抗氧化劑抑制血色素蛋白介導的脂質氧化的研究進展

曹珈榮，雷雪晴，秦志偉，劉 玲

（沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽 110866）

肉類中含有豐富的營養成分，在貯藏和加工中容易出現質量劣變，導致肉色澤、風味和營養價值下降。肉在貯藏加工中劣變的最主要因素之一是氧化，氧化主要存在于肉的脂質和蛋白質中。脂質氧化導致肉產生不良氣味，蛋白氧化導致肉色、肉質結構和蛋白功能改變，同時氧化也產生有毒有害的化學物質，嚴重威脅消費者健康[1]。

肉類中血紅素蛋白誘導的脂質氧化是導致肉類食品品質惡化的主要原因。血紅素蛋白主要包括血紅蛋白（Hemoglobin，Hb）和肌紅蛋白（Myoglobin，Mb）兩類。研究表明，血紅素蛋白對脂質氧化具有介導作用，但是兩種血紅素蛋白結構差別對氧化有影響。有人認為Hb比Mb更易使脂質氧化，因為在氧化條件下從血紅素中釋放的高鐵血紅蛋白（Methemoglobin，metHb）比保留原卟啉形式的Mb更容易促進脂肪的氧化[2]。有研究指出Hb促氧化活性的喪失是阻止魚類脂質氧化的決定性因素[3]。

在控制肉類和肉類制品中的脂質氧化各種方法中，抗氧化劑的應用被認為是一種實用的選擇。常用的肉制品抗氧化劑包括丁基羥基茴香醚（BHA）、二丁基羥基甲苯（BHT）和特丁基對苯二酚（TBHQ）等。它們主要用于清除自由基并終止自由基鏈的增殖[4]。有些抗氧化劑可以有效抑制血色素蛋白的介導作用[5]。但是，相較于對合成抗氧化劑安全性的擔憂，大眾普遍認為天然抗氧化劑本身更安全、更健康，這促使肉類工業尋找植物源抗氧化劑取代合成抗氧化劑。有研究表明天然抗氧化劑可以控制血色素蛋白介導的肉類脂質氧化[6]。

本文闡述了肉制品中血紅素蛋白氧化和脂質氧化反應機理，并探討抗氧化劑對抑制脂質和血紅素蛋白氧化的作用，為肉制品在貯藏和加工中的質量控制提供基礎，并為開發合適的抗氧化劑提供思路。

1 脂質氧化與血紅素蛋白氧化

蛋白質和脂質是肉類的主要營養成分，它們在氧氣、光照、酶等促氧因子的作用下發生氧化。氧化會導致肉制品的品質下降，其中脂質氧化不僅會導致肉質酸敗，而且還會對肉的感官有很大影響[7]。特別是在富含n-3多不飽和脂肪酸（PUFA）的魚類中，氧化導致質量損失的風險很高[8]。除了脂質氧化外，蛋白質的氧化也是導致肉品質下降的重要因素。肌漿蛋白中的血紅素蛋白是肉制品氧化的主要催化劑，由于血紅素蛋白自氧化產生活性氧和自由基，進而激活肉制品的氧化過程，同時血紅素蛋白也能釋放血紅素和Fe2+促進脂質的氧化。脂質氧化和蛋白質氧化過程可以獨立發生，但在肉制品中它們之間通常存在相互作用，蛋白質和脂質之間的相互作用明顯增強了初始氧化進程[9]。

1.1 脂質氧化

脂質氧化是典型的自由基增殖過程，常見的自動氧化通過不飽和脂肪酸經增殖反應生成烷基自由基、羥基自由基和過氧化自由基等，進一步形成氫過氧化物（圖1）。這些初級產物經過分解和聚合生成脂質氧化的次級產物，如脂質過氧化反應中產生的活性壬烯醛、丙烯醛、丙二醛等都具有很強的氧化能力，其中不飽和醛促氧化能力比飽和醛更強[10]。醛類氧化產物具有促進血紅素蛋白氧化的能力，它們可通過增加氧合肌紅蛋白的氧化、降低高鐵肌紅蛋白的酶促還原能力、提高高鐵肌紅蛋白的促氧化活性而改變其穩定性[11]。

圖1 脂質自氧化[12]Fig.1 Lipid autoxidation[12]

