土三七致大鼠肝竇阻塞綜合征發(fā)病機(jī)制研究

石玉芝，陳 芳，許 劍*

（1.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院藥學(xué)部；2.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院感染性疾病科，重慶 400120）

肝竇阻塞綜合征（hepatic sinusoidal obstruction syndrome,HSOS），又稱為肝靜脈閉塞病（Hepatic veno-occlusive disease, HVOD），是由各種原因?qū)е碌母窝]、肝小靜脈和小葉間靜脈內(nèi)皮細(xì)胞水腫、壞死、脫落進(jìn)而形成微血栓，引起肝內(nèi)淤血、肝損傷和門靜脈高壓的一種肝臟血管性疾病[1]。其常見(jiàn)的原因主要有造血干細(xì)胞移植前大劑量化療、攝入含吡咯烷生物堿（PA）的中草藥、放射治療、器官移植、長(zhǎng)期口服避孕藥及飲酒等[2]。其中，服用含有PA的植物藥物是發(fā)展中國(guó)家HSOS的主要病因，在我國(guó)主要由土三七引起[3-4]，但具體的發(fā)病機(jī)制尚不明確。本研究目的在于初步探索土三七致HSOS可能的靶基因，為HSOS的精準(zhǔn)治療及預(yù)防提供可能的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用24只健康SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重（200±20 g），由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[ 生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2018-18；使用許可證號(hào)：SYXK（川）2018-076]。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)環(huán)境為層流潔凈飼育室，溫度為室溫22～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，晝夜明暗交替12 h/12 h；自由飲食、飲水，大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周，觀察無(wú)不良反應(yīng)后，納入實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查（倫理審批號(hào)：2010JC012）。

1.1.2 藥材和試劑 土三七由重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院藥學(xué)部從安徽省亳州市藥材總公司中藥公司購(gòu)買，Trizol試劑（購(gòu)于Thermo Fisher Scientific有限公司），福爾馬林液由川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 土三七灌胃藥液的制備 將土三七打粉，每次取150 g置于砂鍋中，加入900 mL水浸泡2 h，煎煮1.5 h后，濾出藥渣，得到藥液A；繼續(xù)加水600 mL煎煮1 h，濾出藥渣，得到藥液B，將藥液A和藥液B置于煎藥鍋中，濃縮至150 mL，即得到藥液濃度為1.0 g/mL土三七藥液。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和干預(yù) 分組方法：將24只雄性大鼠分籠喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后以隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為土三七高濃度組、中濃度組、低濃度組及空白對(duì)照組，每組6只。

干預(yù)方法：各組大鼠每日同一時(shí)間灌胃1次，高濃度組、中濃度組、低濃度組分別按照 [20 g/(Kg·d)]、[10 g/(kg·d)]、[5 g/(kg·d)]的劑量以土三七藥液灌胃，給予空白對(duì)照組相應(yīng)的生理鹽水灌胃，1次/d。所有SD大鼠灌胃前稱體重，根據(jù)體重變化調(diào)整當(dāng)日灌胃劑量。

1.2.3 肝組織病理檢查 灌胃4周后，以引頸法處死大鼠，剖腹取大鼠肝臟組織，留取部分肝組織備用，生理鹽水沖洗后用福爾馬林液固定，行肝組織HE染色及MASSON染色，證實(shí)HSOS形成情況。

1.2.4 通過(guò)基因芯片篩選靶基因 將肝臟病理檢查證實(shí)為HSOS的大鼠的肝組織提取RNA，以膽汁淤積、脂肪變性、磷脂病、肝細(xì)胞毒性、致癌性、炎癥壞死等相關(guān)標(biāo)志物84個(gè)基因和12個(gè)內(nèi)參基因組成96孔基因芯片（靶基因列表見(jiàn)表1）以篩選可能的致病靶基因。隨后通過(guò)Western blot法進(jìn)一步炎癥靶基因蛋白表達(dá)水平及其上下游相關(guān)蛋白表達(dá)水平。

