華北落葉松不同部位的揮發(fā)物成分分析

李亞勇，張 平，李茂林，楊美紅，趙 祥

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)部化學(xué)生態(tài)研究所，山西太谷 030801；2.山西省關(guān)帝山國有林管理局 雙家寨林場，山西 交城 030500；3.山西省管涔山國有林管理局有害生物防治檢疫站，山西 寧武 036700；4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院，山西 太谷 030801）

華北落葉松（Larix principis-rupprechtii）是松 科落葉松屬喬木，為華北地區(qū)高山針葉林帶中的主要森林樹種，也是我國獨(dú)有的樹種，主要分布在山西、河南和河北等地，而山西省是華北落葉松生長的最適區(qū)，具有生長快、適應(yīng)性強(qiáng)、移植成活率高等優(yōu)良的特性，是很多地區(qū)主要的速生造林樹種之一，也是重要用材林。目前，在山西省山地造林華北落葉松約占20%。不僅如此，由于華北落葉松季相變化復(fù)雜，樹姿優(yōu)美，華北落葉松正由高山走向平原，成為一種綠化樹種，走進(jìn)人們的視野中[1-3]。

目前，華北落葉松以人工純林為主，這為各類病蟲害的暴發(fā)提供了條件，伴隨著各種氣候等因素，容易形成暴發(fā)性災(zāi)害，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。嚴(yán)重影響華北落葉松生長的主要害蟲有落葉松葉蜂、落葉松尺蠖、落葉松毛蟲、落葉松鞘蛾、落葉松球蚜、落葉松八齒小蠹、落葉松松線小卷蛾、西北槌緣葉蜂等，多年來華北落葉松害蟲的防治方法一直以營造混交林、加強(qiáng)天敵保護(hù)及化學(xué)防治為主，其中化學(xué)防治最有效，在害蟲大面積暴發(fā)的應(yīng)急防控方面有著無可替代的優(yōu)勢[4-7]。但其過度使用會造成環(huán)境污染、蟲害抗性增加、生物多樣性降低等一系列負(fù)面影響，因此，對華北落葉松綠色安全的生物防治方法的研究迫在眉睫[8]。

植物揮發(fā)性物質(zhì)是已被國際公認(rèn)的蟲害綠色防控技術(shù)之一，在蟲害治理中發(fā)揮著重要作用[9]。其應(yīng)用大體分為兩類：一是早期利用天然植物作為誘集或驅(qū)避植物，如我國棉鈴蟲的測報(bào)及防治就大量利用了楊樹枝把的誘蛾技術(shù)；二是人工合成植物源引誘劑或趨避劑對蟲害進(jìn)行預(yù)報(bào)和防治，也是目前研究的熱點(diǎn)。隨著研究的不斷深入，針對多種害蟲的植物源引誘劑，已經(jīng)在世界各地廣泛應(yīng)用[10]，如植物源引誘劑已成為實(shí)蠅、夜蛾、甲蟲、薊馬等多類重大害蟲綜合防治體系中的重要組成部分。由松樹釋放的揮發(fā)物人工合成的多種植物源引誘劑對降低松褐天牛蟲口密度，遏制松材線蟲病的擴(kuò)散和蔓延，都起到積極的作用[11]。此外，大量野外誘捕試驗(yàn)表明，油松揮發(fā)物中的3種揮發(fā)物3-蒈烯、β-蒎烯和α-蒎烯對紅脂大小蠹具有強(qiáng)烈的引誘作用[12-13]；紅松揮發(fā)物質(zhì)中的S型α-蒎烯、R型-蒎烯和羅勒烯對松梢象有顯著的引誘作用，而反-檸檬烯對松梢象則有明顯的趨避作用[14]。

同時(shí)植物揮發(fā)物在植物與昆蟲協(xié)同進(jìn)化進(jìn)程中扮演者重要的角色，是昆蟲與寄主進(jìn)行聯(lián)系的基礎(chǔ)，不僅對植食性昆蟲產(chǎn)卵、取食、寄主定向選擇等發(fā)揮著重要的作用[15-18]，還可作為昆蟲防御天敵的物質(zhì)[19]。因此，分析和鑒定植物揮發(fā)物中的活性組分及其定量組成是了解植物與昆蟲之間復(fù)雜關(guān)系的重要前提。本研究采用頂空固相微萃取（HSSPME）-氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用法分析比較了華北落葉松莖、葉、花3個(gè)部位揮發(fā)物組分的種類及含量差異，為華北落葉松蟲害植物源引誘劑的開發(fā)和研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2021年5月初采集山西省管涔山國有林管理局閆家村林場（38°38′28.608″N，111°50′11.040″E）試驗(yàn)基地的華北落葉松純林，為15 a以上的幼齡華北落葉松。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 揮發(fā)物的收集 從華北落葉松樹上摘下新鮮的莖、葉、花，分別剪碎后，各稱取2 g并置于20 mL的頂空進(jìn)樣瓶中，密封進(jìn)樣瓶瓶口，放在冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，待進(jìn)樣瓶恢復(fù)至室溫后，置于全自動固相微萃取裝置進(jìn)行HS-SPME萃取（50μm/30μm DVB/CAR/PDM萃取纖維頭，美國Supelo公司），萃取條件：30℃恒溫加熱20 min，萃取吸附40 min，進(jìn)樣口250℃解吸附5 min。華北落葉松的各部位均在相同條件下重復(fù)測定3次。

