略陽烏雞開產日齡遺傳參數估計和FSHR基因序列變異與開產日齡的關聯性分析

張志遠 呂鑫瑩 趙家悅 王哲鵬

(西北農林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100)

雞開產日齡是一個與繁殖和生長性能均有密切聯系的指標。預估開產日齡的遺傳參數，分析卵泡發育調控基因遺傳變異與開產日齡的關系，對揭示開產日齡的遺傳決定性及性狀間的遺傳關系，篩選潛在的功能突變，建立適宜育種方案提高地方雞產蛋性能具有重要意義。

開產日齡(性成熟時間)與產蛋數存在負相關，即開產越早，產蛋數越多。但是，如果在體重不達標的情況下提早開產，將對后期產蛋耐力產生極為不利的影響。為了定量評估遺傳效應對雞開產日齡的決定性，探索開產日齡與產蛋數的遺傳關系，前人對開產日齡的遺傳參數進行了深入研究。Dana等在埃塞俄比亞地方雞中估計的開產日齡遺傳力最低，為0.06。Savegnago等在白來航雞中估計的結果最高，為0.54。此外，研究人員對伊朗、坦桑尼亞、泰國、韓國、巴西地方雞和洛島紅、洛克等培育品種的開產日齡遺傳力進行估計，不同品種遺傳力估計結果差異較大，平均值為(0.3±0.1)。為闡明開產日齡與產蛋數的關系，為產蛋數間接選擇提供依據，研究人員也對二者的遺傳關系進行深入研究。Kamali等在伊朗地方雞中得出開產日齡與開產后12周內產蛋數的遺傳相關為-0.85，而Niknafs等在伊朗馬贊達蘭地方雞中對同時期產蛋數與開產日齡的遺傳相關系數估計后，發現二者的遺傳相關系數僅為-0.41。開產日齡與產蛋數的遺傳關系不僅在不同品種中得出的結果各不相同，而且在同一品種內二者的遺傳關系也會隨產蛋期的長短呈現較大的變異。這些結果表明不同品種開產日齡遺傳基礎存在較大差異，遺傳參數難以跨品種應用。

略陽烏雞是產自陜西省略陽縣的地方雞，該品種具有體型大、蛋肉品質好、營養豐富，對放養適應性強等優點，但也存在產蛋性能差的不足。略陽烏雞平均開產日齡為147 d，開產到40周齡產蛋數為(54.7±20.4)枚，其產蛋性能遠遠低于商業蛋雞品種。略陽烏雞在產蛋性能方面的不足增大了雞蛋和雞苗的生產成本，使烏雞產品難以以較低的價格走向市場，對烏雞產業的發展造成了極為不利的影響。因此，估計略陽烏雞品種特異性遺傳參數對略陽烏雞開產日齡選育具有必要性。

促卵泡素受體(FSHR)是介導FSH信號的受體，在調節卵泡招募、卵泡選擇和層級卵泡發育過程中發揮重要作用。研究表明，

FSHR

基因序列變異與雞開產日齡顯著關聯，是影響家禽開產日齡的一個重要候選基因。在估計開產日齡遺傳參數的基礎上，本研究進一步選取

FSHR

基因為對象，分析

FSHR

基因與略陽烏雞開產日齡的關聯性。本研究測定略陽烏雞開產日齡、開產到30、40和56周齡產蛋數，分析

FSHR

基因內3個錯義突變與略陽烏雞開產日齡的關聯性，旨在定量評估遺傳效應對開產日齡的決定性及開產日齡與各時期產蛋數間的遺傳關系，篩選與開產日齡存在顯著關聯性的分子標記，為略陽烏雞開產日齡育種方案的制定和分子輔助育種方法的建立奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 略陽烏雞的養殖和表型數據采集

