利用對蝦消化腺絲氨酸蛋白酶制備鮑魚外套膜ACE抑制肽

紀夢雅，萬楚君，翁 凌，馬 婷，張凌晶，章 騫，曹敏杰

（集美大學海洋食品與生物工程學院，福建廈門 361021）

另一方面，我國是凡納濱對蝦生產大國，2020年產量達186.3萬t[1]。同樣，在對蝦加工過程中也產生了大量副產物。但一般情況下，對蝦加工副產物除了用于制備甲殼素外，相當部分被作為垃圾直接丟棄，不僅浪費了大量的自然資源，還造成了環境污染。因此，將水產加工副產物高效利用，具有十分重要的環境和經濟效益[4?6]。蝦頭消化腺含豐富的內源蛋白酶，這些內源蛋白酶以絲氨酸蛋白酶為主，Wu等[7]從太平洋白蝦蝦頭中提取了絲氨酸蛋白酶并進行性質分析，發現白蝦蝦頭絲氨酸蛋白酶活性在pH為8.0～11.0范圍內都比較穩定；翁凌等[8]從南美白對蝦蝦頭中提取了絲氨酸蛋白酶，該酶在pH7.0～10.0，40 ℃以下具有較好的穩定性。但目前蝦頭絲氨酸蛋白酶還未得到廣泛的應用。

血管緊張素轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是腎素-血管緊張素系統（renin-angiotensin system，RAS）和激肽釋放酶-激肽系統（kallikreinkinin system，KKS）的關鍵酶。在RAS中，ACE可以將無升壓活性的血管緊張素Ⅰ水解為具有升壓活性的血管緊張素Ⅱ；同時，在KKS中，ACE可以使具有降壓活性的緩激肽降解，從而失去降血壓的功能。因此，抑制ACE活性是控制血壓上升的一個有效途徑[9]。研究發現，體外酶或消化道酶水解蛋白質后釋放出的分子量不同的小肽，可被人體直接吸收發揮不同的生理調節功能[10]。迄今為止，已有大量文獻報道了ACE抑制肽的相關研究，其中來源于天然食物蛋白，尤其是從海洋食物蛋白中分離制備的ACE抑制肽對血壓正常者無副作用，安全性高，是最具研究價值的功能性食品[11?12]。近年來，隨著生物活性肽被越來越多的關注，研究者們以動植物蛋白為原料制備了大量降壓肽。Lin等[13]研究了軍曹魚皮水解物對ACE的抑制作用，并分離出4種ACE抑制肽。Ketnawa等[14]利用微波和水解法從虹鱒魚副產物中提取出了ACE抑制肽。Zhang等[15]從水母性腺中純化得到了具有ACE抑制活性的二肽，并對其進行表征。也有研究者以鮑魚性腺[16]、內臟[17]和裙邊[18]為原料制備ACE抑制肽，但目前國內外還沒有以鮑魚外套膜為原料制備ACE抑制肽的相關報道。

本文擬以鮑魚加工副產物外套膜為原料，利用從凡納濱對蝦蝦頭消化腺提取的絲氨酸蛋白酶對其進行酶解，制備具有ACE抑制活性的多肽，并測定其氨基酸序列，分析可能的作用機理，以期為鮑魚外套膜和蝦頭的高值化利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活皺紋盤鮑（Haliotis discus hannaiIno） 帶殼平均體質量（50.0±4.0）g，購自廈門集美菜市場，帶回實驗室宰殺取其外套膜，立即使用或暫存于?80 ℃冰箱；凡納濱對蝦消化腺絲氨酸蛋白酶（酶活力為76000 U/mL） 參考本實驗室的方法[8]制備；ACE酶（A2580）、馬尿酰組氨酰亮氨酸（Hippuryl-histidylleucune，HHL） 美國Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷（tris（hydroxymethyl）methyl aminomethane，Tris） 青島福林生物化學公司；SDS-PAGE標準蛋白、SDS、丙烯酰胺 美國Bio-Rad公司；Tris-base 德國Roche公司；FastBlue蛋白染色液 中科瑞泰生物科技有限公司；甲醇、乙酸乙酯等試劑 均為國產分析純。

PT-2100組織搗碎機 瑞士Kinematica公司；pH計 美國Denver公司；超濾膜濃縮裝置 美國Millipore公司；恒溫水浴鍋 德國Memmert公司；蛋白質電泳裝置 美國Bio-Rad公司；AKTA蛋白純化系統 美國GE Healthcare公司；GF-260高效液相色譜儀 美國Agilent公司；凝膠成像儀 英國Syngene公司；Lambda 35紫外分光光度計 美國Perkin Elmer公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 絲氨酸蛋白酶酶解鮑魚外套膜過程分析 參照邱娟等[19]的方法，并略作修改。具體操作如下：取10 g鮑魚外套膜，加入100 mL濃度為20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH8.0），組織搗碎后，在4 ℃，3500 r/min下離心3 min，收集上清液，并取上層細膩沉淀，用少量20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.0，含0.15 mol/L NaCl）復溶后，與上清液混勻即成鮑魚外套膜前處理液。

