線粒體介導的二十二碳六烯酸（DHA）抗氧化機制研究進展

孫曉婷，徐 樂，肖寶平，崔冬月，劉靜雯，李 健，林靜瑜, ，李桂玲,

（1.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建廈門 361021；2.福建省海洋功能食品工程技術研究中心，福建廈門 361021；3.廈門市海洋功能食品重點實驗室，福建廈門 361021）

活性氧（reactive oxygen species, ROS）是體內一類氧的單電子還原產物，包括超氧陰離子（O2?·）、羥自由基（·OH）和過氧化氫（H2O2）等。在線粒體進行細胞呼吸時，電子傳遞鏈（electron transport chain，ETC）復合物I和復合物III會產生O2?·、·OH等自由基。少量的自由基對細胞信號傳導至關重要，但過量的自由基會引起線粒體損傷和氧化應激，進而引發心血管疾病、阿爾茨海默癥等多種氧化相關疾病[1]。線粒體不僅是ROS產生的主要場所，還是ROS消除的主要細胞器，在細胞能量代謝、氧化還原平衡以及通透性轉換中起重要調控作用[2?3]。

隨著人們保健意識的增強，天然食源性抗氧化劑的開發利用逐漸成為當今一大熱點。ω-3多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）是人體必需的脂肪酸，主要包括α-亞麻酸（ALA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳五烯酸（DPA）以及二十二碳六烯酸（DHA）等長鏈不飽和脂肪酸[4]。DHA是典型的ω-3多不飽和脂肪酸，在深海魚油和海洋微藻中高度富集。具有抗炎、抗癌、降血脂、免疫調節以及預防心血管疾等功效，DHA在食品保健、醫學等領域得到了廣泛應用[5?6]。此外，DHA有較強的抗氧化活性，可通過對多個信號通路的調節保護細胞免受氧化損傷：（1）通過ERK1/2信號通路激活線粒體自噬保護肝細胞免受氧化損傷[7]；（2）激活PI3K/Akt信號通路，增強細胞抗氧化能力并維持細胞完整性[8]；（3）激活NADPH氧化酶/ROS/Nrf2通路，誘導ARPE-19細胞表達血紅素氧合酶-1，保護細胞免受氧化損傷[9?10]。

DHA因含有羧基結構，能與細胞及線粒體雙層膜上的磷脂結合，影響膜蛋白的功能和脂筏信號傳導[11?12]。人體補充魚油12周后，富含DHA和EPA的ω-3 PUFA會滲入到線粒體膜中，導致線粒體膜上總磷脂、DHA和EPA的含量大大提高[13]。DHA可通過對線粒體的調控來影響細胞的生理活動。線粒體也是DHA調節氧化應激的主要靶點。線粒體介導DHA抗氧化作用的可能途徑如圖1所示。作為一種可以起防御作用的PUFA，DHA能夠對抗體內自由基引起的氧化應激，提高抗氧化酶活性或表達，消除線粒體產生的ROS，調節細胞的氧化還原狀態[2,14?15]；DHA也可通過對細胞核及線粒體轉錄因子的調控促進線粒體生物合成并參與線粒體的表觀遺傳調控，增強線粒體功能[16?18]。作為一種食源性的抗氧化劑，DHA的抗氧化功能及應用已有不少報道，但其具體作用機理，特別是表觀遺傳的調控作用尚不明確。本文將圍繞DHA對線粒體的調節及作用機制的研究進展進行綜述，特別闡述線粒體表觀遺傳介導的調節機制，探討DHA的抗氧化分子作用機理，為靶向線粒體的DHA膳食營養補充劑的開發利用提供依據。

圖1 線粒體介導DHA抗氧化的可能途徑Fig.1 Possible pathways of mitochondria-mediated DHA antioxidant

1 DHA調節線粒體抗氧化酶的表達及活性

細胞內源性抗氧化系統（包括抗氧化酶和非酶抗氧化劑）可將有毒物質代謝成無害的副產物，代表著抵御這些有毒反應物的第一道防線。內源性抗氧化酶是生物體內抵抗自由基的主要成員，主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）、HO-1和維生素C等[19]。正常生理條件下，細胞的抗氧化系統可以保護細胞免受氧化損傷，而當環境因素改變導致氧分子氧化和O2?·產生時，特異性位于線粒體基質的錳型超氧化物歧化酶（Mn-SOD）可自身氧化還原O2?·產生H2O2，從而產生高活性的·OH，·OH可氧化胞內的DNA、RNA、蛋白質、脂質等物質，引起氧化應激并造成細胞損傷[20?21]。DHA能夠通過作用SOD、CAT和GPx等酶來增加抗氧化活性，將H2O2轉化為H2O，從而降低氧化損傷。因此，DHA可通過對線粒體抗氧化酶的調節來提高細胞的抗氧化能力。