1.2 血紅素蛋白氧化

血紅素蛋白的氧化主要由其中鐵離子的氧化變價引發，這個過程逐步引起血紅素蛋白變性[13]。變性后的蛋白對血紅素的保護作用下降，導致血紅素基團暴露和氧化敏感性增強，進一步引發血紅素釋放，同時鐵離子部分游離，導致脂質氧化。有人在牛肉和雞肉中直接添加metHb，并沒有發現它明顯地介導脂質氧化[14]，這說明肌體中metHb需要在氧化條件下轉變成ferryHb或者釋放高價鐵離子來氧化脂質，條件不具備時metHb對脂質氧化的作用有限。在動物組織中，90%的鐵以血紅蛋白、肌紅蛋白和少量鐵蛋白、轉鐵蛋白和一些酶的活性部位的形式存在。其中，肉中血紅素蛋白含量最高的是肌紅蛋白和血紅蛋白[1]。

Hb分為脫氧血紅蛋白（deoxyHb）、氧合血紅蛋白（oxyHb）、高鐵血紅蛋白（metHb）和超鐵血紅蛋白（ferryHb），氧化過程見圖2。deoxyHb（II）的卟啉環上的二價鐵未攜帶氧氣，呈藍紫色，與氧氣結合后生成oxyHb（II），氧氣分子與二價鐵以一種可逆的方式結合在一起。oxyHb（II）在常溫下可以發生自動氧化反應，產生超氧陰離子自由基和褐色metHb（III）。oxyHb（II）的自動氧化反應是肉色紅度值（a*）損失的一個重要原因[15]。metHb（III）能夠被 H2O2激活而形成不穩定的ferryHb自由基（·HbFe4+），進一步還原成穩定的ferryHb（HbFe4+），它具有很強的促進肉中脂質氧化的能力[16]。高價鐵Fe4+是強氧化劑，在動力學上等價于羥基自由基（·OH）的活性，能夠快速從氫過氧化物上抽氫來促進脂質氧化。O2?等也可以進一步與肉中的鐵發生反應生成·OH，而·OH可以擴散進入脂質的疏水區域，具有促進脂質氧化的能力[17]。由deoxyHb向metHb的轉變過程中，生成的各類自由基等對促進脂質氧化具有明顯作用。

圖2 Hb的氧化過程Fig.2 Oxidation process of the hemoglobin

1.3 血紅素蛋白與脂質的相互氧化

蛋白與脂質的氧化是相互作用的。有人認為蛋白的氧化由脂質引發，這是一類脂質自由基促發蛋白自由基的反應[1]。但多數人認為，氧合血紅素蛋白的氧化是導致脂質氧化和非血紅素蛋白氧化的主因[18]，也就是說 deoxyHb氧化形成 ferryHb后，血紅素從ferryHb解離出來導致自由基的形成，自由基降解原卟啉并導致脂質氧化[19]。Hb誘導脂質氧化有兩種方式：一種是蛋白氧化產物誘導脂質氧化，如超氧自由基、烷基自由基、高鐵血紅素等誘導脂質的氧化；另一種方式是通過Hb釋放的鐵離子催化脂質氧化[1]。鐵離子在氧化的過程中生成具有高反應活性的自由基，啟動了脂質氧化反應。

如圖3所示，脂質氧化過程啟動后，反過來血紅素蛋白被進一步氧化，尤其是脂質中次級氧化產物不飽和醛的氧化作用。Chen等[20]發現4-羥基-2-壬醛和己烯醛能加快氧合肌紅蛋白的氧化速率，抑制電子傳遞鏈介導的高鐵肌紅蛋白還原。Gunwald等[11]研究發現4-羥基-2-壬烯醛能夠改變肌紅蛋白的蛋白質結構和氧化還原性質，它甚至能在5個位點上與抹香鯨的肌紅蛋白共價結合，使經過誘導的肌紅蛋白有效地促進肌肉中的脂質氧化。Ge?gotek等[21]研究發現，在較高濃度下的4-壬烯醛（4-HNE）可與組氨酸產生加合物，在DNA水平上修飾蛋白質的表達。有人總結出將脂質的初級和次級代謝產物與Hb反應，醛類比ROOH更易引發metHb形成[22]。由此可見，脂質氧化血色素蛋白的過程主要是通過脂質氧化產生的活性醛等中間產物實現對Hb的氧化。這些醛類物質不僅改變了血紅素蛋白的氧化還原穩定性，而且促進含氧血紅素蛋白的氧化，降低高鐵血紅素蛋白的還原并增強了其促氧化活性[1]。