1.2.2 揮發(fā)物的分析 運(yùn)用美國Thermo公司生產(chǎn)的GC-MS聯(lián)用儀（TRACE ISQ 1310型）完成自動進(jìn)樣，對華北落葉松不同部位的揮發(fā)物進(jìn)行定性和定量分析。GC的工作條件：色譜柱為TG-5MS非極性毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm，5%Phenyl Methylpolysiloxane）；采用程序升溫法，初始溫度為40℃保持3 min，再以6℃/min升到160℃，保持1 min，最后以20℃/min升溫至250℃，保持時(shí)間5 min。檢測器溫度及進(jìn)樣口溫度均為250℃，載氣為高純度氮?dú)猓环至鬟M(jìn)樣。MS的工作條件：電子能量為70 eV的EI離子源；傳輸線溫度、四級桿溫度及離子源溫度分別為280、150、280℃；采用全掃描方式，掃描質(zhì)量范圍為45～550 amu。

1.2.3 揮發(fā)物的鑒定 使用AMDIS解卷積鑒定系統(tǒng)及NIST 2.0譜庫進(jìn)行全掃描式掃描，用計(jì)算機(jī)檢索獲得各揮發(fā)物組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，對于譜庫檢索結(jié)果顯示物質(zhì)單一的，其結(jié)果直接予以確認(rèn)；對于一些檢索結(jié)果出現(xiàn)2種及2種以上物質(zhì)的，結(jié)合人工譜圖解析，再加以確定，最后人工扣除含硅的一些色譜柱雜質(zhì)成分，得到最終揮發(fā)物組分。采用面積歸一化法定量分析各揮發(fā)物組分的相對含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及處理均用Excel 2019，用SPSS 25.0進(jìn)行單因素ANOVA檢驗(yàn)，并用Duncan氏多重比較分析3個(gè)部位揮發(fā)物之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 華北落葉松莖、葉、花揮發(fā)物主要類別分析

華北落葉松不同部位揮發(fā)性物質(zhì)的種類和相對含量如表1、2所示。

表1 華北落葉松不同部位揮發(fā)性物質(zhì)的種類和相對含量Tab.1 Types and r elative contents of volatiles in differ ent par ts of Larix principis-rupprechtii

續(xù)表1 華北落葉松不同部位揮發(fā)性物質(zhì)的種類和相對含量Tab.1（Continued） Types and relative contents of volatiles in different parts of Larix principis-rupprechtii

通過GC-MS分析，確定華北落葉松莖、葉、花釋放的揮發(fā)性物質(zhì)組分并計(jì)算出其相對含量（表1）。對華北落葉松莖、葉、花不同部位鑒定出的揮發(fā)物性化合物進(jìn)行分類，主要包括萜烯類、醇類、酮類、醚類等（表2）。其中，萜烯類的化合物種類最多，相對含量也最高。

表2 華北落葉松莖、葉、花3個(gè)部位揮發(fā)性成分的種類及相對含量Tab.2 Types and relative contents of volatiles in the stems，leaves and flowers of Larix principis-rupprechtii

華北落葉松莖中共鑒定出10類58種揮發(fā)性化合物，占揮發(fā)物總量的88.79%，其中，萜烯類25種（75.59%）、醇類10種（8.17%）、酮類8種（1.89%）、醚類4種（1.21%）、酯類4種（0.2%）、醛類1種（0.02%）、芳香烴類2種（0.66%）、烷烴類1種（0.02%）、烯 烴 類2種（0.84%）、炔 烴 類1種（0.19%）；葉中共鑒定出10類48種揮發(fā)性化合物，占揮發(fā)物總量的89.35%，其中，萜烯類22種（82.02%）、醇類9種（3.01%）、酮類5種（0.56%）、醚類3種（0.71%）、酯類3種（0.08%）、醛類1種（0.01%）、芳香烴類2種（0.88%）、烷烴類1種（0.03%）、烯烴類1種（2.03%）、酸類1種（0.02%）；花中共鑒定出9類50種揮發(fā)性化合物，占揮發(fā)物總量的94.77%，其中，萜烯類24種（84.27%）、醇類7種（7.59%）、酮類3種（0.39%）、醚類3種（0.54%）、酯類7種（0.56）、醛類1種（0.04%）、芳香烴類3種（0.73%）、烯烴類1種（0.62%）、酸類1種（0.03%）。

