梅花鹿KGF的基因克隆及在不同時期頂端茸皮組織的表達分析

郭夢雅 韓若冰 邢海華 張芙蕊 李和平

(東北林業大學 野生動物與自然保護地學院，哈爾濱 150040)

鹿茸是雄性鹿科動物尚未骨化并帶有茸毛的幼角，是哺乳動物唯一能夠周期性脫落并完全再生的復雜器官。鹿茸具有較高的經濟價值，主要表現為藥用價值和科學研究價值。我國自古將鹿茸作為傳統名貴中藥材，認為其具有補腎壯陽、強筋健骨、抗氧化和抗腫瘤等功效。鹿茸可以周期性再生且生長速度快，約為1～2 cm/d，超過了某些癌組織的生長速度。鹿茸獨特的生長發育方式有它特殊的物質基礎，現階段已有研究發現由眾多基因形成多重的基因網絡調控鹿茸各個生長時期的生長發育，這使得鹿茸變成了一個天然的細胞生長因子庫，為研究哺乳動物細胞發生、生長與分化提供了理想模型。除此之外，鹿茸再生也被作為再生醫學的熱點研究模型，對人類再生醫學產生深遠影響。

角質細胞生長因子(Keratinocyte growth factor，

KGF

)又名成纖維細胞生長因子-7(Fibroblast growth factor-7，

FGF

-7)，是

FGF

s 超家族中角質細胞生長因子家族的成員之一。最初由Rubin等從人類胚胎肺成纖維細胞系M426培養的上清液中分離提純獲得，能夠促進小鼠角質細胞的有絲分裂，主要通過旁分泌和自分泌的兩種方式對各種組織中上皮細胞的增殖分化進行調節。

KGF

基因編碼的蛋白在機體內有重要的生物學功能，它在人的健康皮膚中弱表達，但在皮膚損傷后的真皮成纖維細胞(

DFB

s)中表達強烈上調，從而促進皮膚再上皮化，加速了傷口收縮，也有研究發現KGF促進了大鼠皮膚傷口愈合的血管化作用。現階段對KGF的研究大多集中在人類醫學領域，將其作為一種基因治療劑來促進各類組織器官的創傷愈合。基于鹿茸生長發育中許多特殊的生理現象與KGF蛋白的生物學功能特點相似，有學者推測

KGF

基因可能與茸角周期性再生的起始以及后期的發育息息相關。已有研究克隆了馴鹿和梅花鹿

KGF

基因部分啟動子區序列，通過比較甲基化水平差異推測其表達水平的高低。鄭文靜克隆了馬鹿

KGF

基因，并分析

KGF

基因與其他生長因子在轉錄水平的差異，然而梅花鹿

KGF

基因的CDS序列尚未見報道，其作用在鹿茸各生長時期的規律特點尚不明確，前期鹿茸創口愈合后

KGF

是否繼續發揮其他作用還不清楚，亟需進一步探索。本研究旨在以鹿科典型代表動物——梅花鹿(

Cervus

nippon

)為研究對象，以梅花鹿鹿茸生長前期、中期、后期3個不同生長時期的頂端茸皮組織為試驗材料，通過克隆得到

KGF

基因cDNA的完整編碼區序列后進行相關生物信息學分析，并構建系統進化樹，為全面了解與鹿茸生長相關的基因奠定基礎。同時運用實時熒光定量PCR技術探索

KGF

基因在梅花鹿鹿茸頂端茸皮組織3個時期的表達量差異，為進一步研究KGF蛋白在鹿茸生長發育不同時期可能發揮的作用奠定基礎，為鹿茸生長發育的分子調控機理的研究和哺乳動物開展組織創傷修復、腫瘤發生及皮膚再生的研究提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取哈爾濱市金地鹿業的3頭健康成年雄性東北梅花鹿為試驗動物，于2018年分別采集其鹿茸生長前期(小鞍子、約30 d)、中期(二杠、約60 d)、后期(三杈、約90 d)的頂端茸皮組織為試驗樣品，采集后將樣品迅速放入滅菌的無RNA酶的凍存管中，置于液氮中保存備用。

