廈門市水產(chǎn)品中副溶血性弧菌和溶藻弧菌的污染狀況研究

◎ 翁琴云

（廈門市食品藥品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 廈門 361012）

副溶血性弧菌是近幾年我國食源性疾病暴發(fā)的常見原因之一，人們常因食用被污染的生鮮、未充分煮熟或被交叉污染的水產(chǎn)品而引起副溶血性弧菌食物中毒。廈門是東南沿海重要的城市、港口及風(fēng)景旅游城市，日常水產(chǎn)品消費(fèi)比例較高[1]。根據(jù)已有的報(bào)道，由水產(chǎn)品中副溶血性弧菌引起的食物中毒事件占據(jù)了食物中毒事件的首位，已經(jīng)成為廈門市主要的公共衛(wèi)生問題之一，嚴(yán)重危害人們的身體健康并造成經(jīng)濟(jì)損失。而溶藻弧菌是一種人及水生動(dòng)物共患的病原菌，不僅是養(yǎng)殖水產(chǎn)品的重要致病菌，爆發(fā)時(shí)可引起魚、蝦、貝類的大量死亡，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且對人也具有致病性，國內(nèi)曾有多地報(bào)道溶藻弧菌引起的食物中毒事件[2-4]。本研究通過了解廈門市市售水產(chǎn)品副溶血性弧菌、溶藻弧菌污染及毒力基因分布情況，為預(yù)防食源性疾病，確保消費(fèi)者健康，以及為監(jiān)管部門制訂防控措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從廈門市各個(gè)區(qū)的零售店、超市、農(nóng)貿(mào)市場以及批發(fā)企業(yè)采集210批鮮活水產(chǎn)品，其中海水魚72批，淡水48批以及90批貝類產(chǎn)品；3%堿性蛋白胨水、TCBS瓊脂、3%氯化鈉三糖鐵瓊脂（北京陸橋生物科技有限公司）；弧菌顯色培養(yǎng)基（法國科瑪嘉公司）；生化鑒定試劑盒VITEK GN鑒定卡、API 20E試劑盒（法國梅里埃公司）；副溶血性弧菌核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）、溶藻弧菌核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）、副溶血性弧菌（TDH、TRH、TLH）三重核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）（深圳生科原生物有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

GNP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；CFX96 Touch實(shí)時(shí)熒光PCR儀（美國伯樂公司）；VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定分析系統(tǒng)（法國梅里埃公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 檢測依據(jù)依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》（GB 4789.7—2013）和美國食品和藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）發(fā)布的細(xì)菌分析學(xué)手冊（Bacteriological Analytical Manual，BAM）第九章中弧菌的方法，進(jìn)行前處理、增菌、分離及鑒定等檢測工作。同時(shí)應(yīng)用熒光PCR方法與VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定分析系統(tǒng)對可疑菌落進(jìn)行鑒定。

1.3.2 副溶血性弧菌和溶藻弧菌的毒力基因分析

應(yīng)用副溶血性弧菌（TDH、TRH、TLH）三重核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）進(jìn)行副溶血性弧菌和溶藻弧菌的毒力基因分析。提取DNA以及熒光PCR均按照試劑盒的說明書進(jìn)行。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 23對各種數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間差異用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血性弧菌和溶藻弧菌的污染狀況

經(jīng)過檢測，在210批水產(chǎn)品中，除了11批樣品（包括7批淡水魚、3批淡水魚和1批貝類水產(chǎn)品）未檢出副溶血性弧菌及溶藻弧菌，其他199批（94.8%）樣品中至少檢出一種弧菌。其中，有148批（70.5%）樣品同時(shí)檢出副溶血性弧菌及溶藻弧菌。副溶血性弧菌和溶藻弧菌的檢出率大致相當(dāng)，分別是81.9%（172/210）和81.4%（171/210），如表1。

表1 副溶血性弧菌和溶藻弧菌污染情況表

2.2 不同類別食品污染情況

從食品類別來看，各種弧菌的檢出率都是貝類水產(chǎn)品最高、海水魚次之、淡水魚最低。貝類產(chǎn)品、海水魚、淡水魚副溶血性弧菌檢出率之間并不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；貝類水產(chǎn)品、海水魚溶藻弧菌檢測率均顯著高于淡水魚，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=4.63，P＜0.05及χ2=13.225，P＜0.05)，但海水魚與貝類水產(chǎn)品檢出率不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2。

表2 不同類別樣品的副溶血性弧菌和溶藻弧菌污染情況表

2.3 不同采樣地點(diǎn)副溶血性弧菌和溶藻弧菌污染情況

不同的采樣地點(diǎn)副溶血性弧菌和溶藻弧菌污染情況見表3。這2種弧菌在零售店、超市、農(nóng)貿(mào)市場及批發(fā)企業(yè)中均有一定的檢出率，其中批發(fā)企業(yè)的副溶血性弧菌和溶藻弧菌的檢出率均高于其他采樣點(diǎn)，分別是88.6%（39/44）、86.49%（38/44）。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，批發(fā)企業(yè)的副溶血性弧菌檢出率顯著高于零售店（χ2=4.962，P＜0.05），各個(gè)采樣點(diǎn)的溶藻弧菌檢出率不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表3 不同采樣地點(diǎn)副溶血性弧菌和溶藻弧菌污染情況表

2.4 副溶血性弧菌及溶藻弧菌毒力基因分析

對分離得到的172株副溶血性弧菌以及171株溶藻弧菌進(jìn)行毒力基因檢測，結(jié)果表明172株副溶血性弧菌中均攜帶tlh基因，均未攜帶tdh基因，只有2份樣品（草魚及黑魚）中分離得到的菌株攜帶trh基因，trh基因攜帶率為1.2%（2/172）；171株溶藻弧菌有9株溶藻弧菌菌株（包括5批貝類水產(chǎn)品、3批海水魚及1批淡水魚）攜帶tlh，所有菌株均未攜帶tdh、trh基因，基因攜帶率為5.3%（9/171），見表4。

