吡蟲啉人工半抗原合成方法的優化

鐘藝煊 王彥紅 楊成根 鄒 輝 顧建紅 袁 燕 卞建春 劉學忠*

(1.揚州大學 獸醫學院/教育部農業與農產品安全國際合作聯合實驗室,江蘇 揚州 225009； 2.揚州大學 化學化工學院,江蘇 揚州 225009； 3.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心,江蘇 揚州 225009)

農藥是一類多相化學物質，可以通過控制病菌的危害來減少生物毒素的產生和食源性疾病微生物的污染，保障農產品質量安全。20世紀90年代以來，新煙堿類殺蟲劑已成為世界上使用最頻繁的殺蟲劑之一。根據中國農藥信息網數據顯示，截止到2017年7月，新煙堿類殺蟲劑已占據我國殺蟲劑市場份額的1/4以上。其中，作為第一代新煙堿類殺蟲劑代表的吡蟲啉(IMI)，使用最為廣泛。IMI是一種尼古丁類神經毒性殺蟲劑，通過煙堿型乙酰膽堿受體(NAChR)阻斷神經傳遞，導致昆蟲麻痹死亡。通常用于農作物、水果和蔬菜中，以防治刺吸式口器害蟲。IMI對昆蟲具有急性毒性，因其可在哺乳動物體內蓄積，IMI對哺乳動物的亞致死性損傷作用也日益凸顯，長期暴露會影響人和動物的免疫系統、生殖系統和神經系統等。目前有研究表明，IMI對非靶標生物體的不利影響，包括對人體的不利影響，取決于暴露量。因此，對于IMI殘留的檢測顯得尤為重要。

目前，新煙堿類農藥殘留常規檢測方法有氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜串聯質譜(GC-MS)和高效液相色譜串聯質譜(HPLC-MS/MS)，這些常規檢測方法費時耗力，過度依賴儀器和專業檢測人員，不適合進行現場檢測。因此,人們迫切希望有一種簡單、快速、靈敏及價廉的ELISA檢測技術能在室外和實驗室內進行大批量的篩選試驗。

IMI分子量為255.66，是一種小分子物質。只具備反應原性而不具備免疫原性，只有與載體蛋白偶聯以后，才具備免疫原性。一般來說，具有活性基團的小分子，可以與載體蛋白直接進行偶聯。因為IMI不具備與載體蛋白直接進行偶聯的活性基團，與載體蛋白的連接較困難，所以需要先對IMI分子進行衍生。這主要依賴其分子結構中的 3 個活性位點，分別是：吡啶環上α-Cl、咪唑環上亞胺基H原子和-NO。目前，朱國念等和姚蕾珺主要是通過親和取代反應替換吡啶環上α-Cl；馬寅生等和Lee等主要是通過將-NO還原成-NH，使其與載體蛋白直接偶聯；通過吸電子效應取代咪唑環上亞胺基H原子這一方法理論可行，實際操作則會大大降低該化合物與乙酰膽堿受體的結合能力。其中，親和取代反應法最早被用于IMI人工半抗原的合成，且應用最為廣泛。半抗原從-Cl衍生簡單碳鏈，對吡蟲啉的結構改動小，且Cl原子位于分子識別的遠端，能使IMI的抗原決定簇充分暴露，合成半抗原的抗體非常靈敏。

通過親和取代反應取代IMI吡啶環上α-Cl這一半抗原合成方法以朱國念等發表的最為成熟。雖然此方法為目前最為常用的IMI人工半抗原合成方法，但也存在很多缺點，如：試驗過程中使用高危化學試劑，易造成火災、半抗原合成過程容易產生較多雜質、免疫后小鼠血清抗體效價低等。本研究旨在減少常規IMI半抗原合成方法中雜質的產生，提高免疫后小鼠血清抗體效價，最終提高IMI單克隆抗體制備過程中融合細胞的陽性率，獲得高質量、高產量的IMI單克隆抗體細胞株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

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實驗動物

健康狀況良好的7周齡雌性SPF級BALB/c小鼠(編號為202103799)，購自常州卡文斯實驗動物有限公司。

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主要試劑及儀器

95%的吡蟲啉原藥(江蘇紅太陽集團有限公司)，N,N’-二環己基碳二亞胺、98% 3-巰基丙酸、N-羥基琥珀酰亞胺(Sigma-Aldrich)，4-二甲基吡啶(上海源葉生物科技有限公司)，二甲亞砜、薄層層析硅膠版GF254型(揚州必幫生物技術有限公司)，氫氧化鉀、二氯甲烷、乙酸乙酯等其他試劑為國產分析純或優級純。

maXis超高分辨飛行時間質譜儀、AVANCE 600核磁共振波譜儀NMR(Bruker Daltonics)，通風廚(揚州天輝鋼木制品公司)，電熱套、化學用升降臺(揚州必幫生物技術有限公司)，旋轉蒸發儀(上海申生科技有限公司)等。

