海洋來源羽毛降解菌株的篩選、鑒定及酶學性質研究

張紅巖，何 瑾，楊夢瑩，張 妮，王 芳，申乃坤

(廣西高校微生物與植物資源利用重點實驗室、廣西多糖材料與改性重點實驗室、廣西民族大學海洋與生物技術學院，廣西 南寧 530006)

近年來，我國家禽養殖產業得到迅猛發展，2019年我國禽肉產量達2 239萬t，位居世界第二[1]。羽毛為家禽屠宰副產物，可占家禽活體質量的5%～7%，我國羽毛年產量超過100萬t[2]。羽毛中粗蛋白(β-角蛋白為主)的含量可達干重的85%以上，而且組成蛋白質的氨基酸種類豐富，是潛在蛋白質及氨基酸原料來源[3-4]。但β-角蛋白結構中存在大量半胱氨酸，半胱氨酸可形成二硫鍵，再加上所含大量疏水側鏈，導致角蛋白結構比較穩定，且不溶于水，很難被動物源的蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶)降解，需要經過進一步處理后才能被應用。因此，目前羽毛通常被填埋或焚燒[5]，不僅造成蛋白資源的巨大浪費，而且環境污染嚴重，甚至傳播疾病[6-7]。通常采用高溫、高壓或強酸、強堿對羽毛進行處理，不僅能耗高、環境污染嚴重，且降解出的氨基酸會遭到破壞，造成營養流失[8]。而利用微生物或者所分泌的角蛋白酶進行處理，不僅羽毛降解效果好、反應條件溫和，且對氨基酸破壞較小，羽毛降解產物可應用于氨基酸肥料、動物飼料、生物醫藥等行業[9-11]。這不僅利用了廢棄蛋白資源，緩解目前蛋白資源緊張問題，而且對治理羽毛類固體廢棄物污染、保護環境具有積極意義。

已報道可降解羽毛的微生物有30多種，包括細菌、真菌、放線菌等[3,12]。但能夠分泌角蛋白酶的真菌常常具有致病性[13]，放線菌類生長緩慢[14]，而可降解羽毛的細菌尤其芽孢桿菌類菌株，具有產酶活性較高、羽毛降解效果好、工業應用安全等優點，成為目前研究的熱點之一[15-17]。盡管目前已篩選獲得了大量可降解羽毛的菌株，但存在分泌角蛋白酶活性較低、羽毛降解效果差、菌株穩定性較差等一系列問題，通常無法滿足工業化生產的要求。因此，迫切需要篩選降解羽毛效果好、角蛋白酶產量高的優良菌株。

目前挖掘新的陸生環境微生物資源越來越難，而海洋環境分布著大量待發掘的微生物資源；且海洋微生物的抗逆性更強、酶活性更高[18]。本研究從廣西欽州港海鴨養殖地土壤中分離得到1株可高效降解羽毛菌株，并對其進行分類鑒定、產酶條件優化和所產酶學性質研究，以期為廢棄羽毛資源的微生物降解提供海洋來源菌株和酶資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 采樣自廣西欽州港海鴨養殖基地淤泥，低溫(4 ℃)保存至實驗室進行菌株分離。

1.1.2 羽毛 收集自附近家禽市場。自來水洗凈，蒸餾水沖洗后烘干至衡重。較長羽毛剪成2 cm左右小段，備用。

在數碼時代的實際生活中，因為以馬賽克形式的超文本存在，加上賽博格化賦予其生命，照片能夠輕易地與其他媒介交互融合，社會性使用爆炸式拓寬了。里奇詳細列舉說：

1.1.3 試劑 酵母抽提物、蛋白胨購自Oxoid公司；PCR擴增、基因組提取及膠回收等試劑盒購自天根(北京)生物技術有限公司；酪蛋白、氯化鈉等藥品或試劑均為國產分析純。

轟轟烈烈的課改一直到現在都沒有停下腳步，而信息技術學科正因為本身內容的陳舊而逐漸地被整合，但無論是與其他課程的整合，還是重新確定新的內容從而煥發新的生命力，我們都需要一個正確的方向。國務院印發的《關于新一代人工智能發展規劃》正如一盞指明燈，指明了信息技術學科的發展方向，更明確了推廣程序教育作為新時代下的學生信息素養培養的核心內容。相信小學信息技術學科一定能在《規劃》的指引下重新煥發生命力，而在新時代、新目標培養下的新一代學生更能為我們國家的可持續發展提供持久的動力。

