火烈鳥腹瀉沙門菌分離鑒定、致病性及耐藥性檢測

鄧麗玲 汪明權 李雨芮

(武漢動物園，武漢，430000)

火烈鳥(Phoenicopterusruber)是鸛形目(Ciconiiformes)紅鸛科(Phoenicopteridae)的一種大型水鳥，亦稱紅鸛，主要分布于非洲、中南美洲和印度等部分亞熱帶地區的溫熱帶鹽水湖泊、沼澤及礁湖的淺水地帶，主要靠濾食藻類、小蝦、蛤蜊和昆蟲等生物為生，性怯懦，喜群棲，極具觀賞性，常在動物園被人工養殖與繁育[1-3]。

沙門菌(Salmonella)具有廣泛的宿主性，可以感染多種動物和人，主要引起不同宿主的敗血癥、腹瀉、腸炎及流產等，感染率和死亡率均較高，是臨床中重要的人畜共患病原菌[1-3]。沙門菌血清型繁多，引起動物和人發病的沙門菌血清型目前有2 523個，是重要的食源性病原菌，該菌可以通過運輸的動物和未煮熟的動物食品傳播，對人的危害也較大，成為公共衛生研究的熱點問題[4-5]。目前，服用抗生素是控制沙門菌感染的主要手段之一，抗生素的濫用造成了沙門菌的耐藥現象日趨嚴重，沙門菌在抗生素的壓力選擇下產生嚴重的耐藥性及交叉耐藥性，成為多重耐藥菌菌株，給臨床中沙門菌的防控帶來一定的困難，造成藥物殘留，危害生物的身體健康[6-8]。因此，對沙門菌的合理防控具有重要意義。國內關于獸類、禽類的沙門菌研究較多，但致火烈鳥腹瀉的沙門菌未見報道。

本研究對動物園中患腹瀉火烈鳥的102份糞便、肛拭子和死亡個體的肝臟等病料組織進行沙門菌分離鑒定，對其致病性及耐藥性進行檢測，以期為動物園中火烈鳥沙門菌的防控提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源

2016—2020年，采集動物園中患腹瀉火烈鳥的糞便、肛拭子和死亡火烈鳥的肝臟等病料組織102份。

1.1.2 試驗動物

20 g左右的昆明系小白鼠450只，購自北京維通利華實驗動物中心，由武漢動物園飼養。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離與鑒定

將火烈鳥的病料組織樣品處理后，接種于沙門菌增菌液(TTB)中，37 ℃震蕩培養8～12 h，取培養的菌液接種于鑒定培養基(沙門菌顯色培養基)中進行鑒別培養，在恒溫培養箱中37 ℃培養12～18 h，挑單菌落純化培養，進一步觀察形態，進行生化特性鑒定。

1.2.2 細菌PCR鑒定

參考胡建樂[9]、吳曉君等[10]的方法，根據GenBank中沙門菌基因序列設計沙門菌鑒定引物invA，F：5′-ACAGTGCTCGTTTACGACCTGAAT-3′，R：5′-AGACGACTGGTACTGATCGATAAT-3′，引物片段大小為241 bp，沙門菌的鑒定引物由深圳華大基因股份有限公司合成。分離得到的菌株采用水煮法提取基因組DNA，以提取的基因組DNA為模板，用鑒定引物進行PCR鑒定。將分離菌株的PCR產物回收送華大基因測序，測序結果與GenBank中登錄的參考株同源性比對鑒定。判定標準：同源性≥99.0%，可以定義到種的水平；若在97.0%～98.9%，定義到屬的水平；若小于97.0%，定義為科的水平。

1.2.3 致病性試驗

從火烈鳥的病料組織中分離的菌株純化培養至對數期，采用平板菌落計數法計數菌落，每株分離菌株通過灌胃攻毒方式攻毒5只小白鼠，劑量為0.25 mL(107cfu/mL)，對照組的小白鼠灌胃等量的無菌營養肉湯，觀察6 d，每天記錄小白鼠的發病與死亡情況，對攻毒死亡的小白鼠剖檢并進行細菌分離鑒定。