DHA對線粒體抗氧化酶的調節方式是不同的，包括：a.提高抗氧化酶表達水平：DHA可通過誘導炎癥細胞中CAT酶的表達降低ROS含量，減輕細胞氧化損傷[22]；還可通過提高SOD和GPx酶的表達，預防H2O2誘導的PC12細胞氧化損傷[14]；b.增強抗氧化酶的活性：DHA可通過增強紅細胞中SOD和CAT酶的活性，降低患心血管疾病的風險[15]；還可提高大腦中SOD和GPx酶活性，提高大腦組織的抗氧化性能，減輕神經元損傷[23?24]。前期研究發現，DHA可能通過上調線粒體中抗氧化酶基因（SOD2、CAT和GPx1）的表達水平，提高抗氧化酶的活性[16]。因此，DHA可能通過提高抗氧化酶活性或表達，改善氧化應激，發揮抗氧化作用。但也有研究顯示，DHA對抗氧化酶有抑制作用。在HCC細胞中DHA可使谷胱甘肽過氧化物酶4（GPx4）失活，促進細胞凋亡[25]；DHA可降低卵巢癌細胞中SOD和GPx4的蛋白表達，引起脂質過氧化促進細胞凋亡[26]。在不同細胞系中DHA調節抗氧化酶的方式及效應不同，反映了不同體系中DHA作用機制的區別。DHA對線粒體抗氧化酶的具體調節機制仍有待明確。本文在總結DHA對線粒體抗氧化酶調節作用的基礎上，進一步對DHA消除ROS、調節線粒體生物合成和穩態以及線粒體表觀遺傳調控作用的研究進展進行綜述，闡述線粒體介導的DHA抗氧化分子機制，為揭示食品抗氧化劑的分子作用機制提供依據。

2 DHA抑制線粒體ROS的產生

ROS主要來源于線粒體呼吸鏈，其在生物系統中具有“雙刃劍”效應：正常生理狀態下其產生與清除處于動態平衡，此時較低生理濃度的ROS對正常的細胞信號傳導起到至關重要的作用，還可上調抗氧化基因的表達以抵消氧化應激的影響；當外界條件改變打破這一平衡時，會導致其含量超過生理限度，此時，較高生理濃度和較長時間的ROS暴露除了對DNA、脂類和蛋白質等細胞大分子造成損傷外，還會破壞細胞結構，從而引起氧化損傷甚至導致細胞死亡[27]。

膳食補充ω-3 PUFA，特別是DHA，會影響線粒體膜磷脂結構和線粒體抗氧化功能。DHA進入細胞后可結合到線粒體膜上，維持正常線粒體結構并改變線粒體膜磷脂組成，從而影響線粒體膜通透性轉換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）開放，減少質子泄露，抑制ROS產生[28?29]。在線粒體中參與ROS生成的主要酶系統是呼吸鏈，而呼吸鏈電子流動速率受ATP合成速率的限制，更準確的說是受特定偶聯位點、即呼吸復合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ的質子運輸速率（Δp）限制。Δp的電成分即為跨膜電位（Δψm），提高Δψm可有效減少ROS產生。本團隊的前期研究發現，DHA在HepG2細胞中可提高Δψm，降低ROS產生[30]。因此，DHA能通過多種途徑降低細胞內線粒體的ROS水平并影響線粒體呼吸鏈，對細胞起一定的保護作用。DHA的作用方式包括：a.上調抗氧化酶基因表達，降低ROS水平，減少氧化應激，維持線粒體功能[31?32]；b.影響反向電子傳遞，降低線粒體內膜的去極化，從而抑制反向電子傳遞依賴性ROS的產生[33]；c.減弱MPTP對Ca2+的敏感性，減少MPTP瞬時開放來抑制ROS的產生[34]；d.調節線粒體呼吸傳遞鏈，改善線粒體功能，抑制線粒體ROS的產生，消除ROS并維持正常的細胞代謝過程。但是，DHA通過調節線粒體ROS水平發揮抗氧化效用的結果還存在一些爭議，具體機制也有待進一步明確。