取1 mL前處理液置于1.5 mL PE管中，37 ℃預熱5 min后，加入0.5%（v/v）的絲氨酸蛋白酶，保持37 ℃，分別在酶解0、5、30、60、120、180、240 min時取樣，取樣后迅速在95 ℃下加熱10 min，冷卻后進行SDS-PAGE分析。

中國英語學習者的實驗在被試所在中學或大學的教師辦公室進行，英語母語者分別在各自所在大學的圖書館中進行，一次僅有一個被試在房間中接受測試。被試首先閱讀實驗要求，然后開始測試。在電腦的自測步速閱讀完成后，被試還要做二語水平測試，并填個人語言背景表。二語水平測試題選自Oxford Proficiency Test，共50道語法選擇題，用以檢測學生的二語語法水平。所有學生均未在之前做過這一測試。語法選擇題每題1分，小于30分被界定為低水平;30～35分為低到中等水平;35分以上為中等以上水平。

1.2.2 SDS-PAGE分析 參考Laemmli[20]的方法分析鮑魚外套膜蛋白的酶解情況，所用濃縮膠濃度為5%、分離膠濃度為10%。電泳結束后，以Fast Blue蛋白染色液染色，用凝膠成像儀記錄結果。

1.2.3 鮑魚外套膜ACE抑制肽的制備 鮑魚外套膜ACE抑制肽的制備與1.2.1類似，但鮑魚外套膜組織搗碎后無需離心，直接37 ℃預熱5 min后，加入0.5%（v/v）的絲氨酸蛋白酶，在37 ℃、pH8.0下酶解4 h后，于95 ℃加熱10 min終止反應，即得鮑魚外套膜酶解液。用冰水冷卻鮑魚外套膜酶解液，后將其在6500 r/min下冷凍離心20 min，棄去沉淀，取上清液進行生物活性肽制備。

1.2.4 超濾膜分離 選用截留分子量為3 kDa的超濾膜，將上清液進行超濾分級，收集超濾膜濾過液，冷凍干燥后，用少量20 mmol/L Tris-HCl復溶，測定對ACE的抑制活性。

1.2.5 凝膠色譜分離 將冷凍干燥樣品用少量去離子水復溶后，上樣于Superdex peptide 10/300 GL凝膠過濾柱（10 mm I.D.×300 mm），洗脫液為去離子水。在流速為0.5 mL/min條件下，測定波長220 nm處的吸光值，收集不同組分（1 mL/管），冷凍干燥后復溶，測定相應組分的ACE抑制活性。

1.2.6 RP-HPLC分離 將Superdex peptide 10/300 GL凝膠過濾柱分離所得ACE抑制活性較強的組分冷凍干燥后復溶，利用GF-260 Agilent HPLC純化系統進一步分離純化。色譜柱為ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm），流動相為去離子水（含0.1% TFA）和乙腈（含0.1% TFA），洗脫條件為0～10 min，5%～10%乙腈；10～40 min，10%～40%乙腈；40～60 min，40%～70%乙腈。檢測波長220 nm，在流速1 mL/min下，手動收集各活性峰并冷凍干燥，用少量20 mmol/L Tris-HCl復溶后，測定相應組分的ACE抑制活性[18]。

1.2.7 LC-MS/MS鑒定氨基酸序列 將上述復溶樣品在13000 r/min下離心10 min，取7 μL樣品進行LC-MS/MS分析。按照流速2 μL/min，將樣液上樣到C18預柱（100 μm×3 cm，3 μm，150 ?）上，保持2 μL/min沖洗脫鹽10 min，液相為Eksigent nanoLCUltra? 2D納升系統（AB SCIEX）。樣品脫鹽后再經C18反相色譜柱（75 μm×15 cm，3 μm，120 ?，Chrom XP Eksigent）分離。質譜采用Triple TOF 5600系統結合納升噴霧III離子源（AB SCIEX，USA），噴霧電壓為2.3 kV，氣簾氣壓為30 psi，霧化氣壓為5 psi，加熱溫度為150 ℃[21?22]。

