中華穿山甲腹瀉治療前后糞便微生物群落組成的差異

頡志剛 毛 韻 謝純剛 許 佳 何海健 蒙海峰 鄭榮泉

(1.浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江省野生動物生物技術與保護利用重點實驗室，金華，321004；2.金華市自然資源和規劃局野保站，金華，321052；3.金華職業技術學院農學院，金華，321000；4.金華市陸生野生動物救護中心，金華，321052)

中華穿山甲(Manispentadactyla)隸屬于鱗甲目(Pholidota)，穿山甲科(Manidae)，穿山甲屬。由于人類的過度利用和棲息地被破壞，穿山甲野生種群資源已極度衰退。目前，世界自然保護聯盟(IUCN)在其瀕危物種紅色名錄上，將中華穿山甲定為極危(CR)物種，所有種類的穿山甲均被列入華盛頓公約(CITES)附錄Ⅰ中。國家林業和草原局于2020年6月3日將中華穿山甲升級為國家一級重點保護野生動物。盡管國內外相關機構和部分動物園在多年前就已經開展了穿山甲的救護和人工飼養工作[1-5]，但救護成功率和飼養成活情況并不理想，目前穿山甲的人工養殖仍是世界難題。

野生穿山甲進入人工圈養環境后可能受到多種脅迫因素的影響，容易出現免疫或代謝相關的多種疾病。根據文獻報道，腸胃炎、肺炎、皮膚病和寄生蟲病是導致圈養穿山甲死亡最常見的疾病[6-8]，超過50%的圈養穿山甲死于出血性胃潰瘍和肺炎[9]，腹瀉是圈養穿山甲最常見的情況之一，也是導致死亡的主要病因之一。野生穿山甲以白蟻等昆蟲為主要食物[10]，在人工圈養條件下難以滿足其對天然餌料的需求，通常需要人工飼料喂養，而不合理的人工飼料以及環境應激可能是導致穿山甲腹瀉發生的直接原因[9，11]。因為食物組成和生存環境的改變均可直接或間接干擾動物腸道菌群的穩態[12-13]，使得條件致病菌成為優勢菌群，從而出現腹瀉癥狀和電解質紊亂，最終引起動物的死亡。

以浙江省金華市陸生野生動物救護中心救護的2只雌性中華穿山甲為研究對象，利用高通量測序技術分析和比較2只穿山甲在圈養初期發生腹瀉和治療恢復后糞便細菌和真菌群落多樣性及結構的變化，旨在為預防和治療腹瀉提供參考依據，從而提高圈養中華穿山甲群體的健康水平。

1 基本情況

1.1 動物與飼養條件

研究對象為浙江省金華市陸生野生動物救護中心(位于浙江省穿山甲保護繁育基地內)救護的2只雌性中華穿山甲(編號為Mp10和Mp13)，救護時間分別為2020年7月13日和7月23日，救護時體重分別為2.13、2.37 kg。單只飼養于不銹鋼籠內(120 cm×80 cm×100 cm)，籠下帶有接糞盤可收集糞便，籠內提供木質巢箱(50 cm×40 cm×40 cm)，環境溫度(27±1)℃，濕度(55±5)%。人工飼料以黑螞蟻干、黃粉蟲干、貓糧和葡萄糖為主要原料，按照一定比例配制，加入等體積飲用水后用勻漿機充分粉碎、混合制成糊狀飼料(粗脂肪5.8%、粗蛋白12.6%、粗纖維0.3%，每百克總能量529.0 kJ)，每日現用現配，每天16：30投喂，投喂量按體重計，約為50 g/kg。飼養期間通過人工誘導使穿山甲逐步適應人工飼料。

1.2 腹瀉情況與治療方案

2只穿山甲攝食人工飼料一段時間后出現腹瀉癥狀，糞便呈黃色糊狀(圖1A)，但無膿液或水樣，也未出現食欲不振、精神萎靡和體溫異常等癥狀。初步推測可能是食物改變引起腸道的應激反應，導致消化不良性腹瀉。針對穿山甲消化不良性腹瀉的治療方案為：每日通過拌料口服蒙脫石散3 g/只(浙江海力生制藥有限公司，有效成分為蒙脫石，輔料為葡萄糖、香蘭素和糖精鈉)；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)二聯活菌顆粒1 g/只(北京韓美藥品有限公司，含益生菌屎腸球菌R-026、枯草桿菌R-179，以及VC、VB1、VB2、VB6、VB12、煙酰胺、乳酸鈣和氧化鋅)。用藥后第6周開始好轉，第12周糞便呈黑色條狀(圖1B)。

