鳥類傳播捕食線蟲真菌的可能性探究

姜 林 鄧 巍 李飛騰 譚 坤，2 張淑霞，2 楊曉燕，2，3*

(1.大理大學東喜瑪拉雅研究院，大理，671003；2.中國三江并流區域生物多樣性協同創新中心，大理，671003；3.大理大學三江并流區域生物多樣性保護與利用云南省創新團隊，大理，671003)

微生物作為生態系統中最重要的組成部分，在地球化學循環中扮演著非常重要的角色[1-2]。開展微生物空間分布格局的相關研究，可以幫助人們更合理地管理生態系統并進行功能調控，為微生物的利用和保護提供基礎。傳統觀點認為微生物不受擴散限制的影響[3-4]，然而，隨著研究的不斷深入，研究者發現許多微生物實際上受到擴散限制的影響，具有更復雜的生物地理分布模式[5-7]。研究認為，微生物在較小的空間尺度上不受擴散限制影響而隨機分布，在較大空間尺度上可能會受到擴散的影響[8]。因此，擴散可能是影響微生物傳播及其空間分布格局的關鍵因素。

微生物的傳播通常需要介質，微生物通過空氣等介質的傳播往往具有一定的局限性，并且傳播范圍較小，高達95%的孢子仍然落在距子實體1 m范圍之內[9-10]。依靠生物介質的傳播則打破了這種局限，通過取食、運動和排泄等活動，動物極大地增加了微生物傳播的范圍[11-12]。鳥類遷徙可攜帶微生物跨國、跨洲，甚至全球傳播[13-15]，鳥類勢必會對微生物的傳播與分布格局造成影響，但目前相關研究主要集中于鳥類對病原微生物的傳播[16-18]，鳥類對微生物的擴散及對微生物分布格局的影響研究尚未得到關注。Lovas-kiss等[19]和Silva等[20]研究發現，鳥類可以將魚卵攜帶到沙漠新形成的小湖泊中，這預示著對鳥類傳播作用的研究不應僅僅局限于病原微生物，對其他微小生物的傳播作用也可作為闡明生物分布格局的新視角。

綜上所述，開展鳥類對微生物的傳播及對微生物分布格局影響的研究很有必要。一方面由于鳥類與微生物分布格局的影響尚未引起重視，另一方面微生物種群復雜、生物量巨大，即便使用分子生物學方法，仍然無法對所有微生物類群進行定性和定量的研究[21-22]，因此選擇合適的微生物類群也是開展微生物空間分布格局相關研究的關鍵所在。捕食線蟲真菌(nematode-trapping fungi，NTF)是一類在世界范圍內各種生境中(主要分布于陸地土壤和水中底泥中)廣泛分布的真菌[23-26]，兼具腐生和捕食特性[27]，是不同生境中線蟲的重要平衡因子[27]，也可影響土壤氮元素循環[28]，因此具有重要的生態學功能。NTF種屬少[27，29-31]，易于在低倍鏡下觀察、分離和鑒定[27]，菌絲、分生孢子和厚垣孢子均有可能會被鳥類攜帶并被傳播到各處，是開展鳥類對微生物傳播研究的理想對象。本研究以NTF為研究對象，采集云南大理州不同野生鳥類腳趾和腳爪、翅下覆羽、尾下覆羽、鳥喙部位的樣品，以及糞便樣品，以單孢子挑離法純化NTF，結合形態和分子生物學方法鑒定物種，明確鳥類對NTF的攜帶與傳播的可能性，探究鳥類生活習性對NTF攜帶的影響。研究結果不僅有助于理解微生物多樣性空間格局和驅動機制，也可為微生物生物地理學研究提供支持。

1 試驗方法

1.1 樣品采集

選取云南省大理州南澗鳳凰山環志站、云南云龍天池國家級自然保護區和劍川劍湖濕地省級自然保護區為采樣地進行樣品的采集。以霧網法和燈光誘捕法捕捉鳥類，將捕捉到的鳥放于鋪有一次性塑料袋的鳥籠中，用于糞便采集；使用無菌棉拭子采集鳥的喙部、腳趾和腳爪、翅下覆羽和尾下覆羽處的微生物樣品，置于無菌離心管中保存。樣品采集后24 h內運送至實驗室，冰箱4 ℃保存，一周內處理完采集到的所有樣品。

1.2 捕食線蟲真菌分離純化

將放有采樣棉拭子的離心管置于離心機4 500 r/min離心5 min，使棉簽上的微生物樣品分散于生理鹽水中。采用土壤散布法[27]在玉米瓊脂培養基(corn meat medium，CMA)[32]上撒入1 g左右無菌土樣，滴加150 μL樣品于無菌土上，再加入1 mL誘餌線蟲懸液[33]，誘導NTF生長。將平板置于恒溫培養箱中25 ℃培養。從第3周開始鏡檢，同時使用無菌牙簽轉接NTF的單個分生孢子于CMA平板上，并置于恒溫箱中26.5 ℃培養7 d，重復此操作，直至獲得NTF純培養物。