1.2 試驗方法

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試驗原理

如圖1所示：以IMI原藥和3-巰基丙酸為原料，在熱堿的作用下，通過親和取代反應，合成IMI人工半抗原。

圖1 IMI人工半抗原合成路線圖Fig.1 Roadmap of IMI artificial semi-antigen synthesis

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IMI半抗原合成方法的優化

IMI半抗原常規合成方法參照朱國念等報道的方法如下：稱取IMI 5.15 g，用20 mL DMSO溶解，再加入KOH 2.25 g；另稱取3-巰基丙酸2.10 g，用10 mL DMSO溶解；在攪拌下將3-巰基丙酸溶液緩慢滴加到三口燒瓶中，于油浴上使之緩慢升溫至100 ℃，保溫2 h后；撤去油浴，待產物自然冷卻至室溫。取反應體系5 mL，加入8 mL雙蒸水，以6 mol/L HCL溶液調節pH為3；用4 mL二氯甲烷在分液漏斗中萃取，收集下層。用3 mL NaHCO水溶液萃取，收集上層；用少量乙醚洗滌水相，棄去乙醚層；用6 mol/L HCL溶液調節水相pH為3，然后用3 mL乙酸乙酯分萃取，合并乙酸乙酯提取液。用少量蒸餾水洗滌乙酸乙酯，棄水層。提取液經無水硫酸鈉干燥后，減壓濃縮。加入少量丙酮溶液溶解,靜置過夜,有黃色晶體析出，即為IMI半抗原。

IMI半抗原合成方法的優化(下文稱為優化方法)如下：稱取IMI 1.3 g于三口燒瓶中，用15 mL DMSO溶解，得到A液；稱取篩選出的最適比例的KOH和3-巰基丙酸(專利申請號：CN202110772955.0)，用5 mL DMSO溶解，得到B液；打開電熱套，將A液緩慢升溫至100 ℃；通入氮氣；緩慢向其中滴加B液，邊加邊攪拌；100 ℃保溫3 h；撤去電熱套，待反應體系冷卻至室溫。取反應體系5 mL，用8 mL雙蒸水溶解，6 mol/L稀鹽酸調pH至3.0；用4 mL二氯甲烷在分液漏斗中萃取，收集下層；下層用3 mL NaHCO水溶液萃取，收集上層；上層用3 mL乙酸乙酯萃取，收集下層；下層用6 mol/L稀鹽酸調pH至3.0，用3 mL乙酸乙酯萃取，收集上層，產品在上層中。取30 mL產品用DDW萃取后加入1.2 g無水硫酸鈉干燥，用旋轉蒸發儀蒸發得到IMI半抗原。

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IMI半抗原結構鑒定

IMI半抗原的分子結構采用薄層層析色譜(TLC)法、質譜(MS-ESI)法和核磁共振(H-NMR)法進行確證。

1.2.3.1 薄層層析色譜(TLC)法

采用微量毛細管進行點樣。點樣前，先用鉛筆在薄層板上距末端1 cm處輕輕畫一橫線，然后用毛細管吸取樣液在橫線上輕輕點樣。將點樣的薄層板放在展開劑中展開，待位移至2/3處，取出薄層板。展開后的薄層板干燥后，用紫外光燈照射，檢出斑點。展開分離后，化合物在薄層板上的位置用比移值R(溶質移動的距離/溶液移動的距離)來表示。

1.2.3.2 質譜(MS-ESI)法

采用電噴霧串聯三重四極桿質譜對IMI人工合成半抗原進行分析, 負離子模式，電噴霧電壓3 000 V,毛細管電壓為60 V,離子源溫度105 ℃,輔助氣溫度350 ℃,進行一級質譜掃描,獲取母離子質荷比,對IMI半抗原進行結構鑒定。

1.2.3.3 核磁共振(H-NMR)法

將合成的IMI人工半抗原用CDSO溶解后掃描其H-NMR譜，根據不同H原子的化學位移和不同位移處NMR譜峰的積分比例，分析合成的IMI人工半抗原中H原子的數目及分布，以確定IMI人工半抗原合成情況。

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完全抗原偶聯鑒定

將常規方法合成獲得的IMI半抗原和優化方法合成獲得的IMI半抗原通過親和取代反應分別與相同載體蛋白(BSA)進行偶聯得到完全抗原。偶聯得到的完全抗原(IMI-BSA)進行3 d的透析純化。采用薄層析色譜法(方法同1.2.3.1)，鑒定IMI-BSA是否偶聯成功。

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吡蟲啉完全抗原免疫小鼠及血清抗體效價的測定

用鑒定后的完全抗原按照表1的免疫程序對7周齡雌性SPF級BALB/c小鼠進行免疫，并于三免和五免7 d之后斷尾采血，按照李剛等方法，對小鼠血清采用間接ELISA法測定其抗體效價。

