人參皂苷Rg1對(duì)高原急性缺氧大鼠肺組織損傷的預(yù)防作用

查玉杰,曹麗睿,羅 芩,楊 呂,周金華,何 慶

(1.西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院,中國四川 成都 610031;2.西南交通大學(xué)附屬醫(yī)院成都市第三人民醫(yī)院,中國四川 成都 610031)

高原環(huán)境空氣稀薄,環(huán)境中氧含量減少,在高原環(huán)境下機(jī)體氧分壓和血氧飽和度降低,容易造成組織缺氧。當(dāng)人從低海拔地區(qū)急進(jìn)到高海拔地區(qū)(海拔大于2 500 m)時(shí),由于氧氣攝入減少,體內(nèi)的血液和生化指標(biāo)發(fā)生變化,全身組織器官產(chǎn)生一系列生理和病理改變,引起以缺氧為突出表現(xiàn)的急性高原病[1],包括急性高山病(acute mountain sickness,AMS)、高原肺水腫(high-altitude pulmonary edema,HAPE)、高原腦水腫(high-altitude cerebral edema,HACE)等。急進(jìn)高原時(shí),隨海拔上升,呼吸系統(tǒng)首先受到缺氧的影響,肺泡上皮和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的各種直接和間接損傷引起機(jī)體肺損傷,最嚴(yán)重的急性肺損傷形式是呼吸窘迫綜合征,這是危重患者致死的主要原因之一[2],也是引起HAPE的直接原因。近年來的研究表明,氧化應(yīng)激、能量代謝障礙以及炎癥反應(yīng)是高原缺氧初期癥狀發(fā)生的原因之一[3～4],改善氧化應(yīng)激和能量代謝能有效預(yù)防HAPE的發(fā)生。

人參皂苷是人參的主要藥理活性成分之一,其中人參皂苷Rg1是其關(guān)鍵生物活性成分。人參皂苷Rg1具有多種生物活性作用,如抗炎、抗氧化、抗缺氧、抗衰老、提高免疫力和增強(qiáng)記憶力等[5～6]。最近的研究發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rg1能減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷,并且能通過提高自噬作用,對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)作用,其與抗生素亞胺培南聯(lián)合可以治療小鼠膿毒癥急性肺損傷[7～9]。然而,目前對(duì)于人參皂苷Rg1預(yù)防高原急性缺氧肺損傷的研究尚未見報(bào)道。紅景天苷是紅景天的有效成分,具有抗炎、抗缺氧和抗氧化的功效,常被用作緩解高原反應(yīng)的藥物[10]。

本實(shí)驗(yàn)采用低壓氧艙模擬海拔6 000 m的高原環(huán)境,構(gòu)建急性缺氧大鼠模型,以紅景天苷為陽性對(duì)照,通過預(yù)給藥的方式探究不同劑量的人參皂苷Rg1對(duì)急性缺氧肺損傷的預(yù)防作用及其相關(guān)機(jī)制,擬為預(yù)防和治療高原急性缺氧疾病提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

SD大鼠40只,SPF級(jí),雄性,體重180～220 g,購自成都達(dá)碩生物科技有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(川)2020-030,動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(川)2019-189。

1.1.2 儀器

低壓低氧艙(成都達(dá)碩生物科技有限公司,DSF高原性疾病環(huán)境模擬系統(tǒng)),酶標(biāo)檢測儀(美國伯騰儀器有限公司),電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司),臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司),病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司),烤箱(天津萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司)。

1.1.3 試劑

人參皂苷Rg1(純度≥98%,成都埃法生物科技有限公司),紅景天苷(純度≥98%,成都埃法生物科技有限公司),過氧化氫酶(catalase,CAT)測定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測試盒、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)測試盒、超微量Na+-K+-ATP酶測試盒(南京建成生物工程研究所),白介素-6(interleukin-6,IL-6)檢測試劑盒、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)檢測試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組

將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組:正常組(Normal組)、模型組(Model組)、陽性對(duì)照組(紅景天苷,Sal組)、低劑量組(人參皂苷 Rg1,Rg1-L組)、高劑量組(人參皂苷Rg1,Rg1-H組),每組8只。