1.2 主要試劑

柱式動物RNAout試劑盒(71201)，購自北京天恩澤基因科技有限公司；DEPC，購自Sigma公司；2×Rapid

Taq

Master Mix、DL2 000 DNA Marker購自南京諾唯贊生物科技有限公司；反轉錄試劑盒(RR047A)、pMD18-T 載體、大腸桿菌DH5α感受態細胞、核酸染料、熒光定量PCR試劑盒(RR820A)、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒(9762)購自TaKaRa公司；瓊脂糖，購自Gigco公司。

1.3 總RNA的提取及cDNA合成

將樣品在盛有液氮的研缽中徹底粉碎，粉碎后的樣品根據柱式動物RNAout試劑盒說明書按步驟提取樣品的總RNA并純化，用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，同時用紫外分光光度計檢測提取總RNA的濃度和純度。之后將所得RNA按照PrimeScrip RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒說明書反轉錄為cDNA。反轉錄反應分為兩步，第一步去除基因組DNA，反應體系：5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，Total RNA 2.0 μL，ddHO 5.0 μL，總體系 10.0 μL，反應條件：42 ℃ 2 min。第二步合成cDNA第一條鏈，反應體系：步驟一反應液 10.0 μL，Prime Script RT Enzyme MixⅠ 1.0 μL，RT Primer Mix 1.0 μL，5×Prime Script Buffer2 4.0 μL，ddHO 4.0 μL，總反應體系20.0 μL，反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，將cDNA置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.4 梅花鹿KGF基因的擴增與克隆

1

.

4

.

1

引物設計與合成參考Genebank數據庫中白尾鹿(

Odocoileus

virginianus

)、牛(

Bos

taurus

)、羊(

Ovis

aries

)等同源物種

KGF

基因的mRNA序列中的CDS區上、下游設計引物。利用Oligo7軟件設計的引物序列如下：上游引物

KGF

F，5′ATGCGCAAATGGATACTGACATGGAT3′；下游引物

KGF

R，5′CTCCCTGCTGGAACTGGTTTCT3′。

1

.

4

.

2

KGF

基因擴增與克隆以梅花鹿茸皮組織cDNA作為模板，

KGF

F和

KGF

R為上、下游引物，經PCR反應后回收目的基因擴增產物，將其與PMD18-T載體在16 ℃連接1 h 后轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，在含有Amp、IPTG、X-gal的LB固體培養基上37 ℃培養14～18 h后進行藍白斑篩選，挑取白色菌落至含有Amp的LB液體培養基中，37 ℃、120 r/min搖菌培養8 h，經菌液PCR驗證陽性克隆。

1.5 梅花鹿KGF基因序列測定

將克隆成功的菌液送往生物公司進行雙向測序，得到的測序結果先應用DNAStar中的Seqman模塊對測序峰圖進行查看校準，然后通過ORFfinder進行開放閱讀框查詢后獲得準確的cDNA編碼區序列，最后將其翻譯為氨基酸序列展開生物信息挖掘。