圖3 脂質氧化和肌紅蛋白氧化的相互促進關系[23]Fig.3 Interacting oxidation reactions between myoglobin and lipid oxidation[23]

2 抗氧化作用機理的研究

為減少肉制品氧化，目前通常采用控制底物、加入抗氧化劑，糖基化反應改性及酶法處理等方法，其中最為有效的是添加抗氧化劑。對于抑制血紅素蛋白介導脂質氧化，抗氧化劑作用主要表現為改變Hb結構、控制鐵離子的釋放、調控血紅素蛋白的氧化狀態、競爭氧化作用底物四個方面。

2.1 血紅素蛋白結構對脂質氧化的影響和抗氧化作用

血色素蛋白氧化易于發生在各種肌肉中，尤其是一些魚肉中[24]。研究發現，在pH5.7和pH6.3的條件下，鱒魚和鱸魚Hb的自動氧化速率可以達牛Hb的30～80倍，其血紅素釋放速率也可到達牛Hb的50倍，這些差異與魚和哺乳動物Hb立體化學結構的不同有很大關系[25?26]。如圖4所示，牛Hb的兩個亞基Val E11的甲基基團與束縛配體之間距離為3.2～3.4 A，鱸魚的Ile（E11）正丁基側鏈上的Cd原子與束縛配體之間距離2.4 A左右，比牛Hb短很多，這種增加的空間位阻導致E11和束縛配體的結構錯亂。而且鱸魚Hb在E14位點常含有甘氨酸，而牛Hb含有較大的殘基（如丙氨酸和絲氨酸）。E14中的甘氨酸為溶劑進入血紅素縫隙提供了一個通道，從而增加了血紅素損失率，促進自動氧化，這部分地解釋了魚類Hb比牛Hb更有效地促進脂質氧化的原因[27]。血紅素裂縫中的氨基酸組成、排列順序以及血紅素口袋的大小和方向都影響質子結合和質子轉移，而血紅素結構和配體會影響質子的轉移過程和高鐵復合物的穩定性。另外，即使同樣是哺乳動物，其血紅素蛋白的結構差異也影響氧化水平。Suman等[28]比較牛和豬的Mb，發現牛OxyMb近端組氨酸（His 93）優先與HNE結合，而豬OxyMb中沒有出現這種結合，因此牛肉中OxyMb的氧化比豬肉中OxyMb氧化更常見。

圖4 不同pH下牛和鱸魚Hb結構比較[25]Fig.4 Comparison of the hemoglobin structures between bovine and perch at different pH[25]

Khadega等[29]在研究重金屬對兩種蛋白質細胞色素C（一種Hb）和Mb構象的影響中，分別添加動物來源的甘氨酸和抗壞血酸及植物來源的沒食子酸和芝麻酚，用吸收光譜的變化表示這些血紅素蛋白的結構改變，發現這些抗氧化成分對重金屬暴露具有保護作用，抗氧化劑抵消了重金屬的有害作用。添加重金屬和抗氧化劑后，過氧化物酶活性也發生改變。

槲皮素也是一種有效的抗Hb氧化的成分。MetHb能與一分子槲皮素通過共價鍵結合形成加合物，加合后Hb構象發生變化，血色素流失速率降低，從而導致Hb促脂質氧化能力下降。另外，槲皮素能夠與細胞膜發生交互作用，改變細胞膜流動性和位阻作用，從而降低脂肪酸受脂質自由基攻擊的概率，抑制脂質氧化[30]。