1.2.8 ACE抑制活性的測定 ACE抑制活性測定參考Cushman等[23]方法，并略作修改。實驗組將20 μL ACE酶液與20 μL待測樣液充分混勻，37 ℃預熱5 min，立即加入50 μL 6.5 mmol/L HHL溶液（溶劑為100 mmol/L的硼酸鹽緩沖液，pH8.3，含0.3 mol/L NaCl），37 ℃反應60 min。加入50 μL 1 mol/L鹽酸終止反應，再加入300 μL乙酸乙酯，混勻后室溫下2553 r/min離心5 min。取上清液200 μL，真空濃縮除去乙酸乙酯后，加600 μL去離子水充分溶解，室溫下3610 r/min離心3 min，測定上清液在波長228 nm處的吸光值。對照組用去離子水代替樣液，空白組加入鹽酸后再加底物，其它條件均與實驗組一致。

酶活力單位（U）定義為每分鐘內分解HHL底物釋放出1 μmol馬尿酸（Hippuric acid，HA）所需要的酶量。

式中：A1為對照組的吸光值；As為實驗組吸光值；A0為空白組吸光值。

1.3 數據處理

每組ACE抑制率測定均重復三次，采用Excel 2019對實驗數據進行誤差分析。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE分析

圖1為鮑魚外套膜蛋白在絲氨酸蛋白酶作用下的分解過程。圖中，泳道M為標準蛋白，泳道Con1為鮑魚外套膜全蛋白，大部分蛋白的分子量在30 kDa以上，其中在高分子量（200 kDa）、95 kDa及42 kDa處存在明顯的蛋白條帶。泳道Con2無蛋白條帶，說明所添加的絲氨酸蛋白酶比活力高，酶蛋白背景低，不影響SDS-PAGE分析。鮑魚外套膜蛋白經對蝦絲氨酸蛋白酶酶解4 h后，蛋白基本降解完全，只有34 kDa附近有少量降解產物殘留，表明對蝦絲氨酸蛋白酶可有效降解鮑魚外套膜蛋白。

圖1 蝦絲氨酸蛋白酶水解鮑魚外套膜全蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of whole proteins in abalone mantle hydrolyzed by shrimp serine proteinase

2.2 鮑魚外套膜ACE抑制肽的分離純化

一般地，蛋白水解產物中，低分子量的組分所含的活性多肽含量更高。Fan等[24]在研究廢棄蛋雞肌肉中ACE抑制肽和ACE2上調肽時，用超濾膜分離后發現，小于3 kDa的組分具有較高的生物活性。章禹航等[25]以鲅魚加工副產物為原料制備ACE抑制肽時發現，超濾得到分子量小于3 kDa的組分具有最高的ACE抑制活性。

本研究利用絲氨酸蛋白酶酶解鮑魚外套膜蛋白，將酶解液用截留分子量為3 kDa的超濾膜進行超濾分級，測定酶解液和分子量小于3 kDa組分的ACE抑制活性。結果如圖2所示，相同濃度下，酶解液和分子量小于3 kDa組分的ACE抑制率分別為13.42%和53.25%。本研究結果表明，經過超濾膜處理后，分子量小于3 kDa的組分（UF-3）的ACE抑制活性明顯高于處理前酶解液的抑制活性。

圖2 酶解液和UF-3的ACE抑制活性Fig.2 ACE inhibitory activity of the hydrolysate and UF-3

將UF-3冷凍干燥后用Superdex peptide 10/300 GL凝膠柱分離，結果如圖3所示。共得到3個峰，分別為F1（第8～25管）、F2（第26～28管）和F3（第29～35管），根據波峰分布情況，收集3個組分，真空冷凍干燥，復溶后測定相應的ACE抑制活性。其中，F2和F3活性較高，而F3生物活性較強且分子量較低，故將其作為重點研究組分。

圖3 UF-3生物活性肽的Superdex peptide10/300 GL凝膠過濾（a）及組分的ACE抑制活性（b）Fig.3 Superdex peptide 10/300 GL gel filtration of the bioactive peptides from UF-3 (a) and ACE inhibitory activity of the fractions (b)

大量的文獻報道，蛋白酶解物中混合肽的分子量及結構對其活性有一定影響，而ACE抑制活性是由分子量較小的肽段所賦予的，因此低分子量（1～5 kDa）組分中通常包含更多的活性肽[26?27]。由于ACE是分子量為180 kDa的大分子，空間阻礙效應導致分子量較大的肽難于與ACE活性中心產生有效結合并抑制其活性。結晶學研究表明，低分子量肽更容易進入ACE的催化區域[28]，改變其催化活性，特別是0.5～3 kDa的肽對于其活性影響更大[29]。Superdex peptide 10/300 GL凝膠柱在分離肽時，還受如吸附作用等因素的影響，不能完全按肽的相對分子質量大小實現分離。因此，采用RP-HPLC依據疏水性差異對F3繼續分離。