圖1 中華穿山甲腹瀉治療前后糞便的形態Fig.1 The fecal form of Chinese pangolins before and after diarrhea treatment using probiotics

2 研究方法

2.1 糞便樣品采集

中華穿山甲為夜行性動物，一般在夜間排便。根據監控記錄，2只穿山甲活動時間主要集中在20：00—03：00，排便時間集中在21：00左右或01：00左右，收集糞便的時間選擇在20：00—07：00。

收集時，首先在接糞盤上鋪1層保鮮膜以防止糞便樣品的污染，每隔0.5 h觀察1次排便情況，如有排便立刻收集。為防止外部雜菌污染，用消毒后的鑷子撥開糞便表層，取內部適量樣品置于液氮中冷凍，-80 ℃保存。每只穿山甲在治療前后各采集5個糞便樣品，共20個樣品。

2.2 高通量測序

委托北京百邁客生物科技有限公司進行糞便樣品細菌和真菌的高通量測序。糞便基因組DNA提取采用MN NucleoSpin 96 Soil (Germany)，具體步驟詳見試劑盒說明書。擴增細菌16S rRNA基因V3—V4區，引物對為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)；擴增真菌ITS rRNA基因的S1區域，引物對為ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。

PCR反應體系10.0 μL，其中基因組DNA模板50 ng，正向和反向引物(10 μmol/L)各0.3 μL，KOD FX Neo Buffer 5.0 μL，dNTP(2 mmol/L)2.0 μL，KOD FX Neo 0.2 μL，剩余體積用ddH2O補充。

反應條件為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，25個循環；72 ℃再延伸7 min。反應產物通過1.8%瓊脂糖凝膠電泳評估，使用DNA凝膠提取試劑盒純化，最終產物通過文庫制備，庫檢后Illumina HiSeq 2500上機測序。

2.3 數據分析

原始序列組裝用Trimmomatic v0.33質控[14]，FLASH v1.2.7拼接[15]，并用UCHIME v8.1去除嵌合體[16]，得到高質量的Tags序列。OTU聚類和物種注釋分別使用USEARCH v10.0[17]和RDP分類器v2.2[18]，細菌16S的參考數據庫為Silva數據庫[19]，真菌ITS的參考數據庫選擇Unite數據庫[20]。OTU數據經歸一化處理后進行分析和可視化展示，內容包括原始數據優化及有效優質序列統計。用Mothur v1.30.2計算Alpha多樣性指數，包括Simpson、Shannon、ACE和Chao1等。基于binary jaccard算法計算Beta多樣性距離矩陣，使用R軟件進行非度量多維尺度分析(NMDS)。LEfSe分析默認設置LDA Score的篩選值為4。

3 結果與分析

3.1 糞便樣本微生物序列及多樣性

從20個糞便樣品中獲得細菌原始16S rRNA基因V3—V4區域序列1 509 222條，質控后獲得高質量序列1 310 509條，平均每個樣品具有序列41 787條。根據97%的序列相似性鑒定出356個核心OTU，治療前平均每個樣品含295個OTU，治療后平均每個樣品含204個OTU。真菌原始ITS rRNA基因S1區域獲得序列1 530 406條，共獲得高質量序列1 435 188條，平均每個樣品具有序列71 759條。根據97%的序列相似性鑒定出1 572個核心OTU，治療前平均每個樣品含301個OTU，治療后平均每個樣品含429個OTU。得到的OTU在相應的數據庫比對注釋，細菌共有14個門、24個綱、49個目、77個科和162個屬；真菌共有10個門、33個綱、83個目、184個科、371個屬和484個種。