1.3 捕食線蟲真菌鑒定

1.3.1 形態學鑒定

采用插片法和粘片法[27]制作捕食線蟲真菌臨時裝片，用奧林巴斯BX53微分干涉顯微鏡拍取分生孢子、孢子梗和厚垣孢子等形態圖片；采用觀察室法[27]誘導捕食線蟲真菌產生捕食器官，用體視顯微鏡觀察確定捕食器官類型。參照Nematode-trappingfungi[27]和《中國真菌志·第33卷·節叢孢及相關屬》[32]進行形態學鑒定。

1.3.2 分子生物學鑒定

通過ITS序列同源性比對和系統發育分析進行分子生物學鑒定。使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar，PDA)[32]富集NTF菌絲，使用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取真菌基因組DNA[34]。以真菌通用引物ITS4和ITS5[35]對ITS序列擴增。PCR擴增反應總體系為50.0 μL，其中PCR Buffer(10×)5.0 μL，MgCl2(25 mmol/μL)5.0 μL，dNTP(10 mmol/μL)1.0 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，上游引物(10 μmol/μL)1.5 μL，下游引物(10 μmol/μL)1.5 μL，DNA模板2.0 μL，無菌超純水33.5 μL。PCR擴增反應條件為94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，54 ℃復性1 min，72 ℃延伸1.5 min，共35個循環；最后72 ℃補平延伸10 min。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，具體操作參照《分子克隆實驗指南》[36]，PCR產物委托鉑尚生物技術(上海)有限公司用擴增引物雙向測序。對所測得的ITS序列拼接和篩查，復制到NCBI中，用BLAST工具進行同源性比對?；贐LAST同源性比對結果，從GenBank數據庫中下載親緣關系較近的物種的ITS序列，用Mafft線上工具[37]生成ITS多序列比對矩陣，用BioEdit v7.2.3[38]對序列矩陣手動調節提高其準確度，在MEGA 6.0[39]中用鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構建系統發育樹。若系統發育分析結果與形態學鑒定結果相符即可認定為相應物種。

1.3.3 數據處理

檢出率=(檢出的樣品數/總的樣品數)×100%。

2 結果與分析

2.1 鳥類捕捉及樣品采集結果

共捕捉到35種104只野生鳥，采集到腳趾和腳爪、翅下覆羽、尾下覆羽樣品各104份，糞便樣品21份，體型較大的鳥類采集到喙部樣品46份，共計379份樣品(附錄1)。

附錄1 樣品采集信息匯總

2.2 鳥類不同部位攜帶的捕食線蟲真菌種類

從379份樣品中共分離到9株捕食線蟲真菌，檢出樣品均來自鳥類的腳趾和腳爪部位，鳥喙、翅下覆羽、尾下覆羽和糞便樣品均未檢出捕食線蟲真菌(表1)。

表1 野生鳥類攜帶的捕食線蟲真菌種類

2.3 捕食線蟲真菌檢測結果

從379份樣品中共分離到9株(JL1～JL9)捕食線蟲真菌，根據其捕食器官類型(均為黏性三維菌網)和分生孢子形態分別鑒定為少孢節叢孢(Arthrobotrysoligospora，JL1～JL4)、圓錐節叢孢(A.conoides，JL5)、奇妙單頂孢(A.thaumasia，JL6～JL7)和彎孢節叢孢(A.musiformis，JL8～JL9)(圖1)。基于ITS序列的系統發育分析顯示，JL1～JL4與少孢節叢孢聚為一支(Bootstrap值：100)，JL5與圓錐節叢孢聚為一支(Bootstrap值：100)，JL6～JL7與奇妙單頂孢聚為一支(Bootstrap值：99)，JL8～JL9與彎孢節叢孢聚為一支(Bootstrap值：100)(圖2)。系統發育分析結果與形態學鑒定結果相符。

圖1 野生鳥類攜帶的捕食線蟲真菌孢子形態Fig.1 Conidia morphology of nematode-trapping fungi species carried by birds 注：A.奇妙單頂孢；B.少孢節叢孢；C.圓錐節叢孢；D.彎孢節叢孢。比例尺為20 μm Note：A，Arthrobotrys thaumasia.B，Arthrobotrys oligospora.C，Arthrobotrys conoides.D，Arthrobotrys musiformis.Scale bar，20 μm

圖2 基于ITS1-5.8S-ITS2序列構建的鄰接系統發育樹Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree generated based on the ITS1-5.8S-ITS2 rDNA sequence

2.4 不同類群鳥類捕食線蟲真菌的檢出率

從遷徙狀態看，遷徙途中候鳥的NTF檢出率為3.6%(共56個樣品，檢出2個)；留鳥的NTF檢出率為12.5%(共8個樣品，檢出1個)；已到達越冬地或繁殖地候鳥NTF檢出率為15.0%(共40個樣品，檢出6個)。留鳥和已到達越冬地或繁殖地候鳥的檢出率高于遷徙途中的候鳥，留鳥和已到達越冬地或繁殖地候鳥檢出率相差不大。

