棕熊分子鑒定方法的建立與應用

謝培根 胡馨予 俞可心 胡 娟 吳國生 蔡 平 管 峰 徐愛春*

(1.中國計量大學生命科學學院，杭州，310018；2.青海省西寧野生動物園，西寧，810001；3.青海省林業(yè)廳野生動植物和自然保護區(qū)管理局，西寧，810007)

棕熊(Ursusarctos)是世界上分布最廣的大型食肉動物之一，分布在北美、歐洲和亞洲北部。作為陸地上食肉目(Carnivora)中體形最大的哺乳動物之一，棕熊在消滅鼠害、防止疫病蔓延和維持生態(tài)平衡等方面具有重要作用。我國主要有藏棕熊(也稱馬熊，U.a.pruinosus)、喜馬拉雅棕熊(也稱天山棕熊，U.a.isabellinus)和東北棕熊(U.a.lasiotus)3個亞種[1-2]。近年來，由于牧區(qū)擴大、農田開墾、定居點建設和其他經濟活動，人類不斷占領大型肉食動物的領域導致人與棕熊沖突不斷加劇[3-6]。2000年以來，為避免人熊沖突和非法狩獵，棕熊在西歐大部分地區(qū)的數量急劇下降，甚至慘遭滅絕[7]。近年來，我國境內頻繁發(fā)生棕熊與人沖突事件，在青海地區(qū)藏棕熊損壞房屋，取食存糧，甚至攻擊人造成死傷[6]。為明確棕熊的數量、分布和日益嚴峻的人獸沖突，尤其是棕熊傷人事件頻發(fā)的誘因，需要對其進行數量和分布以及生態(tài)、食性等多方面的調查研究。

傳統(tǒng)的樣線觀察法和形態(tài)學鑒定是野生動物調查鑒定最常用的手段，在現代分子生物學基礎上發(fā)展起來的DNA條形碼技術可通過動物組織、殘體、毛發(fā)或糞便等進行物種鑒定。棕熊的調查研究與鑒定中，傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定和直接觀察法費時費力，存在潛在的人獸沖突風險；DNA條形碼鑒定需要測序對比等環(huán)節(jié)，且數據庫中棕熊信息較少。棕熊活動中會留下足跡、糞便和毛發(fā)等可視樣品，糞便是最常見且數量較多的樣品材料，但是也存在形態(tài)學辨識困難等問題。因此，建立一種基于棕熊糞便的物種鑒定方法，以利于提高棕熊調查研究的工作效率，這對于野外調查工作具有重要的實踐意義。

本研究以糞便為材料，篩選棕熊的特異性mtDNA序列，設計并建立藏棕熊特異性PCR鑒定方法，為藏棕熊的分布、數量和活動蹤跡調查等研究提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究中藏棕熊、東北棕熊、馬來熊(Helarctosmalayanus)、高原鼠兔(Ochotonacurzoniae)、兔猻(Felismanul)、藏羚(Pantholopshodgsonii)、金錢豹(Codonopsisjavanica)、貂(Martessp.)的陽性DNA和東北棕熊、喜馬拉雅棕熊、北極熊(Ursusmaritimus)糞便均由青海省西寧野生動物園提供，雞、牛、綿羊、家兔、小鼠、駱駝、家牦牛、梅花鹿(Cervusnippon)、豬、鴨、魚和狗的DNA為試驗室保存。53份疑似藏棕熊糞便樣品為2018—2019年野外調查采集，-20 ℃冷凍保存。

1.2 方法

1.2.1 樣本DNA提取與試劑

糞便DNA提取試劑盒分別購自杭州新景生物技術公司和天根生化科技(北京)有限公司；TaqDNA酶、蛋白酶K、dNTPs、核酸染料GelRed和DNA Marker C等購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2.2 DNA提取及質量檢測

取糞便樣品約50 mg，參照糞便組織DNA提取試劑盒說明進行DNA提取。提取后的DNA均置于4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ贸⒘糠止夤舛扔婲anoDrop 2000(Thermo)檢測DNA濃度和純度OD260/OD280值。

1.3 鑒定引物

根據GenBank數據庫的基因序列，以棕熊mtDNA全序列(EU497665，AF303110，GU573471，GU573491)為參照，并比較黑熊(Ursusamericanus，AF303109)、洞熊(U.spelaeus)(FN39 0869)和北極熊(JX196383)的mtDNA全序列，選擇棕熊的特異性序列設計引物(表1)，預期產物長度486 bp。引物由杭州擎科梓熙生物技術有限公司合成。

表1 棕熊鑒定的引物序列

1.4 PCR擴增和特異性

PCR擴增基礎反應體系為20.0 μL，其中10×Buffer(含Mg2+)2.0 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)1.6 μL，上、下游引物各2.0 μL，5 U/μLTaqDNA聚合酶0.4 μL，DNA模板3.0 μL(約50 ng)，加雙蒸水至20.0 μL。PCR反應程序為94 ℃預熱變性5 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火32 s，72 ℃延伸45 s，共計31個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，PCR程序結束后自動降溫至4 ℃保存。