3.2 微生物群落多樣性

通過比較腹瀉治療前后糞便菌群Alpha多樣性指數(表1)，發現細菌群落的豐度指數ACE和Chao 1在治療后均降低，但多樣性指數Shannon和Simpson前后變化不大；真菌群落ACE在治療后降低，而Chao 1增加，Shannon和Simpson指數前后無明顯變化。無度量多維標定法(NMDS)檢驗結果顯示，治療前后細菌和真菌群落的結構均發生了較大程度的變化(圖2)。

表1 中華穿山甲腹瀉治療前后糞便菌群Alpha多樣性指數

圖2 中華穿山甲腹瀉治療前后糞便微生物群落組成非度量多維尺度(NMDS)分析Fig.2 Non-metric multidimensional scaling (NMDS) analysis of fecal microbial community composition of Chinese pangolins before and after diarrhea treatment

3.3 治療前后糞便核心微生物組成及相對豐度

治療前，糞便細菌群落優勢菌門(占比1%以上)依次為厚壁菌門(Firmicutes，65.59%)、變形菌門(Proteobacteria，15.67%)、梭桿菌門(Fusobacteria，8.32%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，6.87%)和酸桿菌門(Acidobacteria，2.16%)；治療后為厚壁菌門(63.58%)、變形菌門(21.73%)、梭桿菌門(10.76%)和擬桿菌門(2.77%)(圖3A)。在屬水平上，治療前的優勢菌屬(豐度排序前10)依次為乳桿菌屬(Lactobacillus，24.10%)、狹義梭菌屬1(Clostridiumsensu stricto 1，8.06%)、Cetobacterium(7.21%)、土孢桿菌屬(Terrisporobacter，5.83%)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella，5.67%)、擬桿菌屬(Bacteroides，5.66%)、大腸埃希菌-志賀菌屬(Escherichia-Shigella，5.35%)、羅姆布茨菌屬(Romboutsia，4.92%)、毛螺旋菌屬(Parasutterella，2.10%)和梭桿菌屬(Fusobacterium，1.08%)；治療后依次為狹義梭菌屬1(23.21%)、羅姆布茨菌屬(12.33%)、愛德華氏菌屬(11.03%)、土孢桿菌屬(6.64%)、梭桿菌屬(6.60%)、毛螺旋菌屬(5.62%)、大腸埃希菌-志賀菌屬(4.02%)、Cetobacterium(3.86%)、擬桿菌屬(2.03%)和乳桿菌屬(0.72%)(圖3B)。總體來看，治療前后的優勢菌門排序基本一致，但占比發生了一定變化，擬桿菌門的占比在治療后減少，變形菌門和梭桿菌門增加；屬水平上，優勢菌屬在排序和占比上均發生了較大改變，尤其是乳桿菌屬的占比在治療后明顯減少，而狹義梭菌屬1明顯增加。

圖3 中華穿山甲腹瀉治療前后糞便菌群組成Fig.3 The composition of fecal microbiota of Chinese pangolins before and after diarrhea treatment

治療前，糞便真菌群落優勢菌門(占比1%以上)依次為子囊菌門(Ascomycota，59.96%)、擔子菌門(Basidiomycota，26.82%)、毛霉菌門(Mucoromycota，1.73%)和被孢霉門(Mortierellomycota，1.11%)；治療后依次為子囊菌門(71.72%)、擔子菌門(16.57%)、毛霉菌門(1.24%)、被孢霉門(1.15%)和羅茲菌門(Rozellomycota，1.06%)(圖3C)。在屬水平上，治療前，豐度排名前10的優勢菌屬依次為絲孢酵母屬(Trichosporon，11.59%)、曲霉屬(Aspergillus，8.09%)、Meyerozyma(5.40%)、青霉屬(Penicillium，4.45%)、紅菇屬(Russula，2.98%)、假絲酵母屬(Candida，2.70%)、鐮刀菌屬(Fusarium，2.12%)、被孢霉屬(Mortierella，1.98%)、Saitozyma(0.54%)和Condenascus(0.32%)；治療后依次為Condenascus(17.49%)、曲霉屬(7.61%)、絲孢酵母屬(4.25%)、假絲酵母屬(4.14%)、Saitozyma(3.34%)，鐮刀菌屬(2.97%)、青霉屬(1.62%)、被孢霉屬(1.42%)、紅菇屬(0.77%)和Meyerozyma(0.08%)(圖3D)。治療前后的優勢菌門在排序上基本一致，但占比發生了一定變化，治療后的子囊菌門占比明顯增加，而擔子菌門明顯減少；屬水平上，優勢菌屬的排序和占比均發生了較大改變，尤其是Condenascus的占比在治療后明顯增加，而絲孢酵母屬明顯減少；種水平上，豐度排序前10的糞便真菌物種完全一致，但治療后Condenascustortuosus、Candidaafricana和Saitozymapodzolica的相對豐度占比增多，而茶葉籽酵母(Meyerozymacaribbica)、雜色曲霉(Aspergillusversicolor)、青霉菌(Penicilliumhispanicum)和Candidamucifera的相對豐度占比均減少(表2)。