2.2 華北落葉松莖、葉、花揮發(fā)物含量分析

通過GC-MS分析，得到華北落葉松莖、葉、花揮發(fā)物的總離子流圖（圖1—3），莖中主要的揮發(fā)物有(E)-B-羅勒烯（20.92%）、β-蒎烯（15.79%）、檜烯（12.78%）、α-蒎烯（6.41%）等；葉中主要的揮發(fā)物有（+）-α-蒎烯（28.06%）、檜烯（11.41%）、β-蒎烯（8.78%）、大根香葉烯D（7.28%）等；花中主要的揮發(fā)物有(+)-α-蒎烯（13.52%）、α-蒎烯（11.44%）、β-蒎烯（10.52%）、（-）-β-蒎烯（10.49%）、羅勒烯（10.22%）、γ-松油烯（6.76%）等。

2.3 華北落葉松各部位揮發(fā)物成分比較

華北落葉松莖、葉、花3個(gè)部位一共鑒定出78種揮發(fā)性化合物，其中莖中所特有的揮發(fā)物有15種，葉和花中所特有的揮發(fā)物均有6種，莖、葉、花3個(gè)部位共有的揮發(fā)物有28種。共有的揮發(fā)物中β-蒎烯在莖、葉、花中的含量分別為15.79%、8.78%、10.52%，與左旋樟腦和馬鞭草烯醇一樣，在莖的含量均最高，極顯著高于葉和花中的含量（P＜0.01），而月桂烯和α-律草烯中，莖的含量顯著低于葉和花中的含量（P＜0.05），4種揮發(fā)物在葉和花之間的含量差異均不顯著；（-）-4-萜品醇、（-）-A-蓽澄茄油烯、β-石竹烯、苯乙烯和γ-松油烯等5種揮發(fā)物在3個(gè)部位間含量差異顯著（P＜0.05）；三環(huán)萜、（E）-β-金合歡烯、油酸甲酯和硬脂酸甲酯在3個(gè)部位間含量差異不顯著；麝香草酚甲醚在莖中的含量顯著大于花中的含量，而莰烯在莖中的含量顯著大于葉中的含量（P＜0.05）；1,2,4a,5,6,8a-六氫-4,7-二甲基-1-（1-甲基乙基）萘、Δ-杜松烯、胡椒酮、乙醇、[1S,2R,6R,7R,8S,（+）]-1,3-二甲基-8-（1-甲基乙基）三環(huán)[4.4.0.0（2,7）]癸-3-烯、β-波旁烯、畢澄茄烯、（3E,5E）-2,6-二甲基-1,3,5,7-辛四烯、Γ-杜松烯和大根香葉烯D等10種共有揮發(fā)物在莖和花之間的含量差異均不顯著，莖和葉及葉和花間存在顯著差異（P＜0.05）；羅勒烯和苯甲酸乙酯在花中的含量極顯著高于莖和葉中的含量（P＜0.01），莖和葉之間的含量差異不顯著。

3 結(jié)論與討論

本研究中采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法對華北落葉松莖、葉、花3個(gè)部位的揮發(fā)物進(jìn)行收集、鑒定和分析。結(jié)果表明，不同部位的揮發(fā)物種類及相對含量差異明顯，莖中揮發(fā)物的種類最多，其次為花，葉中揮發(fā)物種類最少。其中，莖中最主要的揮發(fā)物為（E）-B-羅勒烯（20.92%）、β-蒎烯（15.79%）、檜烯（12.78%），葉中最主要的揮發(fā)物為（+）-α-蒎烯（28.06%）、檜烯（11.41%），花中最主要的揮發(fā)物為（+）-α-蒎烯（13.52%）、α-蒎烯（11.44%）、β-蒎 烯（10.52%）、（-）-β-蒎 烯（10.49%）、羅勒烯（10.22%）。不同學(xué)者對松科的多種植物進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)植物揮發(fā)物的種類及相對含量存在組織差異性，如徐偉等[20]研究表明，興安落葉松苗中樹皮的揮發(fā)物種類最多，針葉次之，整株的揮發(fā)物種類最少；李新崗等[21]研究表明，油松針葉中β-蒎烯和α-蒎烯相對含量比球果中的高2倍左右；吳楚材等[22]研究表明，馬尾松花中含量最高的揮發(fā)物是β-水芹烯，而葉和木材中含量最高的揮發(fā)物均為α-蒎烯；SJ?DIN等[23]研究表明，挪威云杉樹皮揮發(fā)物中萜烯類的含量是木材的10倍多。植物揮發(fā)物組織間的差異能被昆蟲感知和識別，從而作為寄主定向行為選擇的依據(jù)，精確地找到寄主植物[20]，昆蟲利用植物氣味定向?qū)ふ壹闹鞯牡湫屠邮邱R鈴薯甲蟲，即只要有馬鈴薯葉片氣味的存在，馬鈴薯甲蟲就會產(chǎn)生寄主定向行為[24]。