略陽烏雞作為一個地方品種，未受系統選育。該品種維持了較大的表型變異性和遺傳多態性，是開展經濟性狀QTL定位的理想群體。本研究所用樣本為略陽烏雞蛋用系二世代675只母雞。這些雞來自46個半同胞家系，295個全同胞家系，為同一批次孵化，在同一棟雞舍飼養。在56日齡前采用籠養育雛，1～21日齡養殖密度為40只/m，21～56日齡養殖密度為30只/m。育雛溫度和光照按標準育雛程序執行。57日齡轉入產蛋雞舍，單籠飼養。開產前采用自然光照，開產后逐步將光照時間延長至16 h，光照強度為20 Lux。全期采用商業全價蛋用雛雞料、青年雞濃縮料和產蛋雞濃縮料(陜西華秦農牧有限公司)飼喂，飼養周期為2018年3月7日—2019年4月8日。養殖工作在陜西龍佳農業科技發展有限公司完成。

將雞開始產第1枚蛋的時間定義為開產日齡。從17周齡開始，每日記錄每只母雞的開產日齡和產蛋數，直到56周齡。30周齡和40周齡是略陽烏雞產蛋高峰開始和結束的兩個重要時機節點。本研究將開產到30周齡，40周齡和56周齡的產蛋數定義為3個數量性狀，分析開產日齡與不同時期產蛋數間的遺傳關系。以下四分位數-1.5×四分位距為下限，上四分位數+1.5×四分位距為上限，刪除開產日齡、30、40和56周齡產蛋數異常值。

1.2 開產日齡的遺傳力及開產日齡與產蛋數間遺傳相關估計方法

本研究對675只略陽烏雞母雞開產日齡及開產日齡與不同階段產蛋數的遺傳相關進行了估計。開產日齡的遺傳力用單變量動物模型

y

=

b

+

a

+

e

進行估計，

y

為開產日齡測定值向量，

X

為性別效應相關設計矩陣，

Z

為育種值效應設計矩陣，

b

、

a

、

e

分別為性別、育種值和殘差效應向量。開產日齡與各階段產蛋數性狀間的遺傳相關用雙變量動物模型進行估計，

y

為性狀1和性狀2的表型值向量，

X

為固定效應設計矩陣，

Z

為育種值效應設計矩陣，

b

、

a

和

e

分別為性狀1和性狀2的平均值、育種值和殘差向量(

i

=1,2)，運算過程均由R語言MCMCglmm包完成。采用逆伽瑪分布指定育種值和殘差項方差先驗分布。在單變量模型中逆伽馬分布的參數為V=1，nu=0.002。在雙變量模型中，逆伽馬分布的參數為貝葉斯算法迭代次數為130 000，舍棄前30 000次迭代結果，每100次抽取一個參數估計值，獲得各參數后驗分布。使用posterior.mode命令求得遺傳力和遺傳相關系數后驗分布眾數，用HPDinterval命令求得遺傳力和遺傳相關系數的95 %置信區間。使用Performance Analytics包的chart.Correlation命令計算各性狀間的表型相關系數。

1.3 FSHR基因內3個錯義突變基因型檢測方法

在前期研究中，本研究用RNA-seq技術檢測了40周齡略陽烏雞層級前卵泡轉錄組(數據未發表)。本研究在

FSHR

基因中發現3個錯義突變(表1)，這些突變在略陽烏雞中處于分離狀態。本研究將分析3個錯義突變與略陽烏雞開產日齡的關聯性。

翅靜脈采血0.5 mL，用ACD抗凝(血液∶ACD=3∶1)后，置于-80 ℃冰箱保存備用。ACD抗凝劑的配方為0.48 g檸檬酸，1.32 g檸檬酸三鈉，1.47 g葡萄糖，用雙蒸水溶解后定容至100 mL。取20 μL抗凝血，用FlexGen Blood DNA試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)按試劑盒說明提取基因組DNA。

