甘薯響應蔓割病病原菌侵染的IbWRKY7基因克隆與表達分析

劉 意 劉泓江 陳培茹 楊新筍 雷 劍 王連軍 柴沙沙 靳曉杰 楊圓圓 程賢亮 焦春海* 張文英

(1.長江大學 農學院，湖北 荊州 434025； 2.湖北省農業科學院 糧食作物研究所，武漢 430064)

甘薯(

Ipomoea

batatas

(L.)Lam.)是我國重要的糧食、飼料、工業原料和生物質能源作物，是世界第七大糧食作物。甘薯蔓割病又稱鐮刀菌枯萎病(

Fusarium

wilt)，是一種真菌性病害，是我國南方甘薯種植區的主要病害。選育和種植抗病品種是目前最經濟有效且綠色環保的防治措施。探究抗病分子機理可提高抗病種質資源的利用效率。WRKY家族作為植物中一類重要的轉錄因子，在植物抵御逆境脅迫中起著重要的調控作用。

IbSPF1

是第1個被克隆的WRKY基因，來自于普通栽培甘薯‘高系14’。目前針對水稻(

Oryza

sativa

)和擬南芥(

Arabidopsis

thaliana

)中的WRKY研究較多。水稻的

OsWRKY22

、

OsWRKY30

和

OsWRKY45

均正調控水稻對稻瘟病菌(

Magnaporthe

grisea

)的應答反應。

OsWRKY28

和

OsWRKY76

均負調控水稻對稻瘟病菌的應答反應。

AtWRKY25

在水楊酸介導的紫丁香假單胞菌(

Pseudomonas

syringae

)防御反應中發揮負調控作用。同樣，

AtWRKY38

和

AtWRKY62

被證明負向調控擬南芥對紫丁香假單胞菌的抗性。相反，

AtWRKY33

超表達可提高擬南芥對腐生型病原菌灰霉病菌(

Botrytis

cinerea

)和黑斑病菌(

Alternaria

brassicicola

)的抗性。已有研究表明WRKY轉錄因子在植物抵御生物脅迫中既存在正向調控又有負向調控作用。目前已報道與甘薯抗蔓割病相關的基因有

IbSWEET10

和

IbBBX24

。有關在甘薯抗蔓割病病原菌侵染后甘薯的WRKY轉錄因子表達模式研究尚未見報道。本研究以‘鄂薯11’為試驗材料，克隆1個新的WRKY家族基因

IbWRKY7

，進行生物信息學分析；并對甘薯不同抗病品種在病原菌侵染后該基因的表達模式進行分析，旨在探究甘薯響應蔓割病病原菌侵染過程中

IbWRKY7

基因的表達模式，以期為揭示甘薯蔓割病抗性機理研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘鄂薯11’是湖北省農業科學院糧食作物研究所自主選育的高抗蔓割病甘薯品種；‘栗子香’是甘薯蔓割病敏感品種，由中國農業科學院甘薯研究所選育。

田間剪取健康的‘鄂薯11’和‘栗子香’薯苗主莖頂部約16 cm莖段，置于裝有清水的三角瓶(100 mL)中生長，選取生長狀態一致的健康植株，用無菌剪刀制造新的傷口，將傷口在孢子濃度為1×10個的菌液中持續浸泡。分別在侵染0、2、4、12、24、48、72、96和120 h后取莖基部(4 cm)，進行液氮速凍后保存至-80 ℃超低溫冰箱，每個處理3個重復。試驗在(28±1) ℃光照生長室(16 h光照/8 h黑暗，光照強度為3 000 Lx)中進行。

1.2 試驗方法

1

.

2

.

1

甘薯總RNA提取及cDNA合成

使用北京天漠科技開發有限公司總RNA提取試劑盒提取‘鄂薯11’和‘栗子香’總RNA。用超微量分光光度計檢測總RNA的濃度。采用TransScriptAll-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)試劑盒(北京全式金生物技術有限公司，中國)反轉錄合成cDNA第一鏈，-20 ℃存放，備用。

1

.

2

.

