兩例黃金蟒死亡病例的病理診斷分析

田馨媛 陳海良 李 勝 劉天龍*

(1.中國農業大學動物醫學院，北京，100193；2.北京綠野晴川動物園有限公司，北京，102602；3.大興區畜禽繁育改良指導站，北京，102602)

黃金蟒(Pythonbivittatus)也稱白化緬甸蟒，屬國家二級重點保護野生動物[1]和《瀕危野生動植物種國際貿易公約》(CITES)附錄Ⅱ限制國際貿易的受保護動物。緬甸蟒作為變溫動物，在外界環境溫度低于所需最低溫度或發生劇烈變化時極易發生消化道和呼吸系統疾病，感染性肺炎是最嚴重的疾病之一[2]。本研究對2條死亡的圈養黃金蟒進行了病理學檢查，在肺臟中分離出1株銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)與1株糞產堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)，對2菌株的耐藥情況進行了研究。黃金蟒的死亡原因最終診斷為上述2種細菌引起的化膿性肺炎，希望本研究可以為圈養蛇類的飼養管理、疾病防治和野生蛇類的保護提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例背景

病例來自北京野生動物園，其中雌黃金蟒冬眠后，持續狀態不佳、精神沉郁，雄黃金蟒后發病，癥狀相似，后食欲廢絕，最終死亡。

1.2 組織病理學檢查

對死亡黃金蟒尸體剖檢，取主要臟器在4%甲醛溶液中充分固定后，常規方法制作石蠟切片，HE染色，重點觀察肺臟、心臟、肝臟、腎臟、脾臟和雌性輸卵管的組織病理學變化。

1.3 細菌分離培養與鏡檢

肺臟、肝臟和腎臟細菌劃線培養，用普通營養瓊脂37 ℃恒溫培養24 h，并使用NB肉湯增菌培養，分離出2種細菌，對分離獲得的細菌單菌落進行革蘭染色和鏡檢。

1.4 體外藥敏試驗(紙片法)

取2種細菌的純培養物倍比稀釋、涂布，選擇1×106cfu/mL的細菌懸液，用8種藥敏紙片做藥物敏感性試驗，測量抑菌圈直徑，確定2種分離菌株對各種藥物的敏感性。

1.5 細菌16S rRNA基因序列測定與同源性比對

將分離到的2菌株純培養物提供給北京六合華大基因科技有限公司進行基因組DNA提取及16S rRNA基因擴增。PCR擴增引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR擴增反應體系(總體積25 μL)：PCR Mix 21 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL。PCR反應條件：96 ℃預變性5 min；96 ℃變性20 s，62 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃終延伸10 min；4 ℃保存。目標條帶大小為1 500 bp左右。PCR產物檢測及純化：取3 μL PCR產物1%瓊脂糖凝膠檢測，觀察條帶性狀。PCR產物純化按照磁珠純化標準流程操作。將純化后的 PCR 產物上機檢測，測序引物分別使用V4-515F(5′-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA-3′)和V4-806R(5′-GGACTACCAGGGTATCTAA-3′)，測序結果在NCBI-BLAST中比對。

2 結果與分析

2.1 剖檢變化

尸體剖檢發現雌黃金蟒泄殖孔流出紅色液體，伴有惡臭氣味。剝離皮膚后發現胸腹腔壁淤血、壞死(圖1A)；打開胸腹腔見肺臟廣泛性壞死、化膿，在肺的中央管腔內有柱狀膿性分泌物(圖1B、C，膿性分泌物如B箭頭處所示)；輸卵管壞死，化膿嚴重，可見數枚腐爛卵。

圖1 黃金蟒尸體剖檢結果Fig.1 Autopsy results of the golden python

2.2 黃金蟒的組織病理學檢查

黃金蟒肺臟可見肺泡腔狹窄，肺泡壁增厚，肺泡腔內有粉紅色滲出物(圖2A)，部分區域可見大量細菌團塊(圖2B)。一蟒肝臟肝索紊亂，肝細胞廣泛性變性、壞死，脂褐素沉著(圖2C)，另一蟒肝臟局部出血、肝細胞脂肪變性(圖2D)。脾臟紅髓與白髓分界不清(圖2E)。腎臟可見腎小球毛細血管基膜增厚(圖2F)，腎小管上皮細胞變性、壞死、脫落、細胞核溶解，間質增寬見粉紅色液體(圖2G)。雌蟒輸卵管黏膜上皮結構破壞、脫落，黏膜肌層間有大量細菌團塊，黏膜下層水腫(圖2H)。心肌腫脹、斷裂(圖2I)。