表1 吡蟲啉完全抗原免疫小鼠的免疫程序
Table 1 Immunization program in mice immunized with imidacloprid complete antigen

免疫時間Immune time免疫原 Immunogen常規方法Conventionalmethod優化方法Optimizationmethod免疫劑量Immune dose免疫途徑Immune route首免First immunizationIMI-BSA+弗氏完全佐劑優化IMI-BSA+弗氏完全佐劑50 μg/0.1 mL/只腹腔注射二免(間隔三周)Second immunization(Three-week interval)IMI-BSA+弗氏不完全佐劑優化IMI-BSA+弗氏不完全佐劑50 μg/0.1 mL/只腹腔+皮下三點注射三免(間隔兩周)Third immunization(Two-week interval)IMI-BSA+弗氏不完全佐劑優化IMI-BSA+弗氏不完全佐劑50 μg/0.1 mL/只腹腔+皮下三點注射四免(間隔兩周)Fourth immunization(Two-week interval)IMI-BSA+弗氏不完全佐劑優化IMI-BSA+弗氏不完全佐劑50 μg/0.1 mL/只腹腔+皮下三點注射五免(間隔兩周)Fifth immunization(Two-week interval)IMI-BSA+弗氏不完全佐劑優化MI-BSA+弗氏不完全佐劑50 μg/0.1 mL/只腹腔+皮下三點注射沖擊免疫(融合前3 d)Shock immunity(Three days before integration)IMI-BSA+生理鹽水優化IMI-BSA+生理鹽水50 μg/0.1 mL/只腹腔注射

2 結果與分析

2.1 半抗原的鑒定

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薄層層析色譜法檢測分析

根據圖2薄層層析色譜圖計算各物質的比移值R(溶質移動的距離/溶液移動的距離)，結果顯示：IMI、反應體系、有機相和水相的R值分別為0.55、0.23、0.50和0。產品萃取后保留在有機相中，在相同展開劑中，產品的R值與IMI、反應體系、和水相均不相同，且紫外下可見熒光反應，判定IMI半抗原合成成功。

A:IMI；B:反應體系;C:有機相;D:水相 A: Imidacloprid; B: Reaction system; C: Organic phase; D: Aqueous phase圖2 TLC法檢測半抗原偶聯反應Fig.2 TLC method for detection of semi-antigenic coupling reactions

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質譜法分析結果

圖3 IMI半抗原質譜法分析結果顯示：M，m/z，326，且其余分子離子峰的解釋也較為合理，因此可以判斷，該碎片離子峰為IMI人工半抗原的分子離子峰[M]。

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核磁共振法分析結果

圖4 IMI半抗原核磁共振法分析結果顯示，該化合物H-NMR譜(400 MHz，DMSO-D)為：δ12.36 (1H, s, COOH)，8.89 (1H, s, NH)，8.38～8.39(1H, d, Pry：H)，7.52～7.81 (1H, q, Pry：H)，8.37～8.98 (1H, t, Pry：H)，4.47(2H, s, CH)，4.02(2H, q, CH)，2.50～2.90 (2H, q, CH)，1.24(2H, m, CH)，與文獻報道的IMI半抗原核磁結果相符。

圖3 IMI 半抗原質譜圖Fig.3 Mass spectrum of imidacloprid hapten

圖4 IMI半抗原核磁圖Fig.4 Nuclear magnetic resonance (NMR) of imidacloprid hapten

2.2 完全抗原的偶聯鑒定

采用薄層層析色譜法對完全抗原偶聯過程進行監測。根據圖5薄層層析色譜圖計算各物質的比移值R(溶質移動的距離/溶液移動的距離)，結果顯示：IMI-BSA和BSA的R值分別為0.43和0.85。在相同的展開劑下，具有不同的R，判斷有新物質生成，而當加入BSA后，經過一段時間樣點消失，判斷物質偶聯完全，可初步驗證IMI和BSA反應良好，初步判定IMI-BSA免疫原偶聯成功。

2.3 小鼠血清抗體效價測定結果

三免和五免7 d之后斷尾采血，測定小鼠血清抗體效價，如圖6所示：使用常規方法合成的IMI半抗原進行免疫的小鼠，血清抗體效價在三免后僅達到1∶800，五免后勉強達到1∶12 800；而使用優化方法合成的IMI半抗原進行免疫的小鼠，血清抗體效價在三免后均可達到1∶12 800，五免后可達到1∶51 200。

A:IMI-BSA; B:反應體系 A: Imidacloprid； B: Reaction system圖5 TLC法檢測完全抗原偶聯反應Fig.5 TLC method for detection of complete antigenic coupling reactions