1.2.2 動(dòng)物處理

40只大鼠先適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d,然后在常壓常氧條件下飼養(yǎng)7 d,每日稱重,并灌胃給藥。正常組和模型組按照10 mL/kg劑量灌胃生理鹽水;根據(jù)參考文獻(xiàn)[11]和[12],陽性對(duì)照組按25 mg/kg劑量灌胃紅景天苷,低劑量組和高劑量組分別按照25 mg/kg和50 mg/kg劑量灌胃人參皂苷Rg1,每組均連續(xù)灌胃給藥8 d。第8天正常組仍在常壓常氧下飼養(yǎng),其余4組在給藥1 h后放入低壓低氧艙內(nèi)飼養(yǎng)24 h,在此期間動(dòng)物正常進(jìn)食水。動(dòng)物進(jìn)艙后以10 m/s速度減壓上升,10 min達(dá)到海拔6 000 m,氧含量9.8%,之后維持氧含量在9.7%～9.9%,艙內(nèi)大氣壓維持在46.57～49.02 kPa,濕度維持在49%～55%。飼養(yǎng)結(jié)束后,取出每組大鼠,解剖完一組再取下一組。取出大鼠后先稱重,然后腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,打開胸腔,取肺組織。其中,左肺上葉稱重后用錫箔紙包裹烘干,用于測肺濕干比(W/D);左肺下葉投入4%多聚甲醛中固定,經(jīng)石蠟包埋、切片、染色后,檢測其病理變化;右側(cè)所有肺葉放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 肺濕干比測定

取出左肺上葉后用濾紙吸干組織表面水分,置于錫箔紙上稱重,記為濕重,然后包裹好,放入80℃烤箱內(nèi)烘烤72 h,稱取每個(gè)左肺上葉組織質(zhì)量,記為干重。濕干比=(濕重-干重)/干重×100%。

1.2.4 肺組織病理切片觀察

左肺下葉用4%多聚甲醛固定24 h后,經(jīng)脫水包埋制成蠟塊,然后切片,進(jìn)行常規(guī)HE染色。用切片掃描儀掃描切片,用瀏覽軟件在不同的倍數(shù)下觀察肺組織病理變化,并拍照記錄。

1.2.5 肺組織氧化應(yīng)激和能量代謝相關(guān)指標(biāo)檢測

根據(jù)各試劑盒說明書操作步驟,分別檢測各組大鼠右肺上葉組織勻漿中MDA、CAT、NOS水平和Na+-K+-ATP酶活力。

1.2.6 肺組織炎癥因子檢測

根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作步驟,分別檢測各組大鼠右肺下葉組織勻漿中IL-6、TNF-α水平。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和制圖,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織濕干比

為了檢測肺組織含水量的變化,我們對(duì)各組大鼠肺組織的濕干比(W/D)進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示:與正常組相比,模型組肺濕干比明顯增大(P＜0.01),出現(xiàn)肺水腫;與模型組相比,陽性對(duì)照組(P＜0.01)、低劑量組(P＜0.01)和高劑量組(P＜0.01)的肺組織濕干比均明顯減小(表1,圖1),說明紅景天苷和人參皂苷Rg1對(duì)肺水腫具有一定的預(yù)防作用。

表1 大鼠肺組織濕干比Table 1 W/D ratio of lung tissues in rats

圖1 大鼠肺組織濕干比(n=8)Normal:正常組;Model:模型組;Sal:陽性對(duì)照組 (紅景天苷);Rg1-L:人參皂苷Rg1低劑量組;Rg1-H:人參皂苷Rg1高劑量組。**P＜0.01 vs.正常組;##P＜0.01 vs.模型組。Fig.1 W/D ratio of lung tissues in rats(n=8)Normal:Normal group;Model:Model group;Sal:Positive control group(salidroside);Rg1-L:Ginsenoside Rg1 low-dose group;Rg1-H:Ginsenoside Rg1 high-dose group.**P＜0.01 vs.normal group;##P＜0.01 vs.model group.

2.2 肺組織病理變化

肺組織HE染色結(jié)果顯示:正常組肺組織結(jié)構(gòu)清晰完整,無明顯的病理改變;模型組大鼠肺組織呈現(xiàn)出明顯的病理改變,大量的炎性細(xì)胞浸潤,肺泡壁明顯增厚、斷裂,有紅細(xì)胞滲出;對(duì)比模型組,陽性對(duì)照組和人參皂苷Rg1處理組出現(xiàn)的病理改變明顯減輕,其中肺組織結(jié)構(gòu)比較清晰,炎性細(xì)胞浸潤減少,肺泡壁也無明顯的增厚,接近于正常組的肺組織形態(tài)(圖2)。

圖2 大鼠肺組織HE染色(×400,n=3)Normal:正常組;Model:模型組;Sal:陽性對(duì)照組(紅景天苷);Rg1-L:人參皂苷Rg1低劑量組;Rg1-H:人參皂苷Rg1高劑量組。Fig.2 HE staining of lung tissues in rats(×400,n=3)Normal:Normal group;Model:Model group;Sal:Positive control group (salidroside);Rg1-L:Ginsenoside Rg1 low-dose group;Rg1-H:Ginsenoside Rg1 high-dose group.