表2 中華穿山甲腹瀉治療前后糞便真菌在種水平上的相對豐度

3.4 治療前后糞便微生物顯著差異物種

利用LEfSe分析可見，2只腹瀉穿山甲治療前后糞便細菌屬水平和真菌屬或種水平上的差異。圖4A表明，治療前乳桿菌屬和擬桿菌屬為主要作用物種，而治療后狹義梭菌屬1、羅姆布茨菌屬和狹義梭菌屬13為主要作用物種。圖4B表明，治療前起主要作用的真菌是絲孢酵母屬、Meyerozyma、茶葉籽酵母菌、紅菇屬的Russulapoichilochroa、青霉屬和曲霉屬的雜色曲霉，而治療后起主要作用的真菌是Saitozymapodzolica和Condenascustortuosus。

圖4 中華穿山甲腹瀉治療前后糞便菌群LEfSe分析Fig.4 LEfSe of fecal microbiota of the Chinese pangolins before and after diarrhea treatment

4 討論

本研究對救護過程中出現腹瀉癥狀的2只雌性中華穿山甲進行了成功治療。根據高通量測序結果，分析中華穿山甲糞便細菌和真菌菌群Alpha多樣性，發現治療使細菌和真菌(除Chao 1指數外)的豐富度有所降低，但對細菌和真菌多樣性的影響不大，經Beta多樣性分析，發現治療前后細菌和真菌菌群均表現出明顯的分離。然而，對林麝(Moschusberezovskii)的研究表明，腹瀉個體糞便細菌菌群的Alpha多樣性指數比健康個體明顯降低，同時兩者糞便菌群呈現出明顯分離，并且研究人員認為是有害菌大腸埃希菌-志賀菌屬導致的腹瀉[21]。此外，對馬駒的研究表明，腹瀉個體細菌OTU總數和Chao 1指數顯著低于健康個體，但Alpha多樣性無統計學差異[22]。對不同物種的研究結果表明，腹瀉會引起菌群豐度的降低，但不一定會導致Alpha多樣性的降低。在本研究中，引起2只中華穿山甲腹瀉的主要原因可能是食物的改變而非有害菌，腸道菌群調整需要1個過渡階段，在此階段微生物可能在豐度上發生了一定變化而在物種多樣性上變化不大，經過非抗生素治療后，腸道菌群會調整為一種新的穩態。

在門水平上，中華穿山甲的細菌主要優勢菌依次為厚壁菌門、變形菌門、梭桿菌門和擬桿菌門，且腹瀉治療前后優勢菌門的排序無明顯改變，但占比發生了一定變化。楊雪婷[23]通過宏基因組測序分析出野外馬來穿山甲(Manisjavanica)腸道細菌主要為厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門；Ma等[24]通過宏基因組學預測了2只健康雌性馬來穿山甲與2只不同性別、死于肺部炎癥的穿山甲個體間的糞便細菌菌群，這4只穿山甲的優勢菌門為擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門；Yan等[5]比較了在圈養條件下出生與從非法交易中救護后圈養2～3年的馬來穿山甲糞便的微生物組成，這2組穿山甲核心菌門依次為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和梭桿菌門。這些研究結果說明2種穿山甲腸道的優勢菌門都包括厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門，但同種或異種間在細菌門類和占比都存在一定差異。此外，對圈養大食蟻獸(Myrmecophagatridactyla)的研究表明，主要菌門為厚壁菌門(41%)、擬桿菌門(42%)和變形菌門(6%)，而小食蟻獸(Tamanduatetradactyla)的優勢菌門為擬桿菌門(35%)、厚壁菌門(31%)和變形菌門(3%)[23]，表明食蟻類哺乳動物類群間腸道細菌群落在門水平上具有一定的相似性。