1.6 梅花鹿KGF基因的生物信息學分析

通過Blast功能對測序結果進行比對驗證，同時對目的基因在各物種間的相似性進行初步分析。將測序得到的

KGF

基因的編碼區翻譯為氨基酸序列，分別利用ExPASy在線服務器中的ProtParam程序、TMpred程序、Swiss-Model程序對

KGF

基因編碼蛋白的理化性質、跨膜結構、三級結構進行預測分析。用在線軟件SOPMA和SignalP-5.0 Server對

KGF

基因編碼蛋白的二級結構和信號肽進行預測。在NCBI網站下載白尾鹿(

Odocoileus

virginianus

)、馬鹿(

Cervus

elaohus

)、羊(

Ovis

aries

)、牛(

Bos

taurus

)、野豬(

Sus

scrofa

)、人(

Homo

sapiens

)等8個物種KGF蛋白的氨基酸序列，用MEGA6軟件構建N-J系統進化樹。

1.7 實時熒光定量PCR檢測

對梅花鹿

KGF

基因進行實時熒光定量分析，以3個時期的茸皮組織cDNA為模板，以

β

-

actin

為內參基因，在Primer5.0軟件中按照測序得到的

KGF

基因編碼區序列設計相應的熒光定量PCR引物。引物序列如下：q

KGF

F，5′TGACTCCAGAGCAAATGGCTA3′；q

KGF

R，5′ TGCCTCGTTTATCAATCCTCA3′；

β

-

actin

F，5′GCGTGACATCAAGGAGAAGC3′；

β

-

actin

R，5′GCAAGGACGGCTGCAAGA3′。熒光定量PCR的反應體系為：TB green 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，ROXⅡ 0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddHO 6 μL，總體系為20 μL。試驗中對3個個體3個時期模板中的

KGF

基因和內參基因均設置3個重復和3個空白對照，保證試驗數據的準確性。

1.8 實時熒光定量數據處理與分析

利用ABI 7 500 software軟件計算定量所有目的基因和內參基因

β

-

actin

的平均拷貝數，在Excel中用2法計算不同基因在不同組織中mRNA的相對表達量，其中以

KGF

基因在梅花鹿茸皮組織生長前期的表達量為對照組。使用SPSS Statistics 24.0軟件對熒光定量PCR所得數據進行單因素方差分析，方差分析結果用GraphPad Prism 6.04 軟件繪制柱形圖。

2 結果與分析

2.1 梅花鹿KGF基因克隆

對提取的總RNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳并利用紫外分光光度計檢測，結果表明，3個時期中的總RNA完整且濃度和純度合格，達到后續實驗要求。

根據設計引物的最佳退火溫度擴增梅花鹿

KGF

基因，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后切取該基因的目的條帶進行回收純化后克隆，對克隆產物進行陽性檢測(圖1)。根據電泳圖的擴增效果判斷引物特異性良好，獲得大小為623 bp的單一明亮的目的條帶，與預期片段大小一致。隨機選取3份克隆成功的菌液進行雙向測序，得到包含cDNA完整編碼區在內的大小為623 bp的基因序列，與引物設計時預期的片段大小一致。在NCBI上通過與其他同源物種進行Blast比對，確認此序列為梅花鹿

KGF

基因的cDNA序列，證明測序結果正確。

M：DL2 000； 1～14：克隆產物陽性鑒定。 M: DL 2 000; 1-14: Positive results of the cloning products.圖1 梅花鹿KGF基因PCR擴增Fig.1 PCR amplification of KGF gene from sika deer

2.2 梅花鹿 KGF基因生物信息學分析

2

.

2

.

1

KGF

基因編碼蛋白質理化性質預測

對梅花鹿KGF蛋白的理化性質進行預測，通過ORFfinder進行開放閱讀框查詢后得到cDNA編碼區全長為585 bp，共編碼194個氨基酸，其中賴氨酸占比最高，為9.3%；蛋白質相對分子量為22 489.17；理論等電點pI為9.35；脂肪系數為76.39；含有酸性氨基酸19個，堿性氨基酸30個；分子式為：CHNOS，總原子個數為3 154；不穩定系數為48.17；親水性平均值為-0.441；預測結果顯示該蛋白是不穩定的親水蛋白。

2

.

2

.

2

信號肽與跨膜結構預測

信號肽預測結果顯示梅花鹿KGF蛋白可能具有信號肽，切割位點為31～32：SLA～CN；對KGF蛋白跨膜區進行預測，結果顯示在氨基酸4～32位點從內到外及13～32位點從外到內螺旋的得分分別為1 406分和1 421分，均>500分，結果說明其具有跨膜結構基礎，由此推測KGF蛋白是跨膜蛋白。

2

.

2

.