3 DHA調節線粒體的生物合成和穩態

線粒體是ROS合成和消除的主要場所，對氧化應激極其敏感。當ROS的生成能力超過抗氧化防御能力時，過多的ROS攻擊線粒體DNA（mtDNA），可能導致mtDNA損傷并伴隨代謝功能紊亂[35]。線粒體并非單個作用的細胞器，可通過嚴格調控線粒體生物合成來維持其功能。線粒體合成涉及多個過程，包括mtDNA的復制和轉錄、翻譯以及線粒體的融合、裂變、自噬等過程。線粒體能夠通過生物合成產生新的線粒體，通過裂變自噬等清除功能失調的個體，還能通過融合作用產生連續的網絡，修復受損個體、恢復活性從而維持代謝效率[36?38]。因此，維持正常的線粒體生物合成及穩態對細胞的抗氧化能力至關重要。不少研究表明，DHA參與線粒體的合成和穩態調節，對維持細胞正常生理活動、修復損傷的線粒體以及維持正常的線粒體形態和功能等起到一定的促進作用[39?40]。

3.1 DHA對線粒體生物合成的調節

線粒體生物合成包括mtDNA的復制、轉錄和翻譯等，是一個受細胞核和線粒體相關因子嚴格調控的過程。多數線粒體轉錄調節因子可在DNA復制和轉錄水平調節線粒體生物合成，改善線粒體數量及質量，進而增強細胞對有害應激源的耐受閾值，在氧化應激調控中起重要作用。如過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α（PGC-1α）是線粒體再生的一個重要調節因子，它可與調節線粒體生物合成所需的基因協同誘導線粒體生物合成并提高線粒體呼吸效率[41]；細胞核呼吸因子（NRF1和NRF2）是線粒體生物合成調控網絡的關鍵組成部分，控制編碼細胞色素c和細胞色素c氧化酶亞基的基因表達；線粒體轉錄因子A（TFAM）及線粒體轉錄因子B1和B2（TFB1M和TFB2M）參與調節細胞色素氧化酶1-3（COX1-3）基因的轉錄，對線粒體DNA復制、轉錄和穩態維持發揮重要作用[42]。

DHA可通過多種方式調節線粒體的生物合成，特別是mtDNA的轉錄：a.DHA可提高C2C12成肌細胞的mtDNA拷貝數和PGC-1α啟動子活性，促進NRF1、NRF2和TFAM表達，提高mtDNA復制和轉錄[43]；b.DHA通過誘導PGC-1α及與線粒體融合相關的蛋白質的表達，提高線粒體的數量[44?45]；c.DHA通過上調腦源性神經營養因子（BDNF）激活線粒體生物合成，維持正常的線粒體功能[46]。前期研究發現在HepG2細胞中DHA能增加mtDNA拷貝數、提高線粒體轉錄因子的表達[16]。

3.2 DHA對線粒體穩態的調節

線粒體是高度動態的雙膜細胞器，線粒體穩態對其功能至關重要。在抵抗外界刺激的同時，細胞衍生出多種機制對自身受損或功能失調的線粒體進行修復或清除，以維持線粒體穩態并發揮正常的功能。線粒體為適應各種應激條件，通過不斷分裂和融合促使其形成一個相互連接的網絡結構，清除功能失調的個體，維持細胞正常生理活動的過程稱為線粒體動力學[47]。該過程受線粒體融合蛋白1和2（MFN1和MFN2）、視神經萎縮蛋白-1（OPA1）和線粒體分裂蛋白-1（DRP1）等共同調控。DHA可能通過以下方式調節線粒體穩態：a.調控分裂融合蛋白的表達影響線粒體動態平衡，提高線粒體質量，維持其穩態。DHA可促進MFN1、MFN2和OPA1的表達，增強線粒體融合程度，限制DRP1的線粒體定位，從而有效降低線粒體損傷[39,48]；b.修復損傷的線粒體維持其穩態。Zhang等[40]發現DHA可修復失衡的線粒體分裂和融合狀態，增加整合線粒體的數量，維持線粒體穩態，提高細胞抗氧化能力。DHA對受損的線粒體表現出較強的修復及改善效果，有助于維持正常的線粒體功能，提高其抗氧化能力。

4 線粒體表觀遺傳介導的DHA抗氧化作用

線粒體也受表觀遺傳調控。DHA可通過以下幾種表觀遺傳調節方式影響線粒體功能或生物合成：a.調節DNA甲基化水平使電子傳遞鏈（ETC）上相關基因的轉錄減弱，導致ETC功能受損[49]；b.參與調節組蛋白的化學修飾影響線粒體合成相關基因的表達及氧化磷酸化進程[50?51]；c.調控microRNA（miRNA）表達影響線粒體能量代謝、細胞凋亡、分裂/融合等過程[52]。miRNA表達調控對線粒體功能及生物合成具有重要調節作用，線粒體內也存在大量的miRNA。DHA對miRNA、特別是線粒體miRNA的調控正引起日益關注。因此，本文主要從miRNA調控的角度探討DHA的抗氧化機制。如表1所示，有不少miRNA靶向調控線粒體基因，在不同細胞系中發揮氧化應激調節作用（表1）。大多數線粒體miRNA由核基因編碼形成，后被轉運到線粒體基質中，在轉錄后水平調節線粒體蛋白表達進而影響線粒體功能。這些線粒體miRNA在氧化磷酸化、ATP合成、ROS形成以及脂肪酸代謝等多種過程發揮重要作用[60?61]。Das等[53]首次發現miR-181c可進入線粒體調節COX1和ROS水平，最終導致電子轉運鏈復合物IV重塑和線粒體功能障礙；線粒體miR-1靶向線粒體編碼的COX1、COX3、ND1和ATP8的mRNA，調節其翻譯，但具體機制仍有待闡明[62]。鑒于miRNA對線粒體生物合成和功能的影響，進一步探討線粒體內miRNA的活性及其作用機制對闡釋線粒體的氧化應激調節具有重要的意義。