2.3 肺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)水平

氧化應(yīng)激生化指標(biāo)檢測結(jié)果顯示:與正常組相比,模型組大鼠肺組織CAT活力明顯下降(P＜0.01),MDA含量和NOS活力明顯上升(P＜0.01);與模型組相比,經(jīng)紅景天苷和人參皂苷Rg1預(yù)處理的3組大鼠CAT活力明顯升高(P＜0.05),MDA含量顯著降低(P＜0.01),NOS活力也明顯下降(P＜0.05)(表2,圖3)。

表2 大鼠肺組織氧化應(yīng)激生化指標(biāo)水平Table 2 Levels of oxidative stress in rat lungs

圖3 大鼠肺組織氧化應(yīng)激生化水平(n=8)Normal:正常組;Model:模型組;Sal:陽性對(duì)照組(紅景天苷);Rg1-L:人參皂苷Rg1低劑量組;Rg1-H:人參皂苷Rg1高劑量組。**P＜0.01 vs.正常組;#P＜0.05,##P＜0.01 vs.模型組。Fig.3 Oxidative stress levels of lung tissues in rats(n=8)Normal:Normal group;Model:Model group;Sal:Positive control group(salidroside);Rg1-L:Ginsenoside Rg1 low-dose group;Rg1-H:Ginsenoside Rg1 high-dose group.**P＜0.01 vs.normal group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs.model group.

2.4 肺組織能量代謝指標(biāo)水平

能量代謝生化指標(biāo)檢測結(jié)果顯示:低壓低氧模型組大鼠肺組織Na+-K+-ATP酶活力明顯低于正常組大鼠(P＜0.01),人參皂苷Rg1低劑量組和高劑量組的Na+-K+-ATP酶活力明顯高于模型組(P＜0.05),陽性對(duì)照組與模型組相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3,圖4)。

表3 大鼠肺組織Na+-K+-ATP酶水平Table 3 Levels of Na+-K+-ATPase in lung tissues of rats

圖4 大鼠肺組織Na+-K+-ATP酶水平(n=8)Normal:正常組;Model:模型組;Sal:陽性對(duì)照組(紅景天苷);Rg1-L:人參皂苷Rg1低劑量組;Rg1-H:人參皂苷Rg1高劑量組。**P＜0.01 vs.正常組;#P＜0.05,##P＜0.01 vs.模型組。Fig.4 Levels of Na+-K+-ATPase in lung tissues of rats(n=8)Normal:Normal group;Model:Model group;Sal:Positive control group(salidroside);Rg1-L:Ginsenoside Rg1 low-dose group;Rg1-H:Ginsenoside Rg1 high-dose group.**P＜0.01 vs.normal group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs.model group.

2.5 肺組織炎癥因子水平

肺組織勻漿ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常組相比,模型組大鼠肺組織的IL-6、TNF-α水平明顯升高(P＜0.01);與模型組相比,3組給藥大鼠肺組織的IL-6、TNF-α水平均明顯下降(P＜0.01)(表4,圖5),說明紅景天苷和人參皂苷Rg1在一定程度上能抑制IL-6和TNF-α的累積。

表4 肺組織炎癥因子IL-6、TNF-α水平Table 4 IL-6 and TNF-α levels in lung tissues

圖5 肺組織炎癥因子IL-6、TNF-α水平Normal:正常組;Model:模型組;Sal:陽性對(duì)照組(紅景天苷);Rg1-L:人參皂苷Rg1低劑量組;Rg1-H:人參皂苷Rg1高劑量組。**P＜0.01 vs.正常組;##P＜0.01 vs.模型組。Fig.5 IL-6 and TNF-α levels in lung tissuesNormal:Normal group;Model:Model group;Sal:Positive control group(salidroside);Rg1-L:Ginsenoside Rg1 low-dose group;Rg1-H:Ginsenoside Rg1 high-dose group.**P＜0.01 vs.normal group;##P＜0.01 vs.model group.