本研究中，華北落葉松莖、葉、花3個(gè)部位的揮發(fā)物種類及含量雖有差異，但其主要揮發(fā)物均是萜烯類物質(zhì)，共有的主要揮發(fā)性化合物為莰烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-松油烯、β-石竹烯等萜烯類物質(zhì)。對多種針葉樹如樟子松、油松、云南松、馬尾松、白皮松、華山松、紅松、落葉松、思茅松、雪松、濕地松等的研究[25-28]表明，針葉樹揮發(fā)物之間存在數(shù)量和種類上的差異，但主要成分為萜烯類物質(zhì)，與本研究的結(jié)果相符，這與萜烯類物質(zhì)是針葉樹主要的揮發(fā)性物質(zhì)組分這一觀點(diǎn)一致[29-30]。

不同研究人員對于落葉松揮發(fā)物的收集和鑒定已經(jīng)進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道，組成均以萜烯類為主，但揮發(fā)物具體類別差異較大。本研究采用固相微萃取收集華北落葉松莖、葉、花3個(gè)部位揮發(fā)物，鑒定結(jié)果主要有（E）-B-羅勒烯、檜烯、（+）-α-蒎烯、α-蒎烯、β-蒎烯、（-）-β-蒎烯、羅勒烯等；郭阿君等[31]采用預(yù)濃縮法收集落葉松枝葉揮發(fā)物，發(fā)現(xiàn)萜烯類物質(zhì)的種類隨季節(jié)變化比較明顯，主要揮發(fā)物有植紫三烯、（1S,3S）-（+）-間-薄荷-4，8-二烯、1，3-戊二烯、1R-α-蒎烯和（-）-β蒎烯等；徐偉等[20]采用預(yù)濃縮和固相微萃取2種方法對興安落葉松苗揮發(fā)物收集的研究表明，α-蒎烯、β-蒎烯、D-檸檬烯、4（10）-側(cè)柏烯、莰烯和β-水芹烯等萜烯類化合物所占比例較高，與本研究的結(jié)果差異較大，這可能是收集方法、提取方式、萃取條件、采集時(shí)期、植株生長發(fā)育情況及落葉松品種等差異引起的。

植物揮發(fā)物在害蟲防治應(yīng)用中歷史悠久，意義重大，影響深遠(yuǎn)。最初以天然植物引誘劑為主，近幾十年來，世界各地多采用套種誘殺技術(shù)，減少害蟲對作物的危害，例如，我國利用植物氣味引誘害蟲產(chǎn)卵的特點(diǎn)，在田間將玉米和棉花實(shí)施間作，引誘棉鈴蟲在玉米植株上產(chǎn)卵，隨后集中利用農(nóng)藥進(jìn)行防治，顯著十分效果。此外，植物揮發(fā)性物質(zhì)在害蟲防治中的應(yīng)用除了利用天然植物資源之外，大多數(shù)是將人工合成的植物引誘劑和殺蟲劑混合起來誘殺目標(biāo)害蟲，甚至有些形成了一套利用植物性引誘劑監(jiān)測害蟲發(fā)生的標(biāo)準(zhǔn)，為害蟲綠色防控提供理論基礎(chǔ)[32]。

本研究中，莰烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-松油烯、β-石竹烯在3個(gè)部位的含量都較高（均大于1%），因此推測這5種揮發(fā)性物質(zhì)是以華北落葉松為寄主植物的害蟲識別華北落葉松的活性物質(zhì)，但不足之處是未能對地上部分樹皮的揮發(fā)物進(jìn)行分析和鑒定。為了全面的了解華北落葉松揮發(fā)物的成分以便更準(zhǔn)確地篩選出對以華北落葉松為寄主植物的害蟲具有引誘的活性組分，今后可以嘗試對所有部位、不同季節(jié)、不同生理狀態(tài)下及采用不同的收集方法對華北落葉松的揮發(fā)物進(jìn)行采集和分析，并結(jié)合篩選出的寄主植物揮發(fā)物對華北落葉松害蟲進(jìn)行進(jìn)一步的觸角電位及行為反應(yīng)試驗(yàn)。