2.2 血色素蛋白中鐵離子對脂質氧化的影響和相應抗氧化作用

有人認為鐵元素催化脂質過氧化物形成，因此鐵的釋放和催化是脂質氧化的關鍵[2]。一方面，血色素蛋白降解產生游離鐵，游離鐵在肉中的催化氧化作用導致脂質氧化[31]；另一方面鐵離子在血色素蛋白中發生變價作用，從而導致脂質氧化[1]。例如在鱸魚的氧化中，deoxyHb和metHb在氧合態變化過程、血紅素鐵的變價過程、高鐵血紅素蛋白中血紅素的喪失及血紅素鐵的游離等過程中都能形成自由基，從而促發脂質氧化[32]。Reeder等[33]研究發現質子化鐵離子從蛋白質或卟啉中提取電子，使鐵離子快速再生。通常這種形成離子的過程發生在酸性條件下，此時還原酶被鈍化，酸催化鐵離子從二價氧化為三價，引發氧化；而堿性條件中的離子穩定作用使Mb對脂質和脂質過氧化物的反應大大降低。鐵離子的存在是否直接引發肉的氧化還存在爭議，有人在非加熱條件下對比血紅素蛋白鐵離子和無機鐵離子對脂質氧化的作用，發現無機鐵對于脂質氧化作用不大[34]，但是多數學者認為有機鐵和無機鐵的變價對于脂質氧化都相當重要。

抗氧化劑咖啡酸被用來防止卟啉降解和脂質氧化[19]。將小分子咖啡酸加入水洗肉中，它能夠通過電子轉移至Hb的配體O2上促進metHb的形成，但是同時它也束縛metHb中血紅素的分離，因此抑制Hb介導的脂質氧化[35]。Fe4+Hb是Hb被過氧化氫（H2O2）氧化生成的產物之一，它是一種強氧化劑，可產生游離的球蛋白自由基。研究發現，在Hb中加入酪氨酸后，Fe2+Hb和metHb未被氧化成Fe4+Hb，說明酪氨酸在該反應中對Hb具有保護作用，可有效抑制Hb氧化[36]。

2.3 血紅素蛋白的氧化狀態對脂質氧化的影響和相關抗氧化作用

DeoxyHb和metHb都有助于促氧化。對魚類的研究發現，還原態的deoxyHb比氧化態的metHb更易于氧化脂質，因為從還原態向氧化態氧化轉變過程中形成了超氧陰離子從而加速脂質氧化。另外，血紅素蛋白結構上具有一個血色素裂縫，當血紅素蛋白由含氧狀態轉變成脫氧狀態時，卟啉環上鐵元素從這個裂縫中被排除，使鐵更容易接觸脂質過氧化物，更容易引發氧化[37]。不同來源魚肉的Hb介導脂質氧化比較，因血紅素裂縫的大小不同而氧化能力有差異，得到了血紅素蛋白介導的脂質氧化與血紅素鐵的變化相關的類似結論[38]。Vuletich等[39]從另一個角度闡述Mb的氧化對脂質的影響，他認為Mb具有一種氧化變形態Mb-H，其氧化純磷脂酰膽堿的速率比天然Mb氧化速率高至少7倍，說明Mb-H在Mb對脂質過氧化過程發揮重要作用。采用糖基化反應對血紅素蛋白進行改性也有利于血紅素蛋白氧化狀態的改變，它能使高鐵蛋白轉化為氧合蛋白，從而降低血紅素蛋白對脂質的氧化促進作用[40?42]。

在抗氧化方面，有研究表明槲皮素能使MetHb還原為OxyHb，從而降低Hb促氧能力，抑制脂質氧化[30]。一些魚類的研究發現紅細胞具有metHb還原酶活性，當metHb由Hb自氧化作用或與亞硝酸鹽反應而產生，還原酶活性能抵消Hb自氧化作用和遇到亞硝酸鹽的可能性，從而抵抗Hb向metHb的持續氧化，其中脫氧作用顯著提高紅細胞對metHb的還原率[43]。

2.4 肉中氧化底物對蛋白和脂質氧化的影響和相應抗氧化作用

在肉制品中主要的脂質包括磷脂、膽固醇和甘油三酯，它們水解能產生游離脂肪酸（Free fatty acid，FFA）。FFA特別是不飽和脂肪酸是脂質氧化的主要成分。肉的氧化也取決于其中血色素蛋白含量和水分含量。Sannaveerappa等[44]分析水洗鱈魚肉糜模型發現Hb有時對其介導的脂質氧化不起作用，原因是水分已被洗至最低界限，因此降低Hb含量和減少水分含量可以有效降低氧化程度。Castell等[45]發現在含有Hb鱈魚肉糜中添加FFA能有效抑制脂質氧化，認為這可能與FFA和血紅素蛋白交互作用導致血紅素蛋白失去促氧活性有關[46]；也有人發現FFA能顯著抑制火雞肉糜的脂質氧化[30]。Dong等[31]發現沒食子酸對Hb具有抗氧化還是促氧化作用，主要取決于其濃度和Hb的氧化還原狀態。Wu等[47]發現添加的肌紅蛋白（Mb）促進了鱈魚洗過的肌肉中的脂質氧化，但沒有促進豬洗過的肌肉中的脂質氧化。