3

KGF

基因編碼蛋白質空間結構預測

對梅花鹿KGF蛋白的二級結構進行預測，結果顯示α-螺旋有51個，占全部蛋白的26.29%；延伸連有41個，占全部蛋白的21.13%；β-轉角有22個，占全部蛋白的11.34%；無規則卷曲有80個，占全部蛋白的41.24%。利用ExPASy在線服務器中Swiss-Model同源結構建模的方法對梅花鹿KGF蛋白的三級結構進行預測(圖2)，結果顯示序列與模板的相似度達到97.14%。

圖2 梅花鹿KGF基因編碼蛋白空間結構預測圖Fig.2 Structure prediction of encoding protein of sika deer KGF gene

2

.

2

.

4

氨基酸序列同源性比對與系統進化樹構建克隆成功后，將梅花鹿KGF蛋白的氨基酸序列在Genebank中進行Blastp功能比對。結果顯示：梅花鹿KGF蛋白與馬鹿(

Cervus

elaphus

)、白尾鹿(

Odocoileus

virginianus

)、牛(

Bos

taurus

)、野牛(

Bison

bison

)、山羊(

Capra

hircus

)的相似性均在99%以上，其次為野豬(

Sus

scrofa

)97%。通過NCBI網站搜索、下載白尾鹿(

Odocoileus

virginianus

)、馬鹿(

Cervus

elaphus

)、山羊(

Capra

hircus

)、牛(

Bos

taurus

)、野豬(

Sus

scrofa

)和人(

Homo

sapiens

)等8個物種KGF蛋白的氨基酸序列，將下載好的序列導入MEGA6軟件構建N-J系統進化樹(圖3)。進化樹結果表明梅花鹿KGF蛋白與馬鹿(

Cervus

elaphus

)KGF蛋白的親緣關系最近。

圖3 梅花鹿KGF蛋白的系統進化樹構建Fig.3 Phylogenetic tree construction of sika deer KGF protein

2.3 KGF基因在梅花鹿不同時期頂端茸皮組織中的表達

KGF

基因和內參基因

β

-

actin

擴增曲線基線平整，拐點清晰，呈S型且指數期明顯，符合實驗要求；溶解曲線峰值單一且重合性較好，表明Ct值可靠，能正確表示基因的表達情況。熒光定量結果(圖4)表明

KGF

基因在梅花鹿生長發育不同階段的茸皮組織中均有表達且表達量存在差異，在中期的表達量最高，后期次之，前期的表達量最低。以

KGF

基因在梅花鹿茸皮組織生長前期的表達量為對照組，通過2法計算得到

KGF

基因在梅花鹿茸皮組織生長中期的表達量是前期的(2.158 5±0.014 1)倍；后期的表達量是前期的(1.728 5±0.225 3)倍。前期與中期的表達量、前期與后期的表達量存在顯著差異(

P

<0.05)；中期與后期的表達量差異不顯著(

P

>0.05)。

柱標中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。 Different lowercase letters in the column mark indicate significant difference (P<0.05).圖4 梅花鹿KGF基因在不同時期頂端茸皮組織中的表達量分析Fig.4 Analysis of KGF gene expression level in the different stages of skin tissue at the tip of sika deer

3 討 論

鹿茸的再生與生長發育是鹿茸研究領域的熱點話題，其獨特的生長發育特點和重要的藥用價值受到國內外學者的廣泛關注。頂端組織是其生長分化的中心，該處組織是生長因子和其它很多活性成分含量較高的部位。目前相比于對鹿茸間充質層的研究，對茸皮層的研究較少，然而鹿茸的再生起始于鹿角脫落后角柄殘樁處茸皮的再生性傷口愈合，表現為鹿茸中心組織向內生長推進的同時，茸皮呈環狀向中心遷移，直至自傷口愈合，之后在鹿茸快速生長過程中茸皮以同樣的速度生長，對鹿茸再生有重要的輔助作用。故本研究采用梅花鹿鹿茸頂端的茸皮組織作為試驗材料，克隆