3 討論

高原有著極端自然環(huán)境,尤其是缺氧。在爬升到海拔2 500～3 000 m以上時(shí),機(jī)體會(huì)受到嚴(yán)重急性低壓缺氧的影響,導(dǎo)致諸如AMS、HAPE和HACE等疾病的發(fā)展。缺氧會(huì)導(dǎo)致肺泡上皮和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加,從而引起機(jī)體肺損傷,促進(jìn)HAPE的發(fā)生,因此,為了阻止HAPE的發(fā)生,首先就需要防治高原缺氧肺損傷。本實(shí)驗(yàn)通過模擬6 000 m高原低壓低氧環(huán)境,分析各組大鼠肺組織形態(tài)特征及氧化應(yīng)激、能量代謝指標(biāo)和炎癥因子水平,研究了人參皂苷Rg1對(duì)高原缺氧肺損傷的預(yù)防作用。肺組織濕干比和HE染色結(jié)果顯示,在本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的高原低壓低氧環(huán)境下,模型組大鼠的濕干比顯著增加,肺組織正常結(jié)構(gòu)被破壞并有大量的炎性細(xì)胞浸潤,而用不同劑量人參皂苷Rg1連續(xù)灌胃8 d的兩組大鼠則未出現(xiàn)明顯的上述變化,說明人參皂苷Rg1對(duì)其有良好的預(yù)防作用,與紅景天苷組的效果相當(dāng)。

在急性缺氧條件下,機(jī)體的氧化應(yīng)激會(huì)發(fā)生顯著變化。已有研究表明,缺氧會(huì)誘導(dǎo)活性氧形成,從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化;MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物,會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等大分子的交聯(lián)聚合,具有細(xì)胞毒性[13]。NOS可誘導(dǎo)NO的生成,而NO過量增多也會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的脂質(zhì)過氧化,并誘導(dǎo)DNA的損傷[14]。機(jī)體在新陳代謝的物質(zhì)氧化分解過程中會(huì)產(chǎn)生H2O2,它是一種活性氧,對(duì)機(jī)體的破壞性極強(qiáng),但是正常情況下機(jī)體內(nèi)過量的H2O2可以被CAT清除。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,在高原急性缺氧條件下,大鼠體內(nèi)MDA含量和NOS活力明顯升高,CAT活力下降,說明大鼠體內(nèi)抗氧化能力顯著下降,使得肺組織遭到破壞。但是,經(jīng)過預(yù)給藥的大鼠MDA含量、NOS活力顯著下降了,CAT活力也提升了,說明人參皂苷Rg1可以維持機(jī)體在高原急性缺氧條件下的氧化還原平衡,這可能與其具有良好的抗氧化活性有關(guān)。

此外,在急性缺氧條件下,機(jī)體的能量代謝也會(huì)發(fā)生改變。ATP是機(jī)體內(nèi)主要的能量物質(zhì),而Na+-K+-ATP酶是參與主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的離子泵的重要成分,在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外Na+和K+的平衡、保持細(xì)胞膜電位穩(wěn)定等方面具有重要意義[15]。缺氧會(huì)導(dǎo)致肺組織細(xì)胞膜上的Na+-K+-ATP酶活力降低,從而誘發(fā)肺水腫[16],所以保持Na+-K+-ATP酶活力有助于預(yù)防肺水腫的發(fā)生。文中結(jié)果顯示,人參皂苷Rg1能顯著提高Na+-K+-ATP酶活力,說明其預(yù)防肺水腫的機(jī)制可能與其提高Na+-K+-ATP酶活力有關(guān)。

引起炎癥反應(yīng)的原因眾多,缺氧也是其中之一。研究表明,在急性缺氧的狀態(tài)下,機(jī)體會(huì)產(chǎn)生一系列炎癥因子,包括IL-6、TNF-α等,誘發(fā)全身性的炎癥反應(yīng),并對(duì)肺血管系統(tǒng)產(chǎn)生間接影響[17]。炎癥反應(yīng)會(huì)間接導(dǎo)致肺組織通透性增加,使得血管內(nèi)的大分子物質(zhì)通過血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞,誘發(fā)肺水腫。本實(shí)驗(yàn)分別檢測了5組大鼠肺組織的IL-6、TNF-α水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組大鼠肺組織的IL-6、TNF-α水平都明顯高于正常組,而預(yù)給藥的3組大鼠的炎癥因子水平與正常組相差不大,說明人參皂苷Rg1的干預(yù)可以明顯抑制炎癥因子的累積,這種抑制作用可能與其抗炎作用相關(guān)。

綜上所述,人參皂苷Rg1能有效預(yù)防急性缺氧肺損傷的發(fā)生,這種預(yù)防作用可能與其抗氧化應(yīng)激作用、抑制炎癥因子累積以及增強(qiáng)Na+-K+-ATP酶活力相關(guān),但是其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。