Tatiyaborworntham等[24]以鐵酰血紅蛋白（feryl Hb）和metHb為研究對象，探討磷脂酶A2（PLA2）對Hb介導的水洗鱈魚肌肉脂質氧化的抑制作用。發現feryl Hb可能在Hb介導的脂質氧化中發揮作用，而PLA2抑制了metHb和feryl Hb的形成，且PLA2能夠與Hb反應，清除了脂質底物中預先形成的脂質過氧化氫（LOOHs）。他們還發現隨著更多的血紅素與水洗肌肉的不溶性基質結合，脂質氧化進入指數期的滯后期也相應縮短，脂質氧化加速。而PLA2雖能夠抑制脂質氧化，卻不阻止血紅素和水洗肌肉的不溶性基質之間的相互作用[3]。吳海舟[30]發現不僅PLA2在漂洗肌肉體系中能有效抑制Hb誘導的脂質氧化，而且PLA2水解產生的FFA在抑制脂質氧化過程中也發揮重要作用。他們的抑制脂質氧化機理可能涉及FFA與血紅素蛋白結合形成了低促氧活性的高鐵血色原，另外磷脂膜水解導致細胞膜結構發生改變可能是PLA2能抑制脂質氧化的一個原因。

3 抗氧化劑在肉制品中的應用

肉制品在貯藏加工過程中，脂質和蛋白質作為主要成分易于氧化，并且兩者相互作用。其中血紅素蛋白自氧化和脂質自由基形成是肉制品氧化的開始，隨貯藏時間延長，蛋白和脂質的氧化相互作用。肉的脂質氧化不僅會影響感官特性和營養價值，還會導致有毒物質的形成，因此控制氧化過程對肉制品至關重要。盡管脂質氧化已被研究了數十年，但不同內外在條件引起的反應途徑有差異，導致脂質氧化機制尚未完全被解析。食品研究人員一直在尋找抑制肉制品脂質氧化的有效方法，在食物中添加抗氧化劑是目前最常見、最有效的方法[48]。

抗氧化劑通過提供電子中和自由基、螯合氧氣、改變系統的氧化還原電位來減少產品的的氧化劣變[49]。合成抗氧化劑對延長產品的保質期很有效，但因其具有潛在毒性，在食品中的使用存在很大局限性。目前在食品加工中用天然抗氧化劑部分或完全替代合成抗氧化劑已經成為必然。

植物富含生物活性化合物（多酚類和黃酮類等物質），可用作抗氧化劑的潛在來源，替代合成抗氧化劑用于保存肉制品并改善產品營養質量。表1是在目前肉制品中常使用的天然抗氧化劑，包括提取物的植物種類，提取物的濃度和在肉制品中的應用效果。這些天然成分以提取物和精油的形式從不同植物獲得，如水果、蔬菜、草藥和香料等。這些提取物與合成抗氧化物質相比，具有相似或更好的抗氧化性能，它們在新鮮肉制品中可以保持氧化穩定性，護色，減少脂質和蛋白質的氧化以及脂質衍生的揮發性化合物的生成，并不會影響感官屬性，其中白藜蘆醇具有顯著的肉制品抗氧化作用[50]。此外，植物成分還有助于提高原料的功能特性，提供更加多樣化的健康食品。