應用該PCR體系對東北棕熊、藏棕熊、喜馬拉雅棕熊、高原鼠兔、兔猻、家牦牛、藏羚、金錢豹、貂、雞、牛、綿羊、家兔、小鼠、駱駝、梅花鹿、家豬、鴨、魚和狗的基因組DNA進行擴增反應，試驗重復3次，依據有無PCR產物判定引物的特異性。

取5 μL PCR產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性產物送杭州擎科梓熙生物技術有限公司直接測序。

1.5 藏棕熊鑒定雙重PCR方法

為降低藏棕熊糞便鑒定中的假陰性，在棕熊鑒定PCR體系中引入1對18S rRNA引物做參照，組成雙重PCR。18S rRNA引物能夠得到140 bp的產物[8]。雙重PCR體系中引物Bear F和Bear R各2 μL(濃度均為10 μmol/L)，18S rRNA基因引物各0.6 μL，加雙蒸水補充至20 μL。PCR共計30個循環(huán)，61.5 ℃退火35 s，72 ℃延伸5 min。PCR產物用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 產物測序和物種鑒定

棕熊糞便樣品采用5份陽性產物直接測序用以驗證。測序結果參照Ferri等[9]報道的DNA條形碼鑒定物種的序列對比法進行。雙向測序結果經DNAstar 7.0和MEGA 6.0軟件對比、編輯后拼接，分別提交NCBI和生命條形碼數據系統(tǒng)(Barcode of Life Data System，BOLD)，并用在線軟件BLAST(https：//blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和Identification(http：//www.boldsystems.org)進行對比，相似度大于98%即為鑒定到種[10]。

2 結果與分析

2.1 DNA質量

糞便樣品DNA的質量濃度為4.5～40.0 ng/μL，所有DNA樣品純度OD260/280為1.73～2.00。結果表明雖然糞便標本的DNA濃度差異較大，但純度都適于進一步PCR分析。

2.2 棕熊鑒定引物PCR的特異性

使用本研究設計的藏棕熊特異性PCR引物，擴增東北棕熊、藏棕熊、喜馬拉雅棕熊、高原鼠兔、兔猻、家牦牛、藏羚、金錢豹、貂、雞、牛、綿羊、家兔、小鼠、駱駝、梅花鹿和豬等多個物種的DNA，結果表明除了東北棕熊、藏棕熊、喜馬拉雅棕熊之外，其他動物均無PCR擴增產物，即無交叉反應，產物大小與預期長度486 bp相符。部分結果如圖1所示。

圖1 棕熊鑒定引物特異性Fig.1 The specificity of brown bear identification primers 注：M.DNA Marker C；1.藏棕熊DNA的陽性對照；2～6.分別為高原鼠兔、兔猻、牦牛、藏羚和雞；N.陰性對照 Note：M，DNA Marker C.1，Brown bear positive control.2-6，Ochtona，Pallas’s cat，yak，Tibetan antelope and chicken.N，Negative control

2.3 棕熊鑒定雙重PCR體系

優(yōu)化后的雙重PCR產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明藏棕熊、喜馬拉雅棕熊和東北棕熊PCR產物均可見與預期大小一致的特異性產物和18S rRNA基因參照產物，其他物種則只有18S rRNA基因的參照產物，均未見特異性產物，說明棕熊鑒定引物和對照引物組合具有良好的特異性(圖2)，引入對照的雙重PCR體系更適于棕熊的鑒定，參照引物可以降低各種因素造成假陰性結果帶來的誤判。

圖2 棕熊鑒定引物和內參基因18S rRNA雙重PCR結果Fig.2 The double PCR results of brown bear identification primers and internal reference gene 18S rRNA primers 注：M.DNA Marker C；1～2.藏棕熊和東北棕熊DNA的陽性對照；3～15.分別為高原鼠兔、兔猻、牦牛、藏羚、金錢豹、雞、牛、綿羊、家兔、小鼠、駱駝、梅花鹿和豬；N.陰性對照 Note：M，DNA Marker C.1-2，DNA positive control of Tibetan and Northeast brown bear.3-15，Ochtona，Pallas’s cat，yak，Tibetan antelope，leopard，chicken，cattle，sheep，rabbit，mouse，camel，deer and pig.N，Negative control

2.4 測序和鑒定結果

本研究設計的棕熊特異性引物擴增陽性藏棕熊糞便DNA，產物與預期大小486 bp一致，測序結果在NCBI數據庫對比為棕熊(EU497665)，相似系數99.8%，與東北棕熊和喜馬拉雅棕熊存在不同堿基，表明本方法可用于棕熊的物種鑒定。對53份疑似棕熊的糞便DNA雙重PCR檢測結果表明，3份無擴增產物，17份樣品得到了140 bp和486 bp 2個擴增片段，33份僅有18S rRNA的擴增產物，表明53份糞便樣本中有17份棕熊糞便，33份為非棕熊糞便樣品，3份未知，確定了糞便的物種來源，進一步掌握了棕熊野外活動規(guī)律，為棕熊活動規(guī)律和防御等進一步相關研究提供了數據基礎。