在屬水平上，中華穿山甲大部分優勢菌屬治療前后的豐度發生了較大變化，尤其是治療后的乳桿菌屬占比明顯減少，而狹義梭菌屬1明顯增加。根據LEfSe分析，治療前，乳桿菌屬和擬桿菌屬為主要作用物種；治療后，狹義梭菌屬1、羅姆布茨菌屬和狹義梭菌屬13為主要作用物種。擬桿菌屬和乳桿菌屬與纖維素降解和蛋白質分解利用有關[25]，在治療后這2個菌屬占比減少，可能與食物的改變有關。梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)可以通過丙烯酸途徑發酵丙氨酸產生丁酸，也可以在蘇氨酸脫氫酶的作用下發酵蘇氨酸產生丙酸[26]，還具有降解幾丁質的能力[27-28]，而羅姆布茨菌屬也與丁酸生成相關[29]。丙酸和丁酸是動物體內葡萄糖、膽固醇和脂質代謝的重要代謝底物[30]。日糧中補充丁酸類物質能夠改善仔豬腸道發育，提高機體抗氧化能力和生長性能，并可通過調節腸道的通透性降低仔豬腹瀉率[31-32]。因此，治療后腸道內狹義梭菌屬和羅姆布茨菌屬豐度的增加對中華穿山甲的能量物質代謝和腹瀉癥狀的改善具有積極意義。

有關穿山甲腸道真菌組成的研究尚未見報道，本研究發現，中華穿山甲糞便中的子囊菌門和擔子菌門為絕對優勢菌門，占比1%以上的菌門還包括毛霉菌門和被孢霉門等，治療前后優勢菌門的排序變化不大，但占比發生了一定變化，如治療后子囊菌門占比明顯增加，羅茲菌門占比也有所增加，而擔子菌門明顯減少。Sokol等[33]發現，炎癥性腸病患者的擔子菌門與子囊菌門的比值增加，推測可能與腹瀉有關。艾生權等[34]發現亞成體大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)腸道真菌的優勢菌門也主要為子囊菌門和擔子菌門。穿山甲主要以富含幾丁質的蟻類為食，而大熊貓以富含纖維素的竹子為食，這兩類哺乳動物腸道擁有共同的優勢真菌菌門，是否與食物特化有關需要進一步研究。在屬水平上，優勢菌屬在治療前后有較大改變。治療后Condenascus占比明顯增加，而絲孢酵母屬明顯減少。在種水平上，雖然排序前10的物種完全一致，但是Condenascustortuosus、Candidaafricana和Saitozymapodzolica的相對豐度在治療后占比增多，而茶葉籽酵母、雜色曲霉、青霉菌和Candidamucifera的相對豐度占比均減少。雖然真菌占腸道微生物的比例較低，但有研究表明真菌與細菌有密切關系，存在穩定的拮抗或互利共生關系[35-36]。這些特定真菌的豐度變化具體會對中華穿山甲食物的吸收、利用起到何種作用，以及真菌和細菌存在何種互作關系有待深入研究。

綜上所述，野生中華穿山甲在救護飼養過程中可能因食物改變引起消化不良性腹瀉，通過腸道收斂劑類藥物和益生菌調理可以達到治療目的，這為治療圈養中華穿山甲最為常見的腹瀉疾病提供了初步經驗。由于該物種極度瀕危，動物來源非常有限，本研究僅能分析2只腹瀉個體糞便微生物多樣性和組成，雖然生物學重復不能完全符合統計學要求，但本研究結果仍具有較為重要的參考價值，今后可根據相關微生物組成信息有目的地篩選腸道有益菌，以此作為飼料添加劑改善圈養中華穿山甲的健康程度和提高救治成功率等。