用Sequenom MassARRAY平臺檢測3個錯義突變的基因型，檢測樣本為675只二世代母雞。多重PCR反應在384孔PCR板中進行，反應體系由10 ng基因組DNA，0.5 μmol/L正鏈引物和0.5 μmol/L反鏈引物，8 mmol/L MgCl，2.5 mmol/L dNTP，1 U熱啟動酶(NEB)，0.625 μL10×PCR緩沖液和1.75 μL ddHO組成。PCR引物和單堿基延伸反應引物用Sequenom Assay Designer 3.1軟件設計，引物序列見表1。PCR反應條件為94 ℃變性5 min，(94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s)×45個循環，72 ℃延伸3 min。用蝦堿性磷酸酶(SAP；NEB)對PCR產物進行去磷酸化處理。反應體系為0.3 μL (1.7 U/μL) SAP，0.17 μL 10×SAP緩沖液，1.53 μL ddHO和5 μL PCR產物。去磷酸化反應條件為37 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min。對SAP去磷酸化產物執行iPLEX單堿基延伸反應，檢測錯義突變基因型，iPLEX單堿基延伸引物序列見表1。iPLEX單堿基延伸反應體系由0.2 μL 10×iPLEX buffer, 0.2 μL iPLEX終止子, 0.041 μL iPLEX酶，0.755 μL HO和0.8 μL延伸引物。反應條件為94 ℃變性30 s，(94 ℃變性5 s，(52 ℃退火5 s，80 ℃延伸5 s)×5個循環)×40個循環，72 ℃延伸3 min。延伸反應產物用nano-dispenser (Sequenom)點在SpectroCHIP II上，用SpectroAcquire采集數據，用MassArray Typer 4.0軟件獲取基因分型結果。Sequenom MassARRAY實驗由北京康普森生物技術有限公司完成。

表1 基因錯義突變信息和基因型檢測所用引物
Table 1 gene non-synonymous mutations information and the primers used in genotyping

變異名稱①Variation namedbSNP登陸號dbSNP number錯義突變Non-synonymousmutations位置LocationMassARRAY引物(5'-3')②Primers of MassARRAY (5'-3')g.8066842C>Trs14317609Thr46IleExon 1ACGTTGGATGACAGTTCTGTGGCATTGGTGACGTTGGATGGTGAAGGCAGGATATTCATCtCGGGGCAGCTGGACCACCTTGg.8124699A>Grs312312510Lys151ArgExon 5ACGTTGGATGGCAAGACATTCATAAGGAGCACGTTGGATGGCCTTAGCTTTTTACCCGTCcAAACTTTCTGGAAGGAGTGCACCg.8142094T>Crs13504817Met335ThrExon 10ACGTTGGATGAGGAAACACAGACGATCTGCACGTTGGATGTCAAATTCGTTCTCCGCAGGATTATATTTCCCATTATGGCA

注：①變異物理位置根據UCSC數據庫公布的Galgal 6.0版雞參考基因給出。②錯義突變的基因型用3條引物檢測，前2條引物為PCR用引物，第3條引物為單堿基延伸反應用引物。

Note: ① The physical location of the variation is given according to Galgal 6.0 chicken genome assembly in the UCSC database. ② Three primers were used to genotype three non-synonymous variants, of which the first two were used for PCR and the third for single base extension reaction.

1.4 FSHR基因內3個錯義突變與開產日齡的關聯性檢驗方法

用單變量線性混合模型

y

=

μ

+

G

β

+

b

分析錯義突變基因型與開產日齡的關聯性，

y

為個體

i

的開產日齡，

μ

為群體均值，

G

為個體

i

的基因型，

β

為等位基因的加性遺傳效應，

b

為隨機效應，是方差組分參數，V是一個675×675的親緣關系矩陣。單變量線性混合模型計算過程用R語言的GMMAT包完成。當

P

<0.05時表示差異顯著。

1.5 FSHR基因錯義突變保守性分析方法

從Ensembl數據庫(http:∥asia.ensembl.org/)下載雞(ENSGALG00000009100)、火雞(ENSMGAG00000005711)、鴨(ENSAPLG00000003689)、鹟(ENSFALG00000011021)、斑胸草雀(ENSTGUG00000005697)、人(ENSG00000170820)、豬(ENSSSCG00055018995)、小鼠(ENSMUSG00000032937)、大鼠(ENSRNOG00000016783)、牛(ENSBTAG00000032424)的FSHR蛋白序列，用EMBL-EBI中的Clustal Omega在線多序列比對程序(https:∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)分析鳥類與哺乳動物FSHR蛋白的保守性，用Mview顯示分析結果。

