貴州野生動物園一例袋鼠產氣莢膜梭菌的分離鑒定

陳閶崢 湯德元 楊志剛 張 森 韓超逸 晏仁潭 羅 柳

(貴州大學動物科學學院，貴陽，550025)

產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)是一種革蘭氏陽性厭氧菌[1]，廣泛分布于自然界，主要存在于人和動物的腸道中，一定條件下可以引起梭菌性肌壞死和腸毒血癥等多種疾病[2]。因其可以分解肌肉組織中的糖分，產生大量的氣體造成組織氣腫，還可以產生莢膜，所以稱為產氣莢膜梭菌，也稱魏氏梭菌。目前，產氣莢膜梭菌已經檢測出20多種毒素，其中最主要的5種致死毒素為α、β、β2、ε和ι，而根據所含毒素的不同，又可以將產氣莢膜梭菌分為A型(α)、B型(α、β、ε)、C型(α、β)、D型(α、ε)和E型(α、ι)[3-4]。

赤大袋鼠(Macropusrufus)隸屬袋鼠目(Diprotodontia)袋鼠科(Macropodidae)大袋鼠屬，主要生活在澳大利亞和巴布亞新幾內亞地區。2020年12月上旬，貴州野生動物園飼養的1只赤大袋鼠突然死亡，通過分析臨床癥狀和病理變化，經過實驗室診斷等，明確死因，為今后袋鼠的飼養和疾病預防工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

貴州野生動物園病死赤大袋鼠的心、肝、肺、腎臟和腸道等組織。

1.2 剖檢

對病死赤大袋鼠病理解剖，觀察心、肺、腎、肝、胰腺和腸道等組織的病理變化。

1.3 細菌分離純化及鏡檢

在超凈工作臺內，無菌操作，使用接種環在心、肺、肝、腎、胰腺和腸道等病變組織處取樣，接種于TSC固體培養基(購于廣東環凱微生物科技有限公司)，37 ℃需氧和厭氧條件下培養24～48 h，挑取單個菌落接種于FTG培養基(購于廣東環凱微生物科技有限公司)，放置于水浴搖床中，37 ℃培養24 h，并吸取菌液進行涂片，酒精燈干燥固定后使用革蘭氏染色試劑盒染色鏡檢。

1.4 生化鑒定

操作參考腸道菌科生化鑒定管說明書(青島海博生物技術有限公司)，在超凈工作臺內，用接種針取純化后的菌液，依次接種于各個生化鑒定管內，包括半固體瓊脂、鳥氨酸脫羧酶肉湯、賴氨酸脫羧酶肉湯、氨基酸脫羧酶對照、西蒙氏枸櫞酸鹽、硫化氫、尿素酶、蛋白胨水(色氨酸肉湯)、MR-VP、苯丙氨酸、甘露醇、肌醇、山梨醇、蜜二糖、核糖醇(側金盞花醇)和棉子糖。

1.5 細菌分子生物學鑒定

在超凈工作臺內，按說明書使用細菌基因DNA提取試劑盒(購于北京天根生化科技有限公司)提取純化后菌液的DNA，并以此為模板，根據相關參考文獻[5]合成16S rDNA基因序列引物(表1)。采用PCR方法，對其16S rDNA基因目的片段擴增，反應體系：上、下游引物各1 μL，細菌DNA 2 μL，用mix補足25 μL。反應條件：98 ℃預變性10 min；98 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃終延伸10 min。將PCR產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳，使用膠回收試劑盒，按說明書操作對目的條帶回收，送至擎科生物公司測序。

1.6 產氣莢膜梭菌分型

根據文獻[5]設計相關毒力基因的特異性引物，以純化細菌的DNA為模板，用PCR技術分別對不同毒素基因的目的片段進行擴增(表1)。其中α、β、ε和ι的反應條件是：98 ℃預變性10 min；98 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環；72 ℃終延伸6 min。β2的反應條件是：98 ℃預變性5 min；98 ℃變性30 s，45 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環；72 ℃終延伸10 min。

表1 產氣莢膜梭菌16S rDNA和主要毒素基因的特異性引物

1.7 藥敏試驗

將純化菌液接種于培養基中并涂勻，選取青霉素、頭孢氨芐、頭孢曲松、新霉素、苯唑西林、卡那霉素氨芐西林、羧芐西林、丁胺卡那、四環素、多西環素、頭孢唑林、米諾環素和慶大霉素等藥敏紙片(購于杭州微生物試劑有限公司)，將藥敏紙片貼于培養基上并標明藥敏種類，具體操作方法參照說明書，將培養基置于37 ℃厭氧培養24～48 h，觀察結果。

1.8 動物試驗

選擇10只生長狀態大致相同的雄性小鼠，隨機分成2組(實驗組和對照組)，每組各5只。在超凈工作臺內，實驗組每只小鼠腹腔注射0.2 mL FTG液體培養基內懸液，對照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水，將2組小鼠放于相同條件下的2個鼠籠中飼養，觀察小鼠狀態。

2 結果與分析

2.1 剖檢結果

剖檢后，可見病死赤大袋鼠的肝臟明顯腫大，邊緣質脆，表面有斑點狀出血；腸道內部嚴重出血，腸系膜淋巴結腫大；胰腺壞死；胃部充氣膨脹，胃黏膜脫落、出血；心包囊內有大量積液。

