水產(chǎn)品中磺胺類藥物檢測能力驗證質(zhì)量控制分析

◎ 馮慧慧，楊亞琴，余明霞，曹 秀，李圓圓，郝學(xué)飛

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（鄭州），河南 鄭州 450002）

磺胺類藥物是對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，因其具有性質(zhì)穩(wěn)定、抗菌譜廣、殺菌效果好、使用方便和價格低廉等優(yōu)點，在水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中仍然廣泛使用，主要用于預(yù)防和治療魚、蝦、蟹等動物的細(xì)菌感染性疾病[1-2]。由于磺胺類藥物在生物體內(nèi)作用時間和代謝時間較長，在水產(chǎn)品體內(nèi)蓄積到一定濃度，經(jīng)食用后會對人體產(chǎn)生毒副作用，引發(fā)排尿和造血紊亂等副作用和過敏反應(yīng)，使免疫功能下降，致殘、致畸、致突變，并且可能產(chǎn)生致癌作用[3]。因此，我國以及美國、歐盟等多數(shù)國家對食品中磺胺類藥物殘留最高限量均有明確規(guī)定，如我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）規(guī)定所有食品動物肌肉、脂肪、肝和腎中磺胺類藥物的最大殘留限量為100 μg·kg-1[4]。近年來，磺胺類藥物殘留的問題也越來越受社會的關(guān)注，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、各地方政府等也多次組織實施水產(chǎn)品例行監(jiān)測、專項監(jiān)測等各類抽檢工作，以確保水產(chǎn)品質(zhì)量安全。

能力驗證是通過各實驗室之間的比對，來對實驗室能力進(jìn)行考核、監(jiān)督和確認(rèn)的一種驗證活動，它可以作為質(zhì)量控制的外部補充措施，以促進(jìn)實驗室檢測能力和質(zhì)量管理水平的不斷提高[5-6]。本實驗室近年來也多次參加農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織的能力驗證考核活動，本文以2021年參加農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織的水產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留檢測能力驗證為例，檢測方法推薦使用《水產(chǎn)品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測定》（農(nóng)業(yè)部1077號公告-1-2008）[7]，優(yōu)化了提取溶劑和凈化方式，對考核樣品中磺胺類藥物殘留量進(jìn)行測定，取得了滿意的實驗結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Shimadzu LCMS-8050液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，日本島津公司；色譜柱：C18柱（100 mm×2.0 mm，3 μm），日本資生堂公司；PGC 4502i電子天平，精確至0.01 g，艾德姆衡器（武漢）有限公司；AE 240電子天平，精確至0.01 mg，梅特勒-托利多；飛鴿GL-21B 高速冷凍離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SKQ-500DE型數(shù)控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SK-1快速混勻器，金壇市白塔新寶儀器廠；Milli-Q超純水儀，美國Millipore公司。乙腈、甲醇：色譜純，德國Merck公司；甲酸：色譜純，賽默飛世爾科技公司；固相萃取凈化柱：Oasis PRiME HLB，規(guī)格為500 mg/6 mL，美國Waters公司。

磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺二甲異噁唑、磺胺喹噁啉、磺胺間二甲氧嘧啶、氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶-D3以及氘代磺胺間二甲氧嘧啶-D6共計10種化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司，純度均大于99.0%。

能力驗證樣品：離心管包裝的鯉魚魚糜，共3份樣品（每份樣品5.00 g），空白基質(zhì)樣品約50 g。檢測樣品編號為H47，由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品提取

樣品充分解凍至室溫，加入200 ng·mL-1混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μL，渦旋混合1 min，避光放置1 h，再加入20 mL乙腈進(jìn)行提取，渦旋混合2 min，室溫下超聲提取10 min，以8 000 r·min-1高速離心5 min，取上清液于50 mL燒杯中；殘渣用10 mL乙腈重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，待過柱凈化。

1.2.2 樣品凈化

將全部上清液轉(zhuǎn)移至Oasis PRiME HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化，保持流速1～2滴/s，收集全部濾液于梨形瓶中，40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入2 mL 20%甲醇水渦旋溶解殘留物，過0.22 μm微孔濾膜，待上機測定。