表1 已知的靶向線粒體基因的miRNA氧化應激調節作用Table 1 Function of miRNAs that target mitochondrial genes in oxidative stress

隨著DHA氧化應激調節作用研究的深入，有越來越多的證據顯示線粒體miRNA可通過以下幾種方式介導DHA的抗氧化作用：a.受DHA調節的miRNA直接影響線粒體抗氧化酶的表達。如miR-23b靶向脯氨酸氧化酶（POX）降低ROS水平，DHA可提高miR-23b的表達，改善細胞抗氧化能力降低ROS[17?18]。b.受DHA 調節的miRNA通過影響線粒體穩態調節ROS的生成。如在哺乳動物中，miR-34a靶向調節Bcl-2的表達，影響線粒體的分裂融合，減緩線粒體氧化應激[63?64]。DHA在U266癌細胞及HepG2細胞中均能調節miR-34a的表達，而miR-34a對線粒體基因的表達有一定調控作用[65]。c.受DHA調節的miRNA調控線粒體自噬、降低ROS水平。自噬誘導劑肽（BECN1）是miR-30a的靶基因，在恢復線粒體自噬減輕線粒體功能障礙中起重要作用[66?68]，補充DHA可上調肥胖雌性大鼠心肌中的miR-30a表達，提示DHA可通過調節miR-30a的水平影響線粒體自噬，降低氧化應激。本團隊研究發現有多種受DHA調節的線粒體miRNA參與細胞的氧化應激調控。因此，DHA作為有效的抗氧化劑可通過調節miRNA的表達來增強細胞的抗氧化能力。受DHA調控的miRNA對線粒體的調節機制的探索可為揭示表觀遺傳介導的抗氧化分子作用機理提供證據。

5 結論與展望

線粒體作為細胞產能的主要場所，在細胞的生理活動中起著重要作用。線粒體一旦受損或氧化應激過強會引發線粒體功能障礙，甚至引發各種疾病。近年來國內外關于DHA對線粒體調控的研究日益增多。這不僅有利于闡明DHA調節線粒體抗氧化作用的機制，也為線粒體氧化相關疾病（如神經退行性疾病、心血管疾病等）的預防和治療提供了新思路。DHA通過對線粒體的功能、生物合成及表觀遺傳等多種途徑的調節提高細胞抗氧化能力，降低氧化損傷。但DHA的調節作用也還有很多未解決的問題，如DHA是如何進到線粒體或細胞核調節線粒體合成基因的表達；DHA是否及如何調節線粒體miRNA表達；核基因組編碼的miRNA如何進入線粒體以及線粒體基因組編碼的miRNA如何加工成熟等問題都還未得到解決。線粒體miRNA對線粒體的靶向調節機制仍是當下待解決的問題。DHA是否可通過線粒體其它表觀遺傳方式的調控影響線粒體的抗氧化功能也有待探索。

人體所需DHA主要通過食物攝取，在食品中添加DHA不僅可解決人體DHA攝入量不足的問題，還在改善視力、預防老年癡呆、防治心血管疾病等方面起到重要作用[69]。改善居民膳食DHA攝入量偏低的狀況是促進平衡膳食工作的重要內容，但DHA并不是攝入越多越好。如母體補充過量的DHA會影響胎兒肌肉發育，促進后代肌肉脂肪組織沉積[70]。DHA生物活性及其作用機制的探索將為抗氧化相關疾病的預防和治療提供依據，也將進一步推動嬰幼兒配方產品、休閑產品和膳食補充劑等DHA相關產品的開發與應用。相關產品中DHA的添加量和添加形式，以及產品攝取方式等都是DHA開發應用中需要關注的問題。同時，DHA對線粒體分子調節機制的明確也將為靶向線粒體的精準膳食調控提供依據，推動營養靶向設計、精準營養供給技術的發展。