圖6 小鼠血清抗體效價測定Fig.6 Detection of antibody titers of mouse serum

3 討 論

3.1 調整使用試劑對試驗安全性的影響

IMI半抗原合成過程，反應需持續加熱。常規方法使用油浴加熱，導熱效果好，能使物質均勻受熱且保持恒溫，但操作過程需十分謹慎，以防因油外溢而燙傷或因升溫過高而引起火災。優化方法選用恒溫電熱套代替油浴，升溫更快、可控性更好，且可以很好地避免燙傷和失火。

常規方法使用的乙醚等高危化學試劑，操作人員長期低濃度接觸會透皮吸收，因毒性蓄積而出現一系列不適癥狀。優化方法使用乙酸乙酯替換乙醚，降低了化學試劑對試驗人員的毒性，提高了試驗操作的安全性。

3.2 調整反應順序和試劑比例對半抗原合成過程雜質產生的影響

常規IMI半抗原合成方法，雖然能夠得到最終產品，但合成的半抗原含雜質較多，會產生較多3-巰基丙酸的氧化副產物和其他碎片離子。并且，在普通實驗室，每次合成的半抗原數量有限，往往需要進行多次重復試驗才可獲得足夠量的半抗原進行下一步試驗。

優化方法在3-巰基丙酸加入反應之前預先通入氮氣，并維持到整個反應結束，以此排出氧氣，一定程度減少了氧氣與3-巰基丙酸發生反應而產生氧化副產物。同時，篩選出最適3-巰基丙酸反應比例，一方面保證3-巰基丙酸能夠完全反應，保證IMI人工半抗原的產量，另一方面防止3-巰基丙酸過剩而與其他物質反應生成氧化副產物或者有大量3-巰基丙酸殘留而產生過多的雜質。優化方法質譜結果顯示質荷比為326的峰是IMI半抗原的分子離子峰，符合質譜分析中有機物的含氮規則。相較于李廣領的方法，其余碎片離子峰數量有了很大程度的減少。一方面，說明優化方法合成的半抗原雜質減少，另一方面，溶劑峰的減少和下降，也說明了IMI半抗原合成反應更為徹底。優化方法核磁結果與文獻報道相符，相較于朱國念等的方法，12.36處的3-巰基丙酸的氧化副產物峰明顯下降，說明3-巰基丙酸的氧化副產物減少，進一步說明優化方法合成的人工半抗原雜質減少。但是，由于專業純度檢測儀器的限制，尚未準確測出半抗原純度，具體提升值尚不明確，后續可作進一步檢測。

3.3 優化方法對免疫后小鼠血清抗體效價的影響

單抗制備過程中動物的免疫效價，會影響其產生特異性抗體的能力，同時也影響單抗的大量生產。若半抗原偶聯數量過多, 會因抗原過量而產生免疫耐受；若半抗原偶聯數量過少, 則會因抗原不足而不產生抗體。所以, 小分子抗原偶聯到載體的數量要適中, 才能使免疫后的小鼠產生高效價的抗體。

使用優化方法合成獲得的半抗原與載體蛋白偶聯得到完全抗原，用偶聯的完全抗原免疫小鼠，三免后，小鼠血清抗體效價均可達到1∶12 800；五免后，小鼠血清抗體效價達到1∶51 200。使用常規合成方法偶聯獲得的完全抗原免疫小鼠，五免后，小鼠血清抗體效價僅達到1∶12 800。李剛等使用常規合成方法偶聯獲得的完全抗原免疫小鼠，小鼠血清抗體效價最高達到1∶12 800。說明優化方法可以刺激小鼠更穩定地產生更高滴度的抗體。小鼠血清抗體效價越高，其針對抗原的特異性抗體濃度則越高，細胞融合后篩選出陽性的概率也越大，所以單抗制備過程中，提高小鼠抗體效價十分重要。不僅免疫的抗原能影響免疫就小鼠血清抗體效價，不同的免疫途徑和免疫劑量也會使免疫后小鼠效價發生改變。后續可改變免疫的途徑和免疫的劑量，進一步篩選出一套可以刺激小鼠更穩定地產生更高效價的免疫程序，使整個免疫流程更為高效、便利。

4 展 望

本研究通過調整半抗原合成過程反應順序和篩選最適3-巰基丙酸反應比例，在相對安全的試驗環境下，減少了IMI人工半抗原合成過程中雜質的產生，一定程度上提高了IMI人工半抗原純度。免疫后，小鼠能產生更高滴度的抗體。后續可繼續進行IMI單克隆抗體的制備，研究更高滴度的抗體是否能夠刺激小鼠產生更多的B淋巴細胞用于后續細胞融合，從而提升細胞融合后的陽性率，獲得更高質量的IMI單克隆抗體細胞株。最終，建立起能在室外和室內進行大批量篩選試驗的簡單、快速、靈敏及性價比高的ELISA檢測技術。