KGF

基因并進行相關的生物信息學分析,對鹿茸再生機制和快速生長、增殖特點的探索具有一定的價值。本研究成功克隆獲得了梅花鹿

KGF

基因cDNA完整的編碼區序列，經Blastp功能比對發現梅花鹿

KGF

基因與白尾鹿、馬鹿的相似性最高，為99.8%，與其他物種

KGF

基因的相似性均高于90%，表明

KGF

基因在哺乳動物的進化過程中高度保守。鄭文靜克隆出的馬鹿

KGF

基因的CDS序列片段大小與梅花鹿的相同，該基因在梅花鹿和馬鹿之間高度同源，與本研究所構建系統進化樹結果一致。已有研究發現人

KGF

基因編碼的蛋白由194個氨基酸組成，包括一段由21個氨基酸組成信號肽與一潛在的天冬氨酸結合的糖基化位點，這一結果與本研究預測梅花鹿

KGF

基因存在信號肽相一致。KGF蛋白是一種具有跨膜結構的親水蛋白，推測該理化性質與蛋白的功能相關。綜上，本研究對梅花鹿KGF蛋白的預測結果對未來研究梅花鹿KGF蛋白功能有一定的幫助。鹿茸生長有明顯的季節性，整體生長規律呈典型的S曲線。鹿茸角在春季脫落后，隨著角柄處“芽基”、上皮組織及生長中心的形成開始進入生長前期(30 d左右)，中期(60 d左右)是生長最旺盛的時期，后期(90 d左右)生長逐漸放緩并開始進入骨化期。已有研究證實生長因子在組織損傷修復過程中扮演重要角色，能夠通過調控有絲分裂、細胞的趨化、細胞外基質的合成以及血管生成，進而調控組織損傷修復。

KGF

基因作為重要的生長因子，其編碼的蛋白可以通過誘導上皮細胞增殖，促進角質化細胞從傷口邊緣移行至基質，從而加快真皮和表皮再生及新生血管形成。孫佳陽研究發現在梅花鹿茸皮組織的3個生長時期中，

KGF

基因的甲基化水平在前期較低，而在中期和后期均未出現甲基化，由此推測

KGF

基因在茸皮組織中出現的這種低甲基化高表達的現象與鹿茸的生長發育密切相關，這一推測在本研究中得到證實。劉海龍在梅花鹿快速生長期的鹿茸頂端組織中通過轉錄組測序分析發現，相對于鹿茸生長至第10 天的表達量，

KGF

基因在60 d的表達量顯著上調，與本研究結果一致。楊永剛等研究表明，在鹿茸的快速生長期，茸皮中促進組織進行損傷修復的基因發生顯著上調，這種變化將有利于鹿茸損傷后創口的愈合及新鹿茸的再生。本研究通過熒光定量PCR實驗表明

KGF

基因在梅花鹿鹿茸的茸皮組織中不同時期表達量由高到底的順序為：中期>后期>前期，與鹿茸的生長快慢正相關，可能是由于在快速生長期的局部調控作用更復雜，進一步證明KGF蛋白在鹿茸再生和生長發育過程中發揮重要作用。

4 結 論

本研究成功克隆了梅花鹿

KGF

基因，其編碼區全長為585 bp，共編碼194個氨基酸；KGF蛋白是有信號肽和跨膜結構的不穩定的親水蛋白；該基因在生物進化上高度保守且與偶蹄目動物相似性較高。

KGF

基因的mRNA表達量在梅花鹿鹿茸頂端茸皮組織前期與中期、前期與后期差異顯著，在中期與后期差異不顯著。本研究對梅花鹿KGF蛋白的結構及功能有了進一步的認識和預測，為研究梅花鹿鹿茸組織生長機理奠定了基礎，提供了一定的理論依據，之后可進一步研究鹿茸頂端組織不同層之間

KGF

基因的表達量情況并設計試驗對

KGF

基因在鹿茸生長過程中的具體作用機制進行功能驗證，以期為研究鹿茸生長發育和再生的分子調控機理提供有價值的參考。