從生態類群看，水鳥NTF的檢出率為10.9%(共46個樣品，檢出5個)；林鳥NTF的檢出率為6.9%(共58個樣品，檢出4個)。此外，水鳥又可細分為游禽和涉禽兩類，采集到游禽樣品28個，有3個樣品檢出NTF，檢出率為10.7%；采集到涉禽樣品18個，有2個樣品檢出NTF，檢出率為11.1%。林鳥又可細分為僅在林間喬木灌叢中活動和在地面活動兩類，僅在林間喬木灌叢活動的鳥類樣品有36個，NTF檢出率為0；在地面活動的鳥類樣品有22個，有4個樣品檢出NTF，檢出率為18.2%。

3 討論

3.1 鳥類能夠通過鳥爪攜帶并存在傳播捕食線蟲真菌的可能性

目前國內外有關鳥類對微生物傳播的研究主要針對病原微生物[16-18]，相關內容大多聚焦于糞便的傳播途徑[41-42]，僅有少數研究關注到了鳥類羽毛對病原微生物的攜帶作用[43]，尚未有研究關注到鳥類對其他微生物的攜帶和傳播及傳播方式。本研究證明鳥類腳趾和腳爪能夠攜帶NTF，而鳥類其他部位樣品均未檢出NTF，這可能是在鳥類的各種活動中，腳趾和腳爪更頻繁地接觸地面土壤，土壤又是NTF原始生境[25-26]，有著更豐富的NTF類群，因而鳥類的腳趾和腳爪更易于接觸并攜帶NTF。

林慧彪等[44]和楊琳等[45]的研究表明，一些哺乳動物的糞便中檢測出了NTF，而本研究野生鳥類糞便樣品中并未檢出NTF，這可能是鳥類直腸短小，體內基本無儲存的糞便，與其他哺乳動物相比，鳥類每次產生的糞便量較少，從而導致鳥類糞便中的NTF檢出率較低。

3.2 鳥類的生境選擇決定微生物傳播的能力和范圍

在捕捉到的鳥類中，留鳥樣品NTF檢出率略低于已到達越冬地或繁殖地的候鳥，但二者都明顯高于在遷徙途中的候鳥。這可能是留鳥和已到達越冬地或繁殖地的候鳥在棲息地內活動頻次高、時間長，接觸地面土壤的機會更多，有了較高的NTF攜帶率，可能具有更高的傳播概率。而遷徙途中的候鳥需要長時間、遠距離的遷徙，大部分時間都在飛行，停歇、補充能量的時間很短，接觸NTF的概率小，因而NTF檢出率更低。此外，候鳥樣品中檢出的NTF物種均是節叢孢屬，表明候鳥具備攜帶并遠距離傳播NTF的可能性。

與林鳥相比，水鳥的NTF檢出率更高。水鳥雖然在水中活動，但在夜晚會停留在水邊濕地處休息，而土壤、泥沼中存在大量NTF[23-26]，本研究游禽和涉禽的捕捉地就是在泥沼中，這是水鳥NTF檢出率較高的原因。在林鳥中，局限在林間喬木灌叢活動覓食的鳥類基本不落地活動，很難接觸到NTF的原始生境(土壤)，僅在地面以上喬木灌叢中活動的林鳥樣品中未檢出NTF；而在林間地面或巖石上活動的林鳥有較大概率接觸土壤，這些鳥類樣品的NTF檢出率較高，例如灰眶雀鹛(Alcippemorrisonia)在地面覓食，小白腰雨燕(Apusnipalensis)攀附在豎直的巖石上棲息。

由此可見，鳥類的生境選擇，即是否在NTF廣泛存在的地面土壤或泥沼中活動，決定了NTF的攜帶能力。

3.3 鳥類對廣布微生物的攜帶和傳播概率更高

目前對NTF的研究表明[27]，少孢節叢孢是NTF中的廣布種，對其廣泛分布的解釋一般是產三維菌網的NTF(節叢孢屬)多營腐生生活，在不同生境中更易獲得生長優勢，使它們的生物量較其他屬(Dactylellina和Drechslerella)更高，更容易被檢測到。但這僅能解釋其局域范圍內的廣布種分布，無法解釋其世界性的廣泛分布。本研究結果顯示，鳥爪所攜帶的NTF均為節叢孢屬真菌，其中少孢節叢孢占比更大，考慮到鳥類具備的跨洲遷徙的能力，土壤中的廣布種也更有機會被鳥類攜帶而傳播到世界各地，這在一定程度上解釋了少孢節叢孢的世界性分布。

基于研究結果可知，鳥類對微生物的傳播作用不應該僅局限于病原微生物及糞便傳播方面，鳥類通過腳趾和腳爪等部位攜帶并傳播微生物，影響微生物的空間分布格局，應該納入相關研究范疇，這可能會加深人類對微生物多樣性空間分布格局形成和驅動機制的理解。

致謝：感謝云龍天池國家級自然保護區管護局、南澗鳳凰山環志站、劍湖省級自然保護區管護局工作人員為此次野外采樣工作給予的協調和幫助；感謝大理大學東喜瑪拉雅研究院肖文研究員、李德品副教授、王榮興助理研究員在本研究過程中提供的指導和幫助。