在測定能力驗證樣品時，先取出一份樣品按照上述方法進(jìn)行預(yù)處理粗略定量。根據(jù)預(yù)實驗粗略定量結(jié)果，考核樣品中磺胺甲基嘧啶濃度大約為24 μg·kg-1，磺胺二甲嘧啶濃度大約為40 μg·kg-1。可根據(jù)這個量進(jìn)行加標(biāo)樣品的制備，再根據(jù)加標(biāo)樣品的實測值和添加量計算出添加回收率，由此可以對考核樣品的測定值進(jìn)行校正，另外可以根據(jù)初測結(jié)果準(zhǔn)確配制標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍，使能力驗證樣品中磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲嘧啶上機液濃度涵蓋在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，且在標(biāo)準(zhǔn)曲線的中區(qū)值，使定量結(jié)果更加準(zhǔn)確。

1.2.3 樣品檢測

（1）色譜條件。色譜柱：資生堂C18柱（100 mm×2.0 mm，3 μm）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL；流動相A路：5 mmol·L-1甲酸-甲酸銨水溶液；流動相B路：甲醇∶乙腈（V∶V）=1∶1；流速：0.20 mL·min-1；梯度洗脫程序詳見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序表

（2）質(zhì)譜條件。離子化模式：電噴霧離子源（ESI），正離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；霧化氣：空氣，流速3.0 L·min-1；干燥氣：氮氣，流速10.0 L·min-1；加熱氣：氮氣，流速10.0 L·min-1；離子源接口溫度：300 ℃；脫溶劑管溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；碰撞誘導(dǎo)電離氣體壓力270 kPa，各化合物質(zhì)譜采集信息詳見表2。

表2 磺胺類藥物質(zhì)譜參數(shù)信息表

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測結(jié)果

樣品經(jīng)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)后，檢測結(jié)果見表3，磺胺類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜見圖1，考核樣品圖譜見圖2，經(jīng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部能力驗證通報，此次考核結(jié)果合格。

圖1 磺胺類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（20 ng·mL-1）總離子流圖

圖2 考核樣品總離子流圖

表3 考核樣品檢測結(jié)果表

2.2 提取溶劑的優(yōu)化與選擇

《水產(chǎn)品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（農(nóng)業(yè)部1077號公告-1-2008）[7]選用1%甲酸乙腈作為提取溶劑，主要是針對磺胺類和喹諾酮類藥物殘留量的同時測定，適量的甲酸更有利于喹諾酮類藥物的提取。本次考核只涵蓋其中8種磺胺類藥物（磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺二甲異噁唑、磺胺喹噁啉和磺胺間二甲氧嘧啶），結(jié)合磺胺類藥物本身的性質(zhì)，考前做多次預(yù)備實驗，比較標(biāo)準(zhǔn)中所用的1%甲酸乙腈和乙腈作為提取劑對化合物靈敏度和實驗回收率的影響。實驗結(jié)果如圖3所示，選用乙腈作為提取劑時，磺胺類藥物響應(yīng)明顯提高，實驗數(shù)據(jù)穩(wěn)定性好，與劉新輝[8]、蔣定之[9]文中提到隨著甲酸比例的增加，磺胺類等堿性化合物回收率降低的研究結(jié)果一致。因此，選用乙腈作為本次考核實驗的提取溶劑。

圖3 不同提取溶劑對磺胺類藥物響應(yīng)值的影響圖（n=3）

2.3 凈化方式的優(yōu)化與選擇

用新型固相萃取凈化柱Oasis PRiME HLB代替正己烷液液萃取除脂凈化。檢測標(biāo)準(zhǔn)《水產(chǎn)品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（農(nóng)業(yè)部1077號公告-1-2008）[7]關(guān)于磺胺類藥物檢測的前處理凈化步驟較少，只是將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后的殘留物復(fù)溶，用2 mL正己烷液液萃取除脂凈化后上機測定。

因水產(chǎn)品中含有大量蛋白質(zhì)、脂肪、磷脂等化合物，傳統(tǒng)的正己烷液液萃取不能有效去除樣品中的蛋白質(zhì)和卵磷脂，容易造成基質(zhì)干擾，影響離子化效率，從而影響化合物的靈敏度，且凈化不徹底會對儀器色譜柱和質(zhì)譜端造成較大污染。因此，本研究選用了目前新型Oasis PRiME HLB柱，不需要活化、淋洗、洗脫等步驟，操作簡單快速，可有效去除樣品中脂肪、蛋白質(zhì)、內(nèi)源性磷脂類等物質(zhì)干擾，極大地減少干擾物對目標(biāo)化合物的影響，且減小基質(zhì)效應(yīng)對實驗定量結(jié)果的影響[8-10]。實驗結(jié)果還表明Oasis PRiME HLB凈化柱對磺胺類化合物吸附很少，回收率穩(wěn)定可滿足檢測要求，詳見圖4。