2 結果與分析

2.1 開產日齡與產蛋數描述統計

略陽烏雞蛋用系二世代平均開產日齡為(147.5±7.8) d，其中，75%的雞會在151日齡前開產(圖1)。30周齡平均產蛋數為(28.0±7.6)枚，40周齡平均產蛋數為(58.6±15.0)枚，56周齡平均產蛋數為(75.1±20.4)枚(圖1)。略陽烏雞二世代開產時間相對集中，變異系數為5.4 %，但各階段產蛋數存在較大群體變異性，變異系數達25.7%～27.1%。

圖中每個散點代表一個樣本的表型測定結果，背景箱線圖標出了各性狀的下限(Q1-1.5×(Q3-Q1))、下四分位數(Q1)、中位數、上四分位數(Q3)和上限(Q3+1.5×(Q3-Q1))的位置。 Scattered points represents the phenotypic values of samples. The boxplot shown as background shows the positions of lower inner fence (Q1-1.5×(Q3-Q1)), lower quartile (Q1), median, upper quartile (Q3) and upper inner fence (Q3+1.5×(Q3-Q1)) of each trait.圖1 略陽烏雞開產日齡(a)和產蛋數分布(b)Fig.1 Distribution of age at the onset of egg laying (a) and egg numbers (b) of Lueyang black-boned chicken

2.2 開產日齡遺傳力及開產日齡與產蛋數遺傳相關分析

略陽烏雞開產日齡遺傳力為0.08，表明該性狀受遺傳以外因素影響較大(圖2)。開產日齡與各時間段內產蛋數存在較強的負遺傳相關性，但受環境因素影響，表型相關性較弱，且表型相關性隨產蛋時間的延長而減小(表2)。各時間段產蛋數間存在強遺傳和表型相關性(表2)。

圖中曲線描繪了1 000個后驗遺傳力概率分布，圖上數字為開產日齡后驗遺傳力眾數，括號中的數字給出了后驗遺傳力95 %置信區間。 The curve shows probability distribution of 1 000 posterior heritabilities. The number on theFigure is the mode of posterior heritabilities. Numbers in the parentheses show 95% confidence interval for the posterior heritability.圖2 開產日齡后驗遺傳力概率分布Fig.2 The posterior heritability probability distribution of age at the onset of egg laying

2.3 雞FSHR基因錯義突變的保守性及其與開產日齡的關聯性

為進一步探索略陽烏雞開產日齡的分子基礎，本研究以

FSHR

基因為對象，研究了

FSHR

基因內三個錯義突變的保守性，及錯義突變與開產日齡的關聯性。序列比對結果顯示，FSHR第46位氨基酸在各物種中不保守，蘇氨酸只在雞FSHR蛋白中出現，其余物種在該位點均為絲氨酸。雞FSHR蛋白第151位賴氨酸在所比對的物種中完全保守。第335位氨基酸在各物種中并不保守，有五種氨基酸出現，但該位點氨基酸的疏水性完全保守(圖3)。序列比對結果顯示，在3個錯義突變中有2個錯義突變(Lys151Arg和Met335Thr)發生在氨基酸或理化屬性較為保守的位點，為進一步闡明這些保守性氨基酸的改變是否關聯到表型，本研究進一步檢驗了3個錯義突變與略陽烏雞開產日齡的關聯性。Thr46Ile的C等位基因和Met335Thr的T等位基因對開產日齡具有負的等位基因效應，Lys151Arg的A等位基因顯示出正的等位基因效應(表3)。但是，上述等位基因效應均未達到統計顯著水平(

P

>0.05)(表3)。

表2 開產日齡與各時間點產蛋數的遺傳相關與表型相關分析
Table 2 Genetic and phenotypic correlations analysis between age at the onset of egg laying and egg numbers at three periods

性狀1Trait 1性狀2Trait 2遺傳相關系數Genetic correlationcoefficient①表型相關系數Phenotypic correlationcoefficient②30周齡產蛋數 EN30-0.98 (-0.99, -0.82)-0.59 (<0.001)開產日齡AOE40周齡產蛋數 EN40-0.98 (-1.00, -0.80)-0.37 (<0.001)56周齡產蛋數 EN56-0.98 (-1.00, -0.70)-0.21 (<0.001)30周齡產蛋數EN3040周齡產蛋數 EN400.99 (0.89, 1.00)0.73 (<0.001)56周齡產蛋數 EN560.99 (0.84, 1.00)0.48 (<0.001)40周齡產蛋數EN4056周齡產蛋數 EN561.00 (0.94, 1.00)0.79 (<0.001)

