弧菌污染情況

不同的采樣地點副溶血性弧菌和溶藻弧菌污染情況見表3。這2種弧菌在零售店、超市、農貿市場及批發(fā)企業(yè)中均有一定的檢出率，其中批發(fā)企業(yè)的副溶血性弧菌和溶藻弧菌的檢出率均高于其他采樣點，分別是88.6%（39/44）、86.49%（38/44）。經過統計學分析，批發(fā)企業(yè)的副溶血性弧菌檢出率顯著高于零售店（χ2=4.962，P＜0.05），各個采樣點的溶藻弧菌檢出率不存在統計學差異。

表3 不同采樣地點副溶血性弧菌和溶藻弧菌污染情況表

2.4 副溶血性弧菌及溶藻弧菌毒力基因分析

對分離得到的172株副溶血性弧菌以及171株溶藻弧菌進行毒力基因檢測，結果表明172株副溶血性弧菌中均攜帶tlh基因，均未攜帶tdh基因，只有2份樣品（草魚及黑魚）中分離得到的菌株攜帶trh基因，trh基因攜帶率為1.2%（2/172）；171株溶藻弧菌有9株溶藻弧菌菌株（包括5批貝類水產品、3批海水魚及1批淡水魚）攜帶tlh，所有菌株均未攜帶tdh、trh基因，基因攜帶率為5.3%（9/171），見表4。

表4 副溶血性弧菌及溶藻弧菌分離株毒力基因分析結果表

3 結論與討論

通過對廈門市市售水產品中副溶血性弧菌及溶藻弧菌的檢測分析，結果表明，副溶血性弧菌和溶藻弧菌的污染程度大致相同，檢出率分別為81.9%及81.4%。其中，副溶血性弧菌的檢出率與任淑敏等人[5]關于廈門市思明區(qū)的監(jiān)測結果（81.11%）基本一致，但高于廈門市以往的監(jiān)測結果。溶藻弧菌的檢出率也與江蘇省、北京市鮮活水產品的檢測結果大致相仿。總體上這2種致病性弧菌的檢出率比一些省市地區(qū)的監(jiān)測結果高，分析原因，這與樣品類別、采樣時間有密切關系。溫度是影響弧菌生長和分布的最主要因素。弧菌在低溫條件下，容易處于活的非可培養(yǎng)狀態(tài)，利用現有的常規(guī)培養(yǎng)方法不易檢出，從而降低了弧菌檢出率。而高溫條件可明顯促進弧菌生長，有研究表明海洋溫度的升高可使弧菌豐度長期增加。本研究采樣對象是鮮活水產品，樣品沒有經過低溫保存環(huán)節(jié)，避免了低溫對弧菌生長造成的影響，更能真實地反映水產品中的弧菌污染情況。而且本研究采集樣品的時間正好是天氣炎熱的8月份，夏季高溫季節(jié)更有利于弧菌的生長，造成了較高的檢出率。

在不同的食品類別中，副溶血性弧菌及溶藻弧菌在貝類水產品的污染程度最高，檢出率分別是84.4%（76/90）、90.0%（81/90），90批貝類水產品中僅有1批未檢出副溶血性弧菌及溶藻弧菌。在以往的監(jiān)測中也發(fā)現貝類水產品的弧菌檢出率及污染水平高于其他類水產品。分析其原因，這與大多數貝類水產品的生活習性以及生理結構特點有關——貝類水產品屬于濾食性生物，對濾食水體不具備選擇性，相對于魚類生物，貝類水產品棲息的場所比較固定，比較容易受到污染水體的影響。而且，加上貝類本身就具有較魚類更高的富集有毒有害物質包括微生物的能力，經過進一步分析，本研究中的貝類水產品都是海水養(yǎng)殖的，被弧菌污染可能性更高。

分析不同采樣地點的弧菌污染情況，結果顯示批發(fā)企業(yè)的弧菌污染程度最高。這可能是因為樣品的采集地點相對集中，44個樣品集中在6個采樣地點，在同一個采樣地點的水產品因為儲藏條件不當（比如溫度過高）、銷售環(huán)境復雜、衛(wèi)生條件差等原因更容易造成弧菌在水產品中的交叉污染。

弧菌的致病性與毒力因子密切相關。大部分弧菌并非都是致病性弧菌，所以水產品中副溶血性弧菌和溶藻弧菌的高檢出率并不能代表其真實的危害程度。需要進一步分析相關的毒力基因，以便更真實地進行風險評估。溶血素是一類非常重要的胞外產物，廣泛分布在致病性弧菌中，在弧菌的致病過程中發(fā)揮著重要作用。副溶血弧菌的溶血素TDH、TRH和TLH是目前研究最多的溶血素，也是副溶血弧菌最重要的致病因子，與之相對應的毒力基因分別是毒力基因tdh、trh、tlh基因。有研究表明，臨床分離或食物中毒食品的副溶血弧菌大多攜帶tdh基因及trh基因的一種或兩種，而環(huán)境分離株中攜帶tdh或trh基因的概率很低，tlh基因在臨床及環(huán)境分離株中均能檢出。與已有的報道相似，本研究中從水產品中分離得到的172株副溶血性弧菌均檢出tlh基因，均未檢出tdh基因，只有2株菌株攜帶trh基因，這表明廈門市水產品中副溶血性弧菌tdh基因及trh基因攜帶率低，但2株含trh基因的副溶血性弧菌毒力株的存在，提示廈門市水產品中可能存在一定的食品安全風險。另外，由于副溶血弧菌和溶藻弧菌在基因組上的高度同源性，以及弧菌間毒力基因存在著水平轉移現象，已有的研究表明在溶藻弧菌中也攜帶tdh、trh、tlh基因。本研究中從水產品中分離得到的171株溶藻弧菌菌株，只有9株攜帶tlh毒力基因，均不攜帶tdh、trh基因，與已有的報道結果一致。tlh基因廣泛存在于副溶血性弧菌及溶藻弧菌中，但目前其功能尚不清楚，需要進一步的研究。