2

IbWRKY7

基因克隆基于有參轉錄組數據中篩選基因ID g1093的WRKY家族基因，Nr數據庫(ftp:∥ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/)注釋結果為

WRKY

7基因。利用基因ID在六倍體甘薯參考基因組數據庫(https:∥ipomoea-genome.org/)中檢索獲得甘薯

IbWRKY7

基因的CDS序列。利用Primer 5.0軟件在參考序列CDS序列兩端設計特異性引物即

IbWRKR7-CDS-F

： ATGGCAGTGGACCTTATGATGG；

IbWRKR7-

CDS-R

： CTAAGAAGACTCTAAGATTAAACTGT。

利用 PCR擴增試劑盒TaKaRa La Taq(寶日醫生物技術(北京)有限公司)進行PCR擴增， PCR 反應程序如下：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃復性30 s，72 ℃延伸1.5 min，35個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR目的產物回收、純化后，連接到pMD19-T 載體(寶日醫生物技術(北京)有限公司)，轉化DH-5α大腸桿菌感受態(北京全式金生物技術有限公司)，挑選單克隆搖菌后，進行菌液PCR鑒定。挑選陽性單克隆送奧科鼎盛生物技術有限公司(武漢)進行測序。

1

.

2

.

3

IbWRKY7

基因序列的生物信息學分析

利用NCBI網站(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)Blastp程序進行氨基酸序列比對查找同源蛋白；利用DNAMAN V6.0軟件進行多序列比對；采用MEGA 7.0軟件的Neighbor-joining法(bootstrap為1 000)構建同源序列系統進化樹；利用在線軟件Expasy(https:∥web.expasy.org/protparam/)網站分析氨基酸的分子量、等點電(pI)、不穩定系數和親水性；利用CELLO(http:∥cello.life.nctu.edu.tw/)、Cell-PLoc 2.0(http:∥www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)以及PSORT II (https:∥psort.hgc.jp/form2.html)等多種在線網站完成亞細胞定位； Plant CARE(http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線工具分析啟動子的順式作用元件，并利用GSDS 2.0(http:∥gsds.gao-lab.org/index.php)在線工具繪圖。

1

.

2

.

4

IbWRKY7

基因表達分析利用BIO-RAD CFX96實時熒光定量PCR儀(伯樂生命醫學產品(上海)有限公司)對甘薯進行實時熒光定量PCR分析。利用Primer 5.0軟件設計

IbWRKY7

熒光定量特異性引物，引物序列分別為

IbWRKY7-F

: CCCGTCGTTTCTTCTTTGC、

IbWRKY7-R

: GAGGCGGAACTTGCTGAATC，以甘薯β肌動蛋白基因為內參基因，

β

-

Actin

的擴增引物為

β

-

Actin

-

F

：AGCAGCATGAAGATTAAGGTTGTAGCAC、

β

-

Actin

-

R

：TGGAAAATTAGAAGCACTTCCTGTGAAC。利用PerfectStartGreen qPCR SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)進行PCR擴增，每個反應3次重復。熒光定量PCR反應程序如下：94 ℃預變性30 s，94 ℃變性5 s，58 S退火30 s，40個循環；溶解曲線設置為65 ℃ 5 s到95 ℃，增量為0.5 ℃/循環。

1

.

2

.

5

數據分析利用2法計算

IbWRKY7

基因相對表達量并使用DPS 7.5統計軟件對‘鄂薯11’和‘栗子香’的9個侵染時間點的莖部

IbWRKY7

基因的表達量進行雙因素方差分析和顯著性檢驗，

P

<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 IbWRKY7基因克隆及序列分析

以‘鄂薯11’ cDNA作為模板，利用

IbWRKR7-CDS-F

和

IbWRKR7-CDS-R

進行PCR擴增。由圖1可知， PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到約900 bp的單一條帶，與預期大小一致。將測序正確的CDS序列翻譯成蛋白序列，并在NCBI在線數據庫中對其蛋白序列進行blastp比對，與其他植物WRKY7蛋白同源性最高，這與Nr數據庫注釋信息吻合，因此將其命名為