1.2.4 藥敏試驗

參照美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)推薦的標準K-B紙片法進行操作與結果判定。

2 結果與分析

2.1 細菌分離培養

在沙門菌顯色培養基上，疑似沙門菌的分離菌株長出邊緣整齊、大小一致的藍紫色菌落，染色鏡檢可見無莢膜、兩端鈍圓的陰性短桿菌，通過生化試驗初步鑒定分離的89株菌株為沙門菌。

2.2 細菌PCR鑒定

對生化試驗初步鑒定的89株沙門菌，用invA基因引物對進行PCR鑒定。結果顯示，從臨床中分離的89株沙門菌菌株均擴增出大約為241 bp的目的條帶，與預期相符(圖1)。這89株沙門菌invA基因測序結果與GenBank參考株的同源性均在97.9%～99.9%，說明其為沙門菌。

圖1 細菌PCR鑒定結果Fig.1 PCR identification results of bacteria 注：M.DL2000 DNA Marker；1.空白對照；2～9.分離菌株 Note：M，DL2000 DNA Marker.1，Blank control.2-9，Isolated strains

2.3 細菌致病性

攻毒組的小白鼠采食量減少，精神沉郁，扎堆與寒顫，水樣腹瀉，個別的出現急性死亡。試驗結束(6 d)，對照組小白鼠健康存活，未出現發病及死亡情況。通過細菌分離鑒定，從發病死亡的小白鼠體內分離得到沙門菌。經統計，發現75株沙門菌能引起小鼠發病。

2.4 藥敏試驗

對分離的75株致病性沙門菌藥敏試驗，結果由表1可知，這些沙門菌耐藥性嚴重，對鏈霉素、阿莫西林、氨芐西林、新霉素、慶大霉素、氟苯尼考、阿米卡星、磺胺間甲氧嘧啶和紅霉素9種藥物耐藥率較高，為77.3%～98.7%；對多西環素、環丙沙星、氨曲南、大觀霉素和多黏菌素5種藥物的耐藥率為45.3%～64.0%；對頭孢噻呋、頭孢噻肟、恩諾沙星和林可霉素4種藥物的耐藥率較低，為13.3%～22.7%。

表1 火烈鳥腹瀉沙門菌的藥敏試驗結果

2.5 多重耐藥性

由表2可知，臨床中分離的75株沙門菌呈現多重耐藥性，耐17種藥物有1株，耐16、7種藥物各3株，耐15、9、6種藥物各4株，耐14、8種藥物各有6株，耐13種藥物有5株，耐12、11、10 種藥物分離菌株最多，分別占分離菌株的16.0%、18.7%和17.3%。

表2 火烈鳥腹瀉沙門菌的多重耐藥性檢測結果

3 討論

禽類是沙門菌主要的感染宿主，也是攜帶者、傳播者。沙門菌既能水平傳播，又能垂直傳播，攜帶沙門菌的禽類可以通過多種途徑傳染給其他禽類或通過卵傳播給下一代，沙門菌在不同禽類養殖過程中廣泛傳播，危害較大[6-9]。沙門菌具有多種血清型且具有地區性，給疫苗研制帶來一定困難，也是導致該菌在禽類養殖過程中廣泛流行的一個重要的因素[9-12]。因此，對沙門菌凈化與防控具有重要的意義，2016—2020年，筆者在動物園患腹瀉火烈鳥的糞便、肛拭子和死亡火烈鳥的肝臟等102份病料組織中分離得到89株沙門菌，其中75株沙門菌對小白鼠具有致病性，說明動物園中火烈鳥沙門菌感染嚴重，存在一定的潛在威脅。動物園中火烈鳥感染的沙門菌可能來源于環境中的糞便或者水源，在防控時應該注意糞便的無公害化處理和環境消毒，以及水源的凈化與消毒。

沙門菌耐藥性問題很普遍，通過多種途徑在動物和人之間傳播，經成為公共衛生問題[13-14]。本研究表明，分離的75株沙門菌對常用的抗生素產生了很強的耐藥性，呈現多重耐藥性，耐12、11、10種藥物的分離菌株最多，說明動物園中火烈鳥源沙門菌耐藥性是普遍存在的，應該引起重視，注意環境凈化與病情防控，合理使用抗生素。