小飛鼠微衛星位點的篩選及遺傳特征分析

田新民 楊孟平 宋雅祺 劉小慧 廉明棟 陳 紅

(牡丹江師范學院生命科學與技術學院，牡丹江，157011)

小飛鼠(Pteromysvolans)隸屬哺乳綱(Mammalia)嚙齒目(Rodentia)鼯鼠科(Pteromyidae)飛鼠屬，為樹棲夜行滑行類物種，主要分布于歐亞大陸北部，國內主要分布在東北、華北、西北等北方林區[1-3]。由于不合理的森林采伐，森林生境趨于破碎化甚至喪失，已導致全球許多地區的小飛鼠種群處于瀕危狀態[4-5]。作為森林可持續經營的重要指示和傘護物種[6]，我國也將其列為“易危”與“三有”重點保護的野生動物[7-8]。目前，國外在小飛鼠巢址選擇、家域、擴散、遺傳多樣性和分子系統進化等領域已開展系列研究[9-13]，為該物種的科學保護提供了參考，而我國對小飛鼠生態學領域的研究基本空白。

保護遺傳學研究在揭示瀕危物種遺傳適應與瀕危機制、實現物種的精準保護與管理方面發揮了重要的作用，微衛星分子標記以選擇中性、多態性高及共顯性等優點，在保護遺傳學領域有廣泛應用[14]。由于微衛星側翼序列在物種間的高度保守性，表現出近緣物種間的引物通用性，從而可實現從近緣物種微衛星中篩選出目標物種的位點，實現該物種的群體遺傳學研究[15-16]，相比其他篩選策略，這是一種低成本與高效率的方法。本研究對小飛鼠其他亞種、近緣物種的微衛星位點進行測試篩選，構建小飛鼠東北亞種(P.v.arsenjevi)的微衛星分析系統，藉以為該亞種的保護遺傳學領域深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本與DNA提取

在伊春市五營區龍江松鼠養殖場共收集30只自然死亡的小飛鼠，此樣本均為東北亞種野外個體的繁殖后代。從這些個體的腿部取肌肉組織，采用血液/細胞/組織基因組DNA試劑盒(天根，北京)提取基因組DNA。用ND-1000紫外分光光度計(Nanodrop，USA)測定DNA濃度，稀釋至10 ng/μL，4 ℃存放備用。

1.2 PCR擴增

根據GenBank中已報道的微衛星位點，結合文獻[17-22]，選取鼯鼠科小飛鼠指名亞種(P.v.volans)、北美飛鼠(Glaucomyssabrinus)、海南小飛鼠(Hylopetesphayrei)和赤頰林飛鼠(H.sagitta)，以及松鼠科(Sciuridae)北松鼠(Sciurusvulgaris)5個物種中擴增效果較好的34對引物(表1)，以小飛鼠東北亞種的DNA為模板進行擴增。采用不同退火梯度，對微衛星位點初步篩選；成功擴增的位點，上游引物5′端進行熒光標記(Fam、Hex、Tamra或Rox)。擴增體系20.0 μL：5 U/μL ExTaqDNA聚合酶(TaKaRa，Japan)0.1 μL，10×Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1.5 μL，超純水13.8 μL。PCR反應條件均為：94 ℃，4 min；(94 ℃，30 s；50～59 ℃，30 s；72 ℃，30 s)× 35 個循環；72 ℃，10 min。擴增產物經過2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其中熒光標記引物成功擴增的PCR產物用ABI 3730XL測序儀(Applied Biosystems Inc.，America)進行毛細管電泳檢測，判讀等位基因大小。所有的引物合成和基因分型均由上海生工完成。

表1 鼯鼠科和松鼠科物種的微衛星位點信息

續表1

1.3 數據處理

采用軟件GENALEX 6[23]計算各位點的等位基因數、觀測雜合度和期望雜合度；Excel microsatellite tool kit[24]計算各位點的多態信息含量(polymorphic information content，PIC)。采用軟件GENEPOP 4.0[25]測算各位點是否符合Hardy-Weinberg平衡，位點間的連鎖不平衡情況和概率檢驗使用馬爾可夫鏈法(Markov chain method)，參數設置：dememorization=10 000；batch=20；iteration=5 000，以Bonferroni法對檢驗的顯著性進行修正。對于多態性位點，采用軟件GIMLET 1.3.3[26]計算位點的個體聯合判別率(probability of identity，PID)，PID指無親緣關系或同胞個體之間具有相同基因型的概率。