表4 副溶血性弧菌及溶藻弧菌分離株毒力基因分析結(jié)果表

3 結(jié)論與討論

通過對廈門市市售水產(chǎn)品中副溶血性弧菌及溶藻弧菌的檢測分析，結(jié)果表明，副溶血性弧菌和溶藻弧菌的污染程度大致相同，檢出率分別為81.9%及81.4%。其中，副溶血性弧菌的檢出率與任淑敏等人[5]關(guān)于廈門市思明區(qū)的監(jiān)測結(jié)果（81.11%）基本一致，但高于廈門市以往的監(jiān)測結(jié)果。溶藻弧菌的檢出率也與江蘇省、北京市鮮活水產(chǎn)品的檢測結(jié)果大致相仿。總體上這2種致病性弧菌的檢出率比一些省市地區(qū)的監(jiān)測結(jié)果高，分析原因，這與樣品類別、采樣時(shí)間有密切關(guān)系。溫度是影響弧菌生長和分布的最主要因素。弧菌在低溫條件下，容易處于活的非可培養(yǎng)狀態(tài)，利用現(xiàn)有的常規(guī)培養(yǎng)方法不易檢出，從而降低了弧菌檢出率。而高溫條件可明顯促進(jìn)弧菌生長，有研究表明海洋溫度的升高可使弧菌豐度長期增加。本研究采樣對象是鮮活水產(chǎn)品，樣品沒有經(jīng)過低溫保存環(huán)節(jié)，避免了低溫對弧菌生長造成的影響，更能真實(shí)地反映水產(chǎn)品中的弧菌污染情況。而且本研究采集樣品的時(shí)間正好是天氣炎熱的8月份，夏季高溫季節(jié)更有利于弧菌的生長，造成了較高的檢出率。

在不同的食品類別中，副溶血性弧菌及溶藻弧菌在貝類水產(chǎn)品的污染程度最高，檢出率分別是84.4%（76/90）、90.0%（81/90），90批貝類水產(chǎn)品中僅有1批未檢出副溶血性弧菌及溶藻弧菌。在以往的監(jiān)測中也發(fā)現(xiàn)貝類水產(chǎn)品的弧菌檢出率及污染水平高于其他類水產(chǎn)品。分析其原因，這與大多數(shù)貝類水產(chǎn)品的生活習(xí)性以及生理結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有關(guān)——貝類水產(chǎn)品屬于濾食性生物，對濾食水體不具備選擇性，相對于魚類生物，貝類水產(chǎn)品棲息的場所比較固定，比較容易受到污染水體的影響。而且，加上貝類本身就具有較魚類更高的富集有毒有害物質(zhì)包括微生物的能力，經(jīng)過進(jìn)一步分析，本研究中的貝類水產(chǎn)品都是海水養(yǎng)殖的，被弧菌污染可能性更高。

分析不同采樣地點(diǎn)的弧菌污染情況，結(jié)果顯示批發(fā)企業(yè)的弧菌污染程度最高。這可能是因?yàn)闃悠返牟杉攸c(diǎn)相對集中，44個(gè)樣品集中在6個(gè)采樣地點(diǎn)，在同一個(gè)采樣地點(diǎn)的水產(chǎn)品因?yàn)閮Σ貤l件不當(dāng)（比如溫度過高）、銷售環(huán)境復(fù)雜、衛(wèi)生條件差等原因更容易造成弧菌在水產(chǎn)品中的交叉污染。

弧菌的致病性與毒力因子密切相關(guān)。大部分弧菌并非都是致病性弧菌，所以水產(chǎn)品中副溶血性弧菌和溶藻弧菌的高檢出率并不能代表其真實(shí)的危害程度。需要進(jìn)一步分析相關(guān)的毒力基因，以便更真實(shí)地進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估。溶血素是一類非常重要的胞外產(chǎn)物，廣泛分布在致病性弧菌中，在弧菌的致病過程中發(fā)揮著重要作用。副溶血弧菌的溶血素TDH、TRH和TLH是目前研究最多的溶血素，也是副溶血弧菌最重要的致病因子，與之相對應(yīng)的毒力基因分別是毒力基因tdh、trh、tlh基因。有研究表明，臨床分離或食物中毒食品的副溶血弧菌大多攜帶tdh基因及trh基因的一種或兩種，而環(huán)境分離株中攜帶tdh或trh基因的概率很低，tlh基因在臨床及環(huán)境分離株中均能檢出。與已有的報(bào)道相似，本研究中從水產(chǎn)品中分離得到的172株副溶血性弧菌均檢出tlh基因，均未檢出tdh基因，只有2株菌株攜帶trh基因，這表明廈門市水產(chǎn)品中副溶血性弧菌tdh基因及trh基因攜帶率低，但2株含trh基因的副溶血性弧菌毒力株的存在，提示廈門市水產(chǎn)品中可能存在一定的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。另外，由于副溶血弧菌和溶藻弧菌在基因組上的高度同源性，以及弧菌間毒力基因存在著水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，已有的研究表明在溶藻弧菌中也攜帶tdh、trh、tlh基因。本研究中從水產(chǎn)品中分離得到的171株溶藻弧菌菌株，只有9株攜帶tlh毒力基因，均不攜帶tdh、trh基因，與已有的報(bào)道結(jié)果一致。tlh基因廣泛存在于副溶血性弧菌及溶藻弧菌中，但目前其功能尚不清楚，需要進(jìn)一步的研究。