表1 PCR array篩選基因列表

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，PCR array描述RNA倍數(shù)變化采用2△△CT法[5]，Western blot結(jié)果采用檢測(cè)指標(biāo)灰度值與內(nèi)參灰度值之比進(jìn)行計(jì)量分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，用(±s)表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠生存情況 造模第1周結(jié)束時(shí)，高濃度組死亡5只，剩余1只在第2周內(nèi)死亡。至第4周造模結(jié)束時(shí)，中濃度組大鼠存活3只，低濃度組大鼠存活4只，對(duì)照組大鼠無(wú)死亡發(fā)生。

2.2 大鼠肝臟病理學(xué)變化 高濃度組大鼠在造模2周內(nèi)全部死亡，故無(wú)4周后的病理結(jié)果。造模4周結(jié)束，光鏡下觀察，低濃度組、中濃度組各組大鼠HE染色顯示肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，多個(gè)小葉出血、壞死，肝細(xì)胞明顯減少或消失，伴灶性纖維素樣滲出，部分可見(jiàn)含鐵血黃素沉積，門靜脈、中央靜脈、肝竇不同程度擴(kuò)張、淤血，部分中央靜脈閉塞。MASSON染色可見(jiàn)門靜脈周圍及中央靜脈內(nèi)皮下纖維化，部分中央靜脈閉塞。中濃度組大鼠上述病理改變較為典型。對(duì)照組大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀排列，MASSON染色未見(jiàn)纖維蛋白沉積（圖1）。

圖1 造模4周結(jié)束時(shí)大鼠肝臟病理形態(tài)（光鏡×200）

2.3 大鼠肝組織靶基因PCR array篩查 在84個(gè)目標(biāo)基因中發(fā)現(xiàn)具有明顯倍數(shù)關(guān)系（＞2倍）變化的基因有Ccng1、Cdkn1a、Pdgfra、Cd68、Thrsp、Serpine1、Cav1、Hmox1 8個(gè)基因。結(jié)合病理特征進(jìn)一步篩選發(fā)現(xiàn)，中濃度組大鼠serpine1轉(zhuǎn)錄水平較空白組明顯較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而低濃度組與空白對(duì)照組大鼠比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；除此之外，尚有Ccng1、Cdkn1a兩個(gè)基因，低濃度、中濃度與空白組大鼠對(duì)比倍數(shù)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）且低濃度組與中濃度組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 PCR array具有明顯倍數(shù)關(guān)系的基因表

2.4 肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷相關(guān)蛋白檢測(cè) Western blot檢測(cè)顯示，中濃度土三七組大鼠肝組織serpine1蛋白表達(dá)水平低于空白組表達(dá)水平（P＜0.05），低濃度土三七組大鼠serpine1蛋白表達(dá)水平與空白組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）（圖2）；中濃度土三七組大鼠基質(zhì)金屬肽酶9（MMP-9）蛋白表達(dá)水平明顯高于空白組表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），低濃度土三七組大鼠MMP9蛋白表達(dá)水平與空白組表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3）；中濃度土三七組大鼠谷胱甘肽（GSH）蛋白表達(dá)水平低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低濃度土三七組大鼠GSH蛋白表達(dá)水平與空白組表達(dá)水平比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）（圖4）。

圖2 Western blot檢測(cè)大鼠肝組織serpine1蛋白水平

圖3 Western blot檢測(cè)大鼠肝組織MMP9蛋白水平

圖4 Western blot檢測(cè)大鼠肝組織GSH蛋白水平

3 討論

土三七，又名菊三七，屬于菊科，具有止血、散瘀、消腫等功效，是我國(guó)民間常用的治療跌打損傷的中草藥。菊科的土三七與主產(chǎn)自云南的五加科三七（參三七）容易混淆[6]，二者均具有止血、消腫等功效，而土三七含有PA，過(guò)量服用后可引起肝竇阻塞綜合征（HSOS）。國(guó)內(nèi)報(bào)道的HSOS病例約有半數(shù)以上為服用土三七所致[7]。患者發(fā)病后主要的臨床表現(xiàn)為肝區(qū)疼痛、肝大和腹水，總死亡率可高達(dá)67%，除了肝移植外尚無(wú)特異性的治療手段[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，給予大鼠高劑量土三七[20 g/(Kg·d)]灌胃1周后，死亡率超過(guò)80%，2周內(nèi)死亡率為100%，這說(shuō)明高劑量的土三七具有較強(qiáng)的毒性及致死性。