表1 肉制品中的天然抗氧化劑Table 1 Natural antioxidants in meat products

天然抗氧化劑在抑制血色素蛋白介導的脂質氧化也具有十分顯著的效果。Lee等[51]研究表明，植物中花青素、黃酮醇、原花青素等酚酸在Hb介導的水洗魚肌肉脂質氧化中具有抗氧化作用，其中槲皮素可有效抑制Hb介導的脂質氧化。他在鱒魚和牛的Hb研究中發現Hb與甲基的分離會形成自由基，自由基會降解原卟啉并導致脂質氧化，而加入的咖啡酸可以有效阻止卟啉的降解和脂質氧化[13]。Harun等[52]研究發現MO葉提取物可以通過抑制MetHb起到抗氧化作用。Maqsood等[53]對羅非魚Hb介導的脂質氧化和抗氧化研究中發現添加單寧酸后過氧化值降低，儲存過程中TBARS生成量也很低。在魚肌肉、魚肉末、魚油-水乳狀液和魚切片中，單寧酸對Hb介導的脂質氧化均有抑制作用。Das等[54]研究表明姜黃素、維生素E、維生素C等天然抗氧化劑能夠抑制亞硝酸鹽誘導的met-Hb形成；咖啡因及其代謝物與Hb的絡合，可以防止二價鐵的氧化。Wu等[5?6]研究發現迷迭香、抗壞血酸、生育酚和檸檬酸的混合物防止自氧化和鯡魚Hb的血紅素丟失，明顯抑制鯡魚副產品中Hb介導的脂質氧化，將保質期從1 d增加到12 d以上。Liu等[55]評估了三種天然抗氧化劑的相互作用，及其對生牛肉肉餅的顏色、脂質穩定性、metMb占比和metMb還原活性的影響，發現茶兒茶素，肌肽和α-生育酚混合物中兒茶素含量的增加可提高脂質穩定性，降低metHb百分比；肌肽對提高顏色穩定性具有顯著作用；α-生育酚和茶兒茶素增強了脂質的穩定性；三者相互作用可改善生牛肉肉餅的脂質穩定性和顏色穩定性。從這些抗氧化劑的作用效果上看，抑制血紅素蛋白的氧化是控制脂質的氧化的有效手段。

有些植物成分的抗氧化性往往具有劑量依賴性，常表現為對肉制品的氧化和抗氧化的雙重作用。Chen等[56]研究VC對牛Hb氧化還原反應的影響，發現VC在反應初期表現出抗氧化作用，后期通過產生過氧化氫來促進MetHb含量的增加，證實VC既可以抗氧化又具有促氧化能力。日常飲食物質NO2?在理論上可作為還原劑去除具有細胞毒性的ferryl Hb，有效地抑制ferryl Hb引發的蛋白羰基，然而NO2?在低濃度時卻能促進Hb-H2O2導致的蛋白質氧化[57]。Dong等[58]研究發現茶多酚通過插入其疏水口袋與Hb的色氨酸和酪氨酸殘基相互作用。這種相互作用顯示出對Hb的濃度依賴性影響，這可能導致完全相反的結果。高濃度茶多酚破壞了Hb的結構，使血紅素鐵的暴露促進Hb氧化和變色。然而，較低濃度的茶多酚不會破壞Hb結構，可以抑制高鐵血紅蛋白的形成。Napar?o等[59]進一步研究EGCG和沒食子酸，發現它們能夠氧化Hb，因為它們都含有三羥基苯甲酸殘基，但在一定濃度范圍內它們具有抑制氧化的作用。

綜上所述，大量研究證明了天然抗氧化劑可以有效抑制血紅素蛋白介導的脂質氧化。不僅可以延長貨架期，還可以改善感官屬性，提高肉品品質。此外，植物源性食品添加劑的抗氧化特性和作用機制以及在肉類工業中應用前景的研究也取得了顯著進展。盡管如此，但天然抗氧化劑的效用、可用性、市場性和潛在的健康益處尚未得到充分證明。

4 展望

肉制品中脂質和蛋白質氧化及其交互氧化導致肉品色澤、風味、質構等一系列改變。血紅素蛋白介導脂質氧化，脂質氧化反過來對血紅素蛋白也有促氧化作用。抗氧化劑可以有效地抑制血紅素蛋白氧化而延緩脂質的氧化，從而延長肉制品的貨架期。水果、蔬菜及一些農副產品等植物中的活性成分是抑制血紅素蛋白氧化的良好選擇，但尚未在肉制品中廣泛使用。這些活性成分在加入肉制品之前還需要毒性評估，以便確定適用性。因此，對此類抗氧化劑進行深入研究，探究它們抑制肉制品氧化的深層機理，將對未來肉制品抗氧化劑的廣泛使用起到至關重要的作用。