2.2 細菌形態觀察

培養24～48 h后，厭氧培養基中可見灰白色、表明光滑、濕潤、半透明的菌落生長，具有溶血特征。將分離純化后的細菌革蘭氏染色，顯微鏡下可見細菌為革蘭氏陽性，菌體呈短桿狀，兩端鈍圓，有莢膜，初步鑒定為產氣莢膜梭菌。

2.3 細菌生化特性鑒定結果

該細菌可以發酵棉子糖、蜜二糖、山梨醇和甘露醇等糖類，產生氣體；MR-VP、尿素酶、西蒙氏枸櫞酸鹽和半固體瓊脂等實驗結果呈陰性(表2)。這些生化鑒定結果與產氣莢膜梭菌的生物學特性相符，表明該菌極有可能是產氣莢膜梭菌。

表2 生化試驗結果

2.4 細菌分子生物學鑒定結果

以純化細菌DNA為模板，使用16S rDNA特異性引物成功擴增產物，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得長度約為600 bp的片段條帶(圖1)，與目的片段的長度基本符合。通過測序分析，與GenBank公布的產氣莢膜梭菌ATCC 13124標準菌株的16S rDNA核苷酸序列進行比較，發現二者的同源性高達99.33%，確定該細菌是產氣莢膜梭菌。通過GenBank比對，發現該菌與炫舞梭菌(Clostridiumtarantellae)、撒丁島梭菌(C.sardiniense)等菌株具有親緣關系。使用MEGA 5.0軟件中的NJ法構建進化樹，可以看出分離株CCB與序列號為NR104741.1的菌株親緣關系最接近(圖2)。

圖1 樣品16S rDNA擴增結果Fig.1 Results of 16S rDNA amplification 注：M.DL2000 DNA Maker；1.陰性對照；2.樣品 Note：M，DL2000 DNA Maker.1，Negative control.2，Sample

圖2 產氣莢膜梭菌16S rDNA基因核苷酸序列系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene nucleotide sequence of Clostridium perfringens

2.5 產氣莢膜梭菌分型結果

以產氣莢膜梭菌5種主要毒素基因的特異性引物進行PCR擴增，得到的產物置于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，只有毒素基因cpa擴增出了目的條帶(圖3)，長度約為324 bp，與目的片段基本符合。將其PCR產物測序后進行BLAST比對分析，結果顯示，該序列與GenBank中的α毒素基因序列同源性達100%，證實其為產氣莢膜梭菌α毒素，并確定了該分離菌株的分型為產氣莢膜梭菌A型。

圖3 產氣莢膜梭菌毒素基因分型擴增結果Fig.3 Genotyping and amplification of Clostridium perfringens toxin 注：M.DL2000 DNA Marker；1.cpb基因；2.cpb2基因；3.cpa基因；4.etx基因；5.iap基因 Note：M，DL2000 DNA Marker.1，cpb gene.2，cpb2 gene.3，cpa gene.4，etx gene.5，iap gene

2.6 藥敏試驗結果

青霉素、苯唑西林、四環素、多西環素、米諾環素和紅霉素對該菌形成的抑菌圈直徑>24 mm(表3)，說明這些藥物對產氣莢膜梭菌的生長有極強的抑制作用。

表3 藥敏試驗結果

2.7 動物試驗結果

試驗組小鼠在48 h內全部死亡。通過解剖觀察，死亡小鼠體內臟器產生大量氣泡，腸道黏膜有嚴重充血、出血癥狀，肝臟充血腫大、質脆。挑取腸道內容物進行涂片染色，可見革蘭氏陽性桿菌，為短桿狀，兩端鈍圓，與注射的菌株形態相同。

3 討論

本病例利用細菌分離鑒定、生化試驗、PCR技術和藥敏試驗等方法，分離純化得到1株產氣莢膜梭菌A型毒株。在日常生活中，產氣莢膜梭菌普遍存在于動物的腸道中，當動物身體健康、抵抗力較強時，腸道內的各種微生物菌群相對穩定，產氣莢膜梭菌一般不會導致疾病[6]，只有當飼養條件達不到要求，飼料營養不均衡，抵抗力降低或發生應激反應時等[7]，產氣莢膜梭菌才會大量繁殖，引起動物食物中毒、氣性壞疽、腸毒血癥，以及分泌性、壞死性和出血性腸炎，最終導致急性死亡。產氣莢膜梭菌是條件致病菌，患病無明顯的季節性，一般病程極短，很難得到有效治療，病死率極高[8]。

根據藥敏試驗結果，產氣莢膜梭菌對青霉素、四環素、多西環素和紅霉素等藥物極為敏感，與已報道的產氣莢膜梭菌藥敏試驗結果相符，說明此類藥物可用于臨床上發病動物的治療[9-10]。貴州冬季氣候較冷，晝夜溫差較大，極易導致袋鼠疾病的發生。在動物園的日常管理中，袋鼠要避寒保暖，加強飼養和清潔管理，定期對圈舍進行消毒，避免病原物滋生，確保飼料營養配比均衡，增強免疫力。當動物園內發生該疾病時，采集本地分離菌株，滅活后在全園動物中緊急接種[11]，可以有效避免該病在動物園內傳播。