圖4 經(jīng)Oasis PRiME HLB柱凈化后化合物回收率情況圖（n=3）

3 獸藥殘留能力驗證注意事項及質(zhì)量控制分析

3.1 能力驗證前注意事項

3.1.1 所用試劑、器皿的處理

將實驗過程中所用到的器皿按照規(guī)定要求清洗，并用甲醇潤洗，對于口徑較小的進(jìn)樣小瓶，可用甲醇超聲清洗，盡量避免實驗器皿帶來的外源污染。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的有效期、結(jié)構(gòu)、純度，根據(jù)標(biāo)識的純度進(jìn)行折算，部分磺胺類標(biāo)準(zhǔn)品在甲醇中的溶解度不好，可以加入適量甲酸超聲助溶。

3.1.3 儀器條件的優(yōu)化

確認(rèn)實驗過程中所用到的儀器設(shè)備狀態(tài)，必須保證在檢定或校準(zhǔn)有效期內(nèi)；考核前對儀器進(jìn)行簡單維護(hù)，清洗離子源，做儀器校準(zhǔn)等，確保儀器能夠滿足實驗靈敏度和穩(wěn)定性要求。

3.2 能力驗證中質(zhì)量控制分析

3.2.1 同步做好質(zhì)量控制

實驗室在做能力驗證考核樣品的同時，應(yīng)做好質(zhì)量控制。質(zhì)量控制包括試劑空白、基質(zhì)空白和質(zhì)控樣品（添加回收）。試劑空白和基質(zhì)空白可用來確認(rèn)在檢測過程中所用到的試劑是否存在干擾或污染；若有干擾存在，在進(jìn)行定量結(jié)果計算時可以及時扣除，避免檢測結(jié)果偏高，超出能力驗證判定標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)控樣品可確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度，同批次質(zhì)控樣品回收率滿足要求，考核樣品的檢測結(jié)果一般也會在允許的誤差范圍內(nèi)。

3.2.2 注意內(nèi)標(biāo)物與目標(biāo)物的同步

能力驗證考核樣品一般采用的是向空白基質(zhì)中添加目標(biāo)物的方式，制備好的樣品會放置一段時間后發(fā)放給各個參加考核的單位進(jìn)行檢測，而內(nèi)標(biāo)物是各個單位在進(jìn)行檢測時自行添加的，這會使得內(nèi)標(biāo)物與目標(biāo)物存在一定的時間差。為盡量減小兩者時間差帶來的影響，各檢測單位應(yīng)在接收樣品后充分解凍，加入內(nèi)標(biāo)物后，避光放置30～60 min，再按照規(guī)定的檢測方法進(jìn)行實驗前處理，盡量使內(nèi)標(biāo)物與目標(biāo)物狀況保持一致，保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性[6]。

3.2.3 基質(zhì)效應(yīng)的消除

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中除目標(biāo)分析物以外的組分，常對目標(biāo)物的分析有顯著的干擾，并影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，這些影響和干擾稱為“基質(zhì)效應(yīng)”。不同的基質(zhì)可能對目標(biāo)分析物產(chǎn)生增強或減弱效應(yīng)，因此在樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量時，可以選用空白基質(zhì)液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法來減小基質(zhì)效應(yīng)的影響[11-12]。

4 結(jié)論

本研究結(jié)合使用Oasis PRiME HLB固相萃取凈化柱對實驗前處理提取溶劑和凈化方式進(jìn)行改進(jìn)，優(yōu)化儀器檢測條件。結(jié)果表明該方法具有快速、簡單易操作、基質(zhì)干擾小等優(yōu)點，并將該方法應(yīng)用于本次水產(chǎn)品中磺胺類藥物能力驗證考核，取得了滿意的實驗結(jié)果。此外，通過本次考核實驗，認(rèn)真總結(jié)了檢測過程中的注意事項及質(zhì)量控制技巧，使檢測人員的實驗操作能力得到提升，同時也保證檢測機構(gòu)出具準(zhǔn)確、公正、有效的檢測數(shù)據(jù)，提高水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管水平，保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全。