圖2 黃金蟒組織病理學鏡檢顯微圖片Fig.2 Histopathological examination results of golden pythons

2.3 分離細菌的培養特征與細胞形態

死亡黃金蟒的肺、肝和腎細菌分離培養結果見圖3C-E。結果顯示，連續37 ℃恒溫培養24 h后，在營養瓊脂培養基上出現了2種菌落(菌株A、B)。取肺組織中分離的細菌進一步分離培養，菌株A生長為較大的、扁平、濕潤的乳黃色菌落，邊緣為波浪形，并可產生綠色色素(圖3A)；菌株B生長為較小的乳白色圓形菌落，菌落中央隆起、邊緣扁平(圖3B)。

圖3 黃金蟒各器官內細菌分離培養結果Fig.3 Results of bacterial isolation and culture in various organs of the golden python

對2種細菌進行革蘭染色，鏡檢結果顯示，菌株A、B均為紅色，即革蘭陰性；形態近似，均為短桿狀，單個或成對排列。

2.4 體外藥敏試驗(紙片法)結果

分離到的銅綠假單胞菌菌株對恩諾沙星、氟苯尼考、氯霉素、慶大霉素、新霉素、卡那霉素和多黏菌素B 7種藥物完全敏感，對阿奇霉素具有耐藥性；分離到的糞產堿桿菌菌株對以上8種藥物完全敏感。(表1)。

表1 藥敏試驗結果

2.5 16S rRNA基因測序與同源性比對

根據北京六合華大基因科技有限公司提供的報告，菌株A和菌株B的16S rRNA序列與NCBI-BLAST的序列進行比對的結果如表2所示，菌株A與銅綠假單胞菌的親緣關系最接近(99.93%)，菌株B與糞產堿桿菌的親緣關系最接近(100.00%)，可以判定菌株A為銅綠假單胞菌，菌株B為糞產堿桿菌。

表2 菌株A和菌株B的16S rRNA基因序列同源性比對結果(各摘錄報告內前3條結果)

3 討論

2例黃金蟒的病理學檢查結果顯示，雌性黃金蟒在難產后，輸卵管中的卵發生腐敗，引起重化膿性輸卵管炎，輸卵管結構被破壞，推測病原菌進入血管引發菌血癥或膿毒敗血癥，導致多器官的化膿性炎和化膿灶的產生。2條黃金蟒均出現了化膿性肺炎，肺組織內見大量細菌，肺泡狹窄或充滿滲出物，呼吸功能受到嚴重損害。最終2條黃金蟒因細菌大量代謝產物的毒性作用及呼吸困難死亡。黃金蟒各器官中分離到的銅綠假單胞菌菌落數量較多，致病性相對糞產堿桿菌強，推斷2條黃金蟒的死亡主要由銅綠假單胞菌感染引起，糞產堿桿菌在此病例中為繼發感染的可能性較大。

銅綠假單胞菌又稱綠膿桿菌，是一種革蘭陰性、專性需氧的條件致病菌，在環境中廣泛存在，也可見于人和多種動物的皮膚、腸道等。銅綠假單胞菌感染可造成各組織器官的感染、膿腫和敗血癥等，其中化膿性肺炎為較典型的病變[3-7]。糞產堿桿菌也是一種革蘭陰性、專性需氧的條件致病菌，在水和土壤中廣泛分布，存在于人和多種動物的腸道中[8]。通常，糞產堿桿菌對家兔和小鼠的致病性較弱[9-10]，但在人和動物中也存在由糞產堿桿菌單獨感染引起的呼吸系統感染、泌尿系統感染、角膜炎、膿腫和敗血癥等[11-15]。銅綠假單胞菌與糞產堿桿菌均可感染人或動物引發多種疾病，動物園管理人員應注重環境衛生，定期消毒。接觸和治療患肺炎蛇，以及對懷疑患肺炎死亡的蛇進行剖檢時，注意個人防護。繁殖蛇類應通過拍攝X線片等方式檢查雌蛇是否難產，若發生難產應及時幫助雌蛇將卵排出或手術取出，以免引發細菌感染。

藥敏試驗結果表明，北京野生動物園內感染兩黃金蟒的銅綠假單胞菌與糞產堿桿菌的耐藥情況不明顯，在蛇類發生具有類似癥狀的感染時，可以選擇使用相應的敏感藥物治療。