IbWRKY7

。由表1可知，

IbWRKY7

的CDS序列長度為945 bp，編碼314個氨基酸；預測蛋白分子量為33.92 kU，pI 9.82，

IbWRKY7

編碼不穩定的親水性蛋白。

2.2 IbWRKY7啟動子的順式作用元件分析

利用Plant CARE啟動子在線分析網站對

IbWRKY7

基因上游2 000 bp區域序列進行分析，序列中含有啟動子的基本作用元件外，還存在多個與抗逆相關的順式作用元件(圖2)，包括3個茉莉酸甲酯應答元件(CGTCA-motif、G-box和TGACG-motif)，1個脫落酸應答元件(ABRE)，1個生長素應答元件(TGA-element)，1個防御和應激反應元件(TC-rich)，2個脅迫響應元件(MYB和MYC)等(表2)，說明該基因可能與甘薯的抗逆性相關。

M，DNA標準DL 2 000；1，IbWRKY7基因的擴增產物。 M, DL 2 000 DNA Marker； 1, Products of IbWRKY7 gene.圖1 甘薯IbWRKY7基因的克隆Fig.1 Cloning of IbWRKY7 gene from sweet potato

表1 甘薯基因序列分析
Table 1 Sequence analysis of sweet potato

基因名稱Gene name長度/bpLength氨基酸數目Number ofamino acid蛋白分子量/kUProtein molecularweight等電點pI不穩定系數Instabilityindex親水性值Grand average ofhydropathicityIbWRKY794531433.929.8246.04-0.461

圖2 IbWRKY7啟動子區的順式作用元件分布Fig.2 Distribution of IbWRKY7 promoter cis-acting elements

表2 基因啟動子抗逆相關順式作用元件
Table 2 -acting elements related to stress tolerance detected in the promoter region of

編號Code元件Element核心序列Core sequence數量Number功能Function1TC-rich repeatsATTCTCTAAC2防御和脅迫應答元件Cis-acting element involved in defense and stress responsiveness2W-boxTTGACC4激素信號轉導Hormone signal transduction3CGTCA-motifCGTCA1茉莉酸甲酯應答元件Cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness4G-boxCACGTG1茉莉酸甲酯應答元件Cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness5TGACG-motifTGACG1茉莉酸甲酯應答元件Cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness6TGA-elementAACGAC1生長素應答元件Cis-acting regulatory element involved in auxin responsiveness7ABREACGTG2脫落酸應答元件Cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness8MYCCATTTG6脅迫響應元件Cis-acting element involved in stress responsiveness

表2(續)

編號Code元件Element核心序列Core sequence數量Number功能Function9MYBCAACCA5脅迫響應元件Cis-acting element involved in stress responsiveness10AREAAACCA3厭氧誘導順式調節元件Cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction11as-1TGACG1植物激素應答元件Cis-acting element involved in hormone responsiveness12MybTAACTG2植物激素應答元件Cis-acting element involved in hormone responsiveness

2.3 IbWRKY7蛋白的相似性及進化分析

由圖3可知，與其他植物的WRKY7蛋白進行多重序列比對表明，10個WRKY7蛋白均有WRKY家族共有特點，即包含1個WRKY七肽保守序列(WRKYGQK)和1個CHC(C-X-C-X-H-X-C)的鋅指結構。IbWRKY7與其他9個WRKY7氨基酸序列具有相似性。由圖4可知，甘薯IbWRKY7與日本牽?；↖nWRKY7和三裂葉薯ItWRKY7親緣關系最近，與葡萄VvWRKY7、蘋果MdWRKY7以及櫻桃PaWRKY7等親緣關系較遠。

Ib，甘薯； It，三裂葉薯(XP_031117517.1)；St，馬鈴薯(XP_006339860.1)；In，日本牽?；?XP_019183704.1)；Ca，辣椒(XP_016561025.1)；Sp，野生種番茄(XP_015063634.1)；Nt，煙草(NP_001312942.1)；Pa，櫻桃(XP_021802303.1)；Md，蘋果(XP_008384448.2)； Vv，葡萄(XP_002283219.1)。下同。紅色框代表鋅指結構域，藍色框代表WRKY結構域。 Ib: Ipomoea batatas (L.) Lam; It: Ipomoea triloba (XP_031117517.1); St: Solanum tuberosum (XP_006339860.1); In: Ipomoea nil (XP_019183704.1); Ca: Capsicum annuum (XP_016561025.1); Sp: Solanum pennellii (XP_015063634.1); Nt: Nicotiana tabacum (NP_001312942.1); Pa: Prunus avium (XP_021802303.1); Md: Malus domestica (XP_008384448.2); Vv: Vitis vinifera (XP_002283219.1). The same below. The red box represents the zinc finger domain. The blue box represents the WRKY domain.圖3 IbWRKY7氨基酸序列與其他植物 WRKY7蛋白的多序列比對Fig.3 Multi-sequence alignment of the IbWRKY7 amino acid sequences with those in other plants