土三七含有較高劑量的PA，其在肝細(xì)胞色素p450的代謝下，最終代謝產(chǎn)物與細(xì)胞蛋白及DNA反應(yīng)后生成“吡咯代謝物或代謝吡咯”，其中一部分降解為次生毒性代謝物，誘發(fā)急慢性或遺傳毒性，造成肝細(xì)胞功能紊亂、壞死甚至組織損傷[9]。本實(shí)驗(yàn)造模4周，光鏡下觀察大鼠肝組織，土三七低、中濃度各組大鼠HE染色均可見(jiàn)不同程度門靜脈、中央靜脈、肝竇的擴(kuò)張、淤血，肝細(xì)胞壞死及匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；MASSON染色顯示不同程度纖維組織增生，符合HSOS的病理特征。這表明服用低、中濃度土三七灌胃4周可成功誘導(dǎo)大鼠HSOS的形成，以中濃度組較為明顯，且隨著劑量的增加，致死性隨之增加。

肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷在HSOS 發(fā)病中起著重要作用[6]。本研究經(jīng)PCR array檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，中濃度大鼠肝組織中serpine1轉(zhuǎn)錄水平較空白組明顯較低（P＜0.05），而低濃度組與空白對(duì)照組無(wú)差異（P＞0.05）。這說(shuō)明中濃度土三七可通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞損傷途徑導(dǎo)致HSOS，serpine1可能是其作用的靶點(diǎn)。Serpine1是serpine超家族的絲氨酸蛋白酶抑制劑，其可由包括內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和血小板等多種細(xì)胞合成[10]，其與慢性肝病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11]。Serpine1敲除的小鼠MMP-9活性增加[12]，MMP9表達(dá)的增加與HSOS的發(fā)展密切相關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，中濃度土三七組隨著serpine1蛋白水平的降低，MMP9蛋白表達(dá)水平升高。可以推測(cè)，中濃度土三七通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞損傷途徑引起serpine1表達(dá)降低，繼而引起MMP9蛋白的表達(dá)升高，從而導(dǎo)致HSOS。

PA代謝產(chǎn)物可與GSH或半胱氨酸反應(yīng)形成毒性較弱或無(wú)毒的產(chǎn)物。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞GSH耗竭在HSOS發(fā)病中起重要作用。當(dāng)GSH含量減少時(shí)，毒性物質(zhì)形成增加，從而導(dǎo)致肝竇內(nèi)皮細(xì)胞受損，典型表現(xiàn)以肝腺泡Ⅲ區(qū)為主的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、損傷、脫落，肝竇顯著擴(kuò)張充血；肝細(xì)胞不同程度地腫脹、壞死，紅細(xì)胞滲入狄氏間隙，肝內(nèi)小靜脈管壁增厚，管腔狹窄、閉塞，無(wú)纖維化表現(xiàn)或可見(jiàn)匯管區(qū)輕度纖維增生[14]。本研究發(fā)現(xiàn)中濃度土三七組GSH蛋白表達(dá)水平低于空白組，推測(cè)土三七可能通過(guò)下調(diào)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞谷胱甘肽的合成或耗竭，引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致HSOS的發(fā)生。

另外，本研究通過(guò)PCR Array實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，低濃度、中濃度土三七所致大鼠肝組織中的Ccng1和Cdkn1a的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于空白組（P＜0.05）。細(xì)胞周期蛋白G1(Ccng1)和Cdkn1a是參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的關(guān)鍵酶，是多個(gè)miRNA的靶點(diǎn)[15]。miRNA可在調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中與靶細(xì)胞相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，已成為藥物性肝損傷的重要機(jī)制[16-17]，具體機(jī)制有待闡明。

4 結(jié)論

土三七通過(guò)下調(diào)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞谷胱甘肽的合成，引起肝竇內(nèi)皮細(xì)胞serprine1表達(dá)下降，繼而引起MMP表達(dá)水平升高，最終引起HSOS。這初步揭示了土三七可能的致病機(jī)制，為探索土三七所致HSOS的分子機(jī)制提供了一定的理論依據(jù)。