研究發現，多肽的親水-疏水性也是影響其ACE抑制活性的重要因素。因為親水性多肽很難接近ACE活性中心的疏水“口袋”，所以親水性多肽一般活性較低或無活性[30?32]。將分離得到的F3組分用RP-HPLC作進一步分離純化，手動收集主峰后冷凍干燥，復溶后，測定比較相應的ACE抑制活性。結果如圖4所示，F3組分經RP-HPLC分離，共收集獲得9個峰，依次標記為a～i。結果發現，峰d（28.0 min）、e（29.25 min）、f（29.98 min）、g（33.58 min）和h（47.43 min）的ACE抑制活性較高，其中，峰h的ACE抑制活性最強，利用LC-MS技術對其進行氨基酸序列分析。

2.3 氨基酸序列分析

對圖4a中ACE抑制活性最強的峰h進行質譜鑒定，結果如圖5所示。共獲得65個離子峰，得到5個肽段，序列依次為P1：LVNEVTEFAK，P2：VDE VGGEALGR，P3：MFLSFPTTK，P4：VATVSLPR，P5：LGDSFYYGK。它們的分子量分別為575.31、551.27、536.27、421.74和525.24 Da，說明峰h并不是由單一的肽所產生的，而是多個肽的混合物。將得到的五個肽段與NCBI蛋白數據庫進行同源性分析得知，P1與血清白蛋白，P2與血紅蛋白β鏈，P3與α珠蛋白，P4與肌漿鈣結合蛋白，P5與絲氨酸蛋白酶均有100%的同源性。由于水解鮑魚外套膜蛋白的絲氨酸蛋白酶是高度純化的，因此，推測P1、P2、P3、P4均來源于鮑魚，而P5則來自對蝦絲氨酸蛋白酶。利用AHTPDB降壓肽數據庫（http://crdd.osdd.net/raghava/ahtpdb/pepsearch.php）檢索發現，5個肽均為新型ACE抑制肽。

圖4 F3生物活性肽的RP-HPLC分離純化（a）及組分生物活性（b）Fig.4 Separation and purification of bioactive peptides from F3 by RP-HPLC (a) and bioactivity of the fractions (b)

圖5 峰h中生物活性肽的分子量鑒定及氨基酸序列分析Fig.5 Identification of molecular mass and amino acid sequences of peptides from peak h

Natesh等[33]通過晶體學研究證明，ACE的活性位點不能容納分子量較大的多肽分子。因此，大多數ACE抑制肽長度較短，一般為2～12個氨基酸殘基。但ACE抑制肽的活性不僅與分子量大小有關，還與氨基酸的組成和序列密切相關。如C端的3個氨基酸中如有一個是疏水性氨基酸，則該ACE抑制肽具有較高的活性；N端含側鏈脂肪酸族氨基酸如Val和Ile等可以提高該肽的活性[30,34]。此外，帶正電荷的Lys（ε-氨基）和Arg（胍基）作為C末端也有助于提高其ACE抑制活性[35]。本研究純化獲得的肽C端均為Lys或Arg，二者雖屬于親水性氨基酸，但均帶正電荷，且肽N端均含脂肪族氨基酸，有助于提高ACE抑制活性。

綜上，本文所得純化肽符合ACE抑制肽的氨基酸組成特點，但其結構特性及其肽構效關系還需深入研究。接下來，擬通過合成上述ACE抑制肽，繼續探究其消化吸收性能和降血壓功效，并利用分子對接技術探討這些肽段與ACE的可能結合位點與結合方式，以期為相關功能性食品的開發提供理論參考。

3 結論

本研究以水產品加工副產物蝦頭和鮑魚外套膜為原料，提取蝦頭消化腺絲氨酸蛋白酶酶解鮑魚外套膜蛋白制備ACE抑制肽。結果表明，蝦頭絲氨酸蛋白酶可有效降解鮑魚外套膜蛋白，酶解液中分子量低于3 kDa的組分ACE抑制率為53.25%，利用Superdexpeptide 10/300 GL凝膠柱和RP-HPLC對該組分進一步純化并經LC-MS/MS鑒定得到5個肽段，其中4個是來源于鮑魚的新型ACE抑制肽。本研究利用水產品加工副產物，實現蝦頭消化腺蛋白酶一步酶解鮑魚外套膜，再經超濾得到具有較高ACE抑制活性的組分，這不僅有利于擴大天然ACE抑制肽的來源，實現鮑魚、對蝦加工副產物的高值化利用，還可以降低相關功能性食品的生產成本。未來，將對利用鮑魚外套膜酶解物開發功能性食品展開研究。