圖4 不同植物WRKY7蛋白系統發育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of WRKY7 proteins from different plants

2.4 IbWRKY7蛋白的亞細胞定位

由表3可知，利用CELLO和PSORT II預測結果均顯示IbWRKY7蛋白定位于細胞核的預測分值高于其他位置，同時Cell-PLoc 2.0預測亞細胞定位結果表明IbWRKY7蛋白定位于細胞核。綜合3種在線預測軟件分析結果表明IbWRKY7蛋白定位于細胞核。

2.5 IbWRKY7基因的表達特性分析

由圖5可知，甘薯蔓割病菌(Fob)侵染甘薯莖部后，

IbWRKY7

基因表達量在抗性不同的品種之間差異顯著。在Fob侵染后，‘鄂薯11’的

IbWRKY7

表達量在4 h達到最高隨后下降，2、4、12、24、48、72、96和120 h的表達量均顯著高于未侵染(0 h)時的表達量，而‘栗子香’的

IbWRKY7

表達量在侵染96 h才達到最高，除侵染24 h外其他7個時間點的表達量均顯著高于0 h。處理0 h，‘鄂薯11’中

IbWRKY7

表達量高于‘栗子香’但不顯著。Fob侵染2、4、12、24和48 h時，‘鄂薯11’

IbWRKY7

基因表達量顯著高于‘栗子香’，而72和96 h則相反，120 h時，兩者的

IbWRKY7

基因表達量無顯著性差異。

表3 IbWRKY7蛋白亞細胞定位
Table 3 Subcellular location prediction of IbWRKY7 protein

軟件Software細胞質Chloroplasm細胞核Nuclear線粒體Mitochondrial細胞骨架CytoskeletalCELLO0.1241.2910.8010.010PSORT II30.45%52.20%8.70%8.70%

注：數值越大代表IbWRKY7蛋白定位在該位置可能性越大。

Note: The higher the value, the more likely the IbWRKY7 protein will be located at this location.

不同小寫字母表示表達量差異顯著(P<0.05)。 Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05) in IbWRKY7 expression levels.圖5 蔓割病病原菌侵染后IbWRKY7的相對表達量Fig.5 Relative expression level of IbWRKY7 after Fusarium oxysporum f. sp. batatas infection