注：①括號中的數字是遺傳相關系數95%置信區間。②括號中的數字是表型相關系數顯著性檢驗的值。

Note: ① Numbers in parentheses represent 95% confidence interval of genetic correlation; ② Numbers in parentheses are the values of significance test. AOE=age at the onset of egg laying, EN30-56=egg numbers from age at the onset of egg laying to 30, 40, 56 weeks of age.

3 討 論

開產日齡作為一個最早能被測定的繁殖性狀，揭示它的遺傳基礎對雞產蛋性能早期選擇具有重要意義。本研究估測了略陽烏雞開產日齡的遺傳力及開產日齡與不同時期產蛋數性狀間的遺傳相關，并以

FSHR

基因為對象對開產日齡的分子基礎進行了初步探索。開產日齡作為一個重要的繁殖性狀，之前已有大量研究對其遺傳力進行估計，所得結果為0.06～0.54。這表明不同品種開產日齡遺傳基礎存在較大差異，估計品種特異性遺傳力有其必要性。本研究發現略陽烏雞開產日齡遺傳力只有0.08，與埃塞俄比亞Horro雞(

h

=0.06)、韓國灰褐雞(

h

=0.12)的遺傳力估計結果較為接近，但遠遠低于選育程度較高的商業品種(

h

=0.24～0.54)。本研究推測商業品種開產日齡遺傳力的升高可能與在高強度選擇和近交下相關突變的富集與固定有關。

在開產日齡與產蛋數的遺傳關系方面，Sang等在韓國地方雞中獲得的遺傳相關估計結果在-0.81～-0.5，Kamali等和Niknafs等在伊朗地方雞中得出遺傳相關估計結果與Sang等的估計結果較為接近，為-0.85～-0.41，Tongsiri等在泰國地方雞中估計的遺傳相關系數為-0.73，但Lwelamira等在坦桑尼亞地方雞中得出結果僅為-0.19～-0.15。上述研究表明，開產日齡與產蛋數的遺傳相關關系雖然在相關的強弱程度上不同研究得出的結果存在較大差異，但在相關性質上二者均維持了較為穩定的負遺傳相關關系，只有Savegnago等在白來航雞中得出弱(0.04～0.06)正遺傳相關性。在本研究中，這種負遺傳相關關系得到證實，支持引起雞性成熟時間縮短的遺傳變異，對雞產蛋性能也發揮著正面作用。但是，依據開產日齡對產蛋數進行早期間接選擇仍需慎重。因為，在表型相關方面，由于受環境因素影響較大，二者相關強度明顯低于遺傳相關。而且，開產日齡與產蛋數的相關性與產蛋時間的長度也有關系。總的趨勢是隨產蛋時間延長，相關性逐漸減弱。類似的變化趨勢在巴西地方雞中也曾被報道。這些結果說明依據開產日齡對略陽烏雞30周齡產蛋數進行早期間接選擇有望取得理想選育效果，但對56周齡甚至全期產蛋數進行預測可靠性并不高。鑒于早期產蛋數與后期產蛋數間存在較強遺傳和表型相關關系，依據早期(30周齡)產蛋數對后期(40周齡以后)產蛋數做出預測有望取得更理想的選育效果。

FSHR

是調節動物卵泡發育的一個功能基因。之前研究曾發現

FSHR

基因啟動子區和內含子變異與家禽開產日齡顯著關聯，支持

FSHR

是調節家禽性腺發育的一個重要候選基因。本研究分析了3個錯義突變的保守性及其與開產日齡的關聯性。Lys151Arg和Met335Thr發生在氨基酸或氨基酸理化屬性較為保守的位點，暗示這些氨基酸在維持FSHR蛋白的高級結構和功能方面很可能發揮著重要作用。例如，ADAMTS13蛋白的Arg484Lys對其表達和特異性活性有顯著影響，發生在