3 討論

3.1 基于糞便DNA鑒定的優(yōu)越性

隨著生物技術和基因組研究的全面發(fā)展，棕熊鑒定技術包括了從整體形態(tài)到單分子細胞的多種材料的鑒定技術，可分為形態(tài)學鑒定、理化鑒定和分子鑒定三方面的技術，我國現行野生動物物種鑒定標準中明確要求使用2種技術互相驗證才可最終確定物種類別[11]。從早期的動物外形外貌到骨骼碎片和糞便，甚至肌肉纖維和毛發(fā)的微觀結構，形態(tài)學鑒定都能夠依據這些特有形態(tài)進行物種辨識。理化鑒定則是依據物種特有的蛋白、化學基因或元素等成分及其在光譜或化學變化引起的特定反應進行鑒別的技術，多用于毛發(fā)、器官組織、血液、聲音以及其加工成品等的鑒定。伴隨著新儀器的使用，紅外相機監(jiān)測也屬于形態(tài)學鑒定的范疇。在野生動物的物種鑒定實際應用中往往多種方法相互結合，提高鑒定效率和準確性[12-18]。由于在野生動物調查保護中獲得動物樣本的難度大，而棕熊作為一種具有攻擊性的大型動物，對其觀測或獲得其活體樣本的難度更大，這就需要對易于獲得的糞便樣品結合分子生物學方法進行鑒定[19-21]。如今，糞便分子生物技術是野生動物鑒定的重要方法和學科分支，相較于活體樣本，糞便樣品的獲取更為便捷且無損，在野生動物鑒定和調查中逐步得到廣泛應用[17，22-26]，其便捷性和易于檢測的優(yōu)點還提高了執(zhí)法部門對野生動物犯罪的監(jiān)管公正性[27-28]。糞便鑒定在候鳥物種鑒定[29]、巖羊(Pseudoisnayaur)親權分析[30]和巖羊個體識別[23]等研究中都獲得良好效果，但尚無利用糞便DNA對棕熊進行特異性鑒定的研究報道。動物的新鮮糞便每克中含有10萬個腸道上皮細胞[31]，這足以提取DNA滿足于棕熊的物種鑒定要求。本研究收集的53份糞便樣品均成功提取DNA且50份(94.34%)成功鑒定，也說明了糞便材料用于棕熊鑒定具有可行性。

3.2 基于DNA分子的棕熊鑒定

分子鑒定是野生動物調查、生物多樣性保護、解決人獸沖突以及開展生物科學領域諸多研究的技術基礎。本研究基于DNA建立的棕熊分子鑒定方法，用于區(qū)分棕熊與其他野生動物物種，且使用易于獲得的糞便為材料，為棕熊的數量和分布調查提供了便捷，建立的分子鑒定法可以有效鑒定我國分布的3種棕熊物種。

傳統(tǒng)觀測法和形態(tài)學鑒定在棕熊調研中發(fā)揮了重要作用，如人工固定樣線觀察或跟蹤觀察、糞便形態(tài)識別等[17]，但這些方法費時費力，容易錯過最佳調查時機，還可能給調查人員帶來安全隱患，已經不能滿足當今研究技術的發(fā)展需求。隨著基因組和分子生物學技術發(fā)展起來基于DNA分子的鑒定技術為動物鑒定帶來了新的突破，無論是殘體、皮骨、糞便還是毛發(fā)，乃至1個細胞等，都能夠進行準確的鑒定[32]。Cronin等[33]通過高通量基因組測序分析了北極熊、棕熊和黑熊的關系，發(fā)現棕熊擁有較多的SNP位點，為熊類的種屬鑒定奠定了基礎。本研究設計特異性PCR引物建立了棕熊鑒定方法，用于區(qū)分棕熊與其他物種。試驗選擇了mtDNA靶標，由于mtDNA廣泛存在于各種細胞中，種內保守性高，種間差異性大且具有更高的拷貝數和更好的穩(wěn)定性等優(yōu)點[34-36]，常被用作物種鑒定的靶標。在鹿(Cervidae)[37]、黃頰長臂猿(Nomascusgabriellae)、白頰長臂猿(Nomascussiki)[38]、巖羊、盤羊(Ovisammon)、雪豹(Pantherauncia)[11]以及爬行類鱷魚(Crocodilian)[22，39]等的鑒定中廣泛應用。本研究設計的棕熊特異性引物僅擴增藏棕熊、喜馬拉雅棕熊和東北棕熊，而與高原鼠兔、兔猻和家牦牛等物種無擴增，具有良好的特異性。為進一步提高鑒定準確性，進行雙重PCR優(yōu)化，提高了棕熊鑒定的成功率。