3 討 論

WRKY家族轉錄因子作為植物中一類重要的轉錄因子，在植物抵御生物逆境脅迫與非生物逆境脅迫中起著重要的調控作用。

CmWRKY15

基因通過影響水楊酸信號途徑正向調控菊花(

Chrysanthemum

morifolium

)對柄銹菌(

Puccinia

horiana

Henn)的抗性。過量表達

MdWRKY100

的轉基因蘋果(

Malus

domestica

)植株對炭疽病菌(

Colletotrichum

gloeosporioides

)的抗性增強，而RNAi植株對炭疽病菌更為敏感，結果表明

MdWRKY100

正向調控蘋果植株對炭疽病菌的抗性。

PlWRKY65

基因通過調節茉莉酸和水楊酸信號轉導正向調控芍藥(

Paeonia

lactiflora

)對細鏈孢霉(

Alternaria

tenuissima

)的抗性。沉默

GmWRKY40

的轉基因大豆(

Glycine

max

)毛狀根對大豆疫霉菌(

Phytophthora

sojae

)侵染的敏感性增強。Liu等研究發現

RcWRKY41

基因沉默植株對灰霉病(

Botrytis

cinerea

)的抗性降低。目前，關于甘薯中WRKY家族基因的研究較少。王連軍等在高抗根腐病甘薯品種‘徐薯18’中克隆到15個WRKY基因家族序列。朱虹等研究表明

IbWRKY2

基因正向調控轉基因擬南芥的耐旱性和耐鹽性。

IbWRKY75

基因可能參與甘薯的抗旱、耐鹽過程以及正調控甘薯葉片的衰老。張凱等利用酵母雙雜交技術從甘薯文庫篩選獲得甘薯IbWRKY61的互作蛋白主要與生物脅迫響應相關，推測

IbWRKY61

基因主要參與甘薯病原菌侵染的防御。甘薯WRKY家族基因功能研究較少，仍有待進一步挖掘和功能驗證。依據WRKY七肽保守序列數量和鋅指結構特點將WRKY蛋白分為3類：第Ⅰ類WRKY蛋白含有2個保守的WRKY七肽保守序列(WRKYGQK)和1個CH(C-X-C-X-H-X-H)的鋅指結構；第Ⅱ類WRKY蛋白含有1個保守的WRKY七肽保守序列和1個CH的鋅指結構；第Ⅲ類WRKY蛋白含有1個WRKY 七肽保守序列和1個的CHC(C-X-C-X-H-X-C)鋅指結構，大部分WRKY家族成員蛋白屬于第Ⅱ類WRKY蛋白。本研究在高抗蔓割病甘薯品種‘鄂薯11’中克隆了

IbWRKY7

基因。對IbWRKY7蛋白序列進行生物信息學分析結果表明IbWRKY7蛋白與其他幾個物種WRKY7蛋白有較高相似性，且具有相同的保守結構域(1個WRKY保守結構域和1個CHC型鋅指結構域)，因此IbWRKY7屬于第III類WRKY蛋白。綜上，本研究克隆得到的基因確為

WRKY

基因家族成員

IbWRKY7

。

IbWRKY7

基因上游啟動子區域含有多個激素應答和逆境脅迫應答相關的元件，如MYC、MYB、G-box、TGACG-motif以及ABRE等，這表明

IbWRKY7

基因可能參與甘薯響應逆境脅迫的調控。沉默

AtWRKY7

的擬南芥植株對灰霉病菌的敏感性顯著提高，而過表達

AtWRKY7

基因提高了擬南芥對灰霉病菌的抗性，表明

AtWRKY7

基因正向調控擬南芥對灰霉病菌的抗性。相反，

AtWRKY7

基因負向調控擬南芥對細菌類病原菌紫丁香假單胞菌抗性。鄭超研究表明

OsWRKY7

基因可能負向調控水稻對白葉枯病菌(

Xanthomonas

oryzae

)免疫應答，降低水稻植株對白葉枯病的抗性。擬南芥中異源表達大白菜(

Brassica

rapa

L. ssp.

pekinensis

)

BrWRKY7

基因可提高擬南芥對腐生型病原菌軟腐果膠桿菌(

Pectobacterium

carotovorumb

ssp

.

carotovorum

)的抗性。以上研究表明

WRKY7

基因在植物應答病原菌中發揮重要作用。本研究利用蔓割病病原菌侵染感病品種‘栗子香’和抗病品種‘鄂薯11’，并對

IbWRKY7

基因的表達模式進行了分析。結果顯示，病原菌侵染后，2個品種

IbWRKY7

基因均顯著上調，‘鄂薯11’中的表達量在4 h達到最大值而‘栗子香’在侵染96 h才達到最大值，并且侵染2、4、12、24和48 h，‘鄂薯11’中的

IbWRKY7

基因表達量顯著高于‘栗子香’。因此侵染前期

IbWRKY7

基因在抗病品種中的表達量更高，表明‘鄂薯11’中

IbWRKY7

基因更快速響應蔓割病病原菌的侵染。

IbWRKY7

基因可能在甘薯早期響應蔓割病病原菌侵染過程中起重要作用，有待進一步利用轉基因植株進行功能驗證。

4 結 論

本研究表明甘薯

IbWRKY7

基因上游2 000 bp的區域含有12種激素應答和脅迫應答相關的順式作用元件。

IbWRKY7

的CDS序列全長為945 bp，編碼314個氨基酸，預測蛋白分子量為33.92 kU，pI 9.82，編碼不穩定的親水性蛋白，具有WRKY家族的典型結構特征即1個WRKY七肽保守序列和1個CHC型鋅指結構，屬于第Ⅲ類WRKY蛋白，氨基酸序列與同源物種相似度高，進化上高度保守。

IbWRKY7

基因不僅受Fob侵染誘導表達而且在不同蔓割病抗性品種中表達量差異顯著。