2 結果與分析

PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，共有14個位點有明確的符合微衛星片段大小的擴增產物，占篩選位點總數的41.2%。毛細管電泳(表2)顯示，上述14個位點均能進行準確的基因型判斷，但是位點Hlep26和GLSA48只有1個等位基因。其余12個位點Pvol10、Pvol41、PvolE1、PvolE5、PvolE6、PvolE10、Scv3、Hlep59、Hlep72、Hlep80、Hph17和ScnFO35的等位基因8～16個，多態信息含量為0.757～0.902，均為高度多態性位點，占可擴增位點的85.7%(12/14)。

12個高度多態性位點的觀測雜合度為0.500～0.950，期望雜合度為0.775～0.909，其中，有6個位點(Pvol41、PvolE6、Hlep59、Hlep72、Hph17和ScnFO35)符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.123～0.998)；其余6個位點(Pvol10、PvolE1、PvolE5、PvolE10、Scv3和Hlep80)都偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)，皆呈現不同程度的雜合度不足(表2)。在12個位點中，均未檢測到連鎖不平衡現象。Gimlet分析顯示，12個微衛星位點的個體聯合判別率很高，2只個體具有相同基因型的無偏概率為3.49×10-22；即使全同胞個體，錯誤判別概率Prod(sibs)也只有1.44×10-6。多態性最高的前6個位點(Hlep59、PvolE1、PvolE5、Pvol10、Pvol41和Hlep72)擴增失敗時，全同胞錯誤判別概率也只上升到0.16%(圖1)。

表2 14個微衛星位點在小飛鼠種群中的遺傳特征

圖1 12個微衛星位點按照個體聯合判別率順序的個體基因型相似概率曲線Fig.1 Probability of identity(PID)curve generated 12 microsatellite loci

3 討論

微衛星側翼序列的保守性，是近緣物種間位點交叉擴增的基礎，為許多物種的遺傳管理提供了極大的便利[14-16，27-29]。本研究選擇了鼯鼠科與松鼠科中5個物種(小飛鼠指名亞種、北美飛鼠、海南小飛鼠、赤頰林飛鼠和北松鼠)內高多態性的34個微衛星位點，在小飛鼠東北亞種內共獲得12個具有多態性的位點，成功率為35.3%，其中，同物種小飛鼠指名亞種的位點在東北亞種內多態性擴增成功率最高，為85.7%(6/7)；同為鼯鼠科不同屬的海南小飛鼠和赤頰林飛鼠的成功率次之，為75.0%(7/8)；松鼠科的北松鼠最低，為12.5%(1/8)。由此可以看出，近緣種基因組序列相似度高，交叉擴增成功概率高，而遠源種之間情況呈相反的趨勢[15]。例外的是，在鼯鼠科的北美飛鼠11個微衛星位點內，僅有1個位點能夠擴增成功，并無多態性。

本研究檢測到12個多態性微衛星位點，其中有6個位點偏離Hardy-Weinberg平衡。相關研究認為，導致位點和群體偏離Hardy-Weinberg平衡的原因有很多，如種群亞結構、近親交配、遷入和遷出等[29-30]。在這6個位點中，均呈現一定程度的雜合度不足。本研究樣本來自籠養的繁殖個體，可能受到近親交配的影響，導致了位點偏離Hardy-Weinberg平衡。得到的12個位點均為高度多態性位點(PIC值>0.5)，其個體聯合判別率很高；僅使用相比多態性略低的6個位點(PvolE6、PvolE10、Scv3、Hlep80、Hph17和ScnFO35)，全同胞錯誤判別概率也小于1%(0.16%)。因此，本研究篩選的12個多態性位點，可作為非損傷性遺傳取樣個體識別的參考位點，也可為小飛鼠東北亞種群體遺傳學研究與管理提供重要的分子標記。