2.3.1 產角蛋白酶最適培養溫度及初始pH 由圖4(a)可知，培養溫度對Gxun-20產酶影響較大，酶活性隨培養溫度升高先增加后降低；34 ℃時，酶活性達到最大值238.47 U/mL；36 ℃時酶活性與34 ℃無顯著差異(p>0.05)；但進一步提高培養溫度(38 ℃)時，酶活性下降明顯(p<0.05)。故Gxun-20最適產酶溫度為34～36 ℃。由圖4(b)可知，發酵初始pH為5.5～6.5時，酶活性隨著pH增加而迅速上升；pH為6.5時，酶活性達到最大值258.33 U/mL；當pH大于6.5時，酶活性迅速下降。

②已知點A（m，-2），點B（3，m-1），且直線AB∥y軸，則 A（ ____ ，____）B（____ ，____ ），AB=____

1.2 方法

1.2.1 產角蛋白酶菌株篩選 ①富集：向90 mL的無菌水中加入土壤樣品10 g，充分混勻后取1 mL接入50 mL富集培養基中，30 ℃搖床振蕩培養2 d。②初篩：樣品富集培養液用無菌水進行10倍梯度稀釋，選取1×10-3、1×10-4、1×10-5稀釋濃度涂布于初篩培養基平板，30 ℃恒溫倒置培養48 h，挑選平板上透明圈較大的單菌落進一步純化后保存斜面備用。③復篩：將初篩獲得菌株接入種子培養基，轉速200 r/min，溫度30 ℃培養15 h，按照1% (體積分數)接種量加入發酵培養基，200 r/min、30 ℃發酵48 h后，測定角蛋白酶活性[4]，根據酶活性大小進行菌株復篩。

2.4.2 反應pH對酶活性的影響 由圖8(a)可知，酶活性隨反應pH增加先升高后降低，pH為7.5時，酶活性最大為278.67 U/mL。由圖8(b)可知，該酶在pH 6.0～9.0保溫1 h，酶活性維持在60%以上，表明該酶pH穩定性好。

1.2.3 角蛋白粗酶液制備及酶活性測定 ①粗酶液制備：發酵結束后離心取上清，添加(NH4)2SO4鹽析(飽和度至80%)，12 000 r/min離心10 min，收集沉淀，用蒸餾水溶解，透析后獲得粗酶液，置于4 ℃保存備用。②酶活性測定：參照文獻[17]的方法進行，取上述適當稀釋后粗酶液200 μL，加入300 μL質量濃度為20 g/L的酪蛋白溶液(pH 7．5)混勻，50 ℃水浴反應10 min，立即加入4 mol/L 三氯乙酸(TCA)溶液500 μL 終止反應，離心取上清液200 μL，依次加入1 mL 0.5 mol/L Na2CO3溶液和200 μL福林酚，50 ℃反應10 min。對照為先用TCA對酶滅活的酶液。反應結束后于波長660 nm 處檢測吸光值。酶活性單位(U)定義為：反應溫度為50 ℃條件下，每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需的酶量[21]。

1.2.4 產角蛋白酶培養基及培養條件優化 ①培養溫度：接種后置于溫度分別為30、32、34、36、38 ℃的搖床，轉速150 r/min，培養48 h后測定酶活性，確定產酶最適溫度。②發酵初始pH：分別調整培養基初始pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，根據酶活性確定菌株產酶最適pH。③羽毛含量：分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%(質量分數)羽毛，根據酶活性高低確定菌株產酶最適羽毛含量。

初步檢出文獻672篇，Note-Express軟件剔重后瀏覽文題和摘要獲得與本研究相關文獻49篇，閱讀全文，按照納入及排除標準嚴格篩查，最終獲得27篇文獻[1-27]，經質量評價，27篇文獻雖均未闡明研究的哲學基礎及研究者對研究的影響，但考慮其他方面評價較好，故將其全部納入研究。文獻篩選流程及結果見圖1，納入研究的基本特征見表1。納入研究的質量評價見表2。