SRY

基因DNA binding domain中的Met21Thr將對人性別決定產生負面影響。但是，關聯分析并未檢測到Lys151Arg和Met335Thr與略陽烏雞的開產日齡顯著關聯。對此，本研究推測有三種可能性：(1)這些錯義突變具有功能，但表型效應較小，在現有的樣本量和統計模型下難以檢出這種表型效應；(2)錯義突變對FSH信號的影響可能被其他信號通路補償，使得這些功能性突變難以表現出表型效應；(3)這些突變并沒有影響FSHR的結構和功能。Lys151Arg很可能屬于這種情況，因為Lys151Arg雖然發生在一個非常保守的位點，但Lys和Arg均屬極性帶正電荷氨基酸，相同的理化屬性可能決定了這種氨基酸的替換并不具有生物學功能。盡管如此，Thr46Ile和Met335Thr均涉及到氨基酸極性的變化。這種理化屬性的改變是否足夠改變FSHR的結構和功能，仍需蛋白高級結構預測和試驗性研究加以驗證。

圖中pid下的值表示其他物種FSHR蛋白的氨基酸序列與雞FSHR蛋白序列的相似性。黑色箭頭標出了錯義突變Thr46Ile、Lys151Arg和Met335Thr的位置。不同背景顏色代表不同的氨基酸理化性質，其中，綠色表示疏水，藍色代表帶負電荷，紅色代表帶正電荷、黃色表示半胱氨酸，紫色表示極性氨基酸。最后一行字母和符號標出了該位氨基酸殘基理化屬性的保守性，大寫字母表示保守的氨基酸，“.”表示不保守，“+”表示正電荷，“-”表示負電荷，“a”表示芳香族，“c”表示帶電荷，“h”表示疏水性，“l”表示脂肪族，“p”表示極性。 Pid indicates the identity of amino acid residues of FSHR proteins between other species and chicken. The black arrows indicate the locations of non-synonymous mutations of Thr46Ile, Lys151Arg and Met335Thr. Different color backgrounds represent different physical and chemical properties of amino acids, green=hydrophobic, blue=negative charge, red=positive charge, yellow=cysteine, purple=polar. Letters and symbols at the lower line indicates the 100% consistent physical and chemical properties of amino acid residue. Capital letters represent conserved amino acids. “.”=unconserved, “+”=positive charge, “-”=negative charge, “a”=aromatic, “c”=charged, “h”=hydrophobic, “l”=aliphatic, “p”=polar.圖3 鳥類與哺乳動物FSHR蛋白的氨基酸序列多重比對分析Fig.3 Multi-alignment analysis of amino acid sequences of FSHR proteins of birds and mammals

表3 基因內3個錯義突變與略陽烏雞開產日齡的關聯性
Table 3 Association of three non-synonymous mutations in the gene with age at the onset of egg laying of Lueyang black-boned chicken

名稱Name效應等位基因Effect allele開產日齡均值±標準差(基因型頻率)Mean±SD of AOE (Genotype frequency)AAABBB等位基因效應值Allele effect valueP值P valueThr46IleC146.92±7.75(0.15)147.45±7.96(0.49)147.66±7.96(0.36)-0.33±0.490.506 2Lys151ArgA146.97±7.58(0.05)147.83±7.96(0.38)147.23±7.96(0.57)0.41±0.580.475 4Met335ThrT147.56±7.97(0.89)145.85±7.60(0.09)149.53±7.56(0.02)-0.018±0.820.981 9

注：AA, AB, BB指每個錯義位點的3種基因型。

Note: AA, AB and BB represent three genotypes of each non-synonymous mutation.

4 結 論

本研究發現略陽烏雞開產日齡遺傳力較低，且

FSHR

基因序列變異與開產日齡不存在關聯性，表明遺傳效應對開產日齡的調控作用較小。但是，開產日齡與產蛋數存在較強負遺傳相關性。這些結果建議，對略陽烏雞開產日齡而言，飼養管理是更為有效的調控手段。依據開產日齡對產蛋數進行早期間接選擇具有可行性，但間接選擇的準確性會隨產蛋期的延長而降低。