1.2.5 角蛋白酶粗酶液的酶學性質 ①最適反應溫度。反應溫度設置為：20、30、40、50、60、70、80、90 ℃，測定反應溫度對酶活性影響，確定酶反應的最適反應溫度。②熱穩定性[22]：將粗酶液分別置于不同的溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)下保溫30 min后，測定殘余酶活性。對照組未進行溫度處理，活性設為100%。不同溫度處理后酶活與對照酶活性的百分比為相對酶活性，考察溫度對酶活性的影響。③最適pH值。在最適反應溫度下，配制不同pH緩沖液(6.0～9.0)、磷酸鹽緩沖液pH 6.0～7.5、Tris-HCl緩沖液pH 7.5～9.0。測定粗酶液在不同pH緩沖液中的酶活性，確定酶反應的最適pH。④酶的pH穩定性。將酶在最適反應溫度下，不同pH緩沖體系中保溫1 h，測定殘留酶活性，分析酶的pH穩定性。⑤金屬離子對酶活性影響。在酶反應體系中添加終濃度為5.0 mmol/L的金屬離子(Na+、Ca2+、K+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Co2+)，放置60 min(室溫)后測定殘余酶活性。以等體積無菌水處理的酶液為對照(酶活性定為100%)，不同金屬離子處理后酶活性與對照酶活性的百分比為相對酶活性，考察金屬離子對酶活性的影響。⑥化學試劑對酶活性影響[23]。粗酶液中分別加入終濃度為5 mmol/L的蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(pheny methyl sulfonyl fluoride,PMSF)、金屬螯合劑乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetra acetic acid,EDTA)、還原劑β-巰基乙醇、1%(體積分數)的表面活性劑十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、吐溫40 (Tween 40)、有機溶劑二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)，常溫下處理60 min，測定殘余酶活性。以等體積無菌水的處理酶液為對照(酶活性大小定為100%)，考察化學試劑對酶活性的影響。⑦酶底物特異性。添加相同含量的羽毛、可溶性角蛋白、I型膠原蛋白、酪蛋白、人發、牛血清蛋白，根據酶活性高低確定酶的底物特異性。

2 結果與討論

2.1 羽毛降解菌株的分離篩選

根據初篩平板上菌落水解圈直徑及菌落直徑的比值(R1/R2)大小，發酵復篩后排重，篩選獲得降解羽毛較好的菌株3株，菌株在初篩平板透明圈效果見圖1，羽毛降解效果及酶活性結果見表1。編號20的菌株生長速度快、降解羽毛效果好，角蛋白酶酶活性最高，達152.37 U/mL。因此，選用此菌株進行下一步研究，命名為Gxun-20。

圖1 3株菌的酪蛋白水解圈Fig.1 Hydrolysate circles produced by 3 strains against casein

表1 3株菌的復篩結果Tab.1 Rescreening result of 3 strains

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態學、生理生化特征 Gxun-20菌株在酪蛋白平板菌落顏色呈白色，表面干燥，不易挑取，邊緣鋸齒狀[圖2(a)]。菌體呈短桿狀，革蘭氏染色陽性(G+)，可產芽孢[圖2(b)]。生理生化性狀為：好氧；硝酸鹽還原、接觸酶、酪蛋白和明膠水解均呈陽性；而V-P(Voges-Proskauer)、淀粉水解呈陰性；可利用常見糖類如蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、甘露醇產酸，但無法利用木糖和阿拉伯糖為唯一碳源生長；生長pH范圍為5.5～9.0。

2.4.1 反應溫度對酶活性的影響 酶的反應溫度-酶活性關系如圖7(a)所示，溫度為20 ℃時，酶活性僅為45.64 U/mL；隨著反應溫度升高，酶活性逐漸增加，50 ℃時酶活性為254.49 U/mL，達到最大值；但當高于50 ℃時，酶活性迅速降低。這表明該酶最適反應溫度為50 ℃。熱穩定結果[圖7(b)]表明，當溫度為60 ℃時，處理30 min后，酶活性保持在70%以上；但80 ℃處理后酶活性僅存不到10%。因此，該角蛋白酶在溫度低于60 ℃時，具較好的熱穩定性。

圖2 Gxun-20菌株的菌落形態及革蘭氏染色結果Fig.2 Colony morphology and Gram stain of strain Gxun-20

2.2.2 16S rRNA基因序列及系統發育分析 菌株的16S rRNA基因序列測序后，提交至EzBioCloud數據庫進行相似性比對。結果顯示：Gxun-20與副短短芽孢桿菌BrevibacillusparabrevisNRRL NRS 605T親緣關系最近(99.82%)，在構建的系統發育樹中自然聚類(圖3)。根據菌株形態、生理生化及16S rRNA系統發育樹比對結果，命名其為(Brevibacillusparabrevis)Gxun-20，現保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(GDMCC 60686)。

圖3 菌株Gxun-20 16S rRNA基因序列系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain Gxun-20 based on 16S rRNA gene sequence注：“T”表示模式菌株；各分支點顯示的數字代表通過1 000次重復運算得到的bootstrap值；標尺表示核苷酸替換率。

2.3 菌株產角蛋白酶培養條件優化

1.1.5 儀器與設備 包括普通光學顯微鏡(奧林巴斯公司)、紫外可見光分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)、高速冷凍離心機[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]、振蕩培養箱(上海旻泉儀器有限公司)、PCR擴增儀(ABI公司)等。

圖4 發酵溫度及初始pH對菌株Gxun-20產角蛋白酶的影響Fig.4 Effects of fermentation temperature and initial pH on keratinase production of strain Gxun-20

2.3.2 羽毛含量對產角蛋白酶活性的影響 從圖5可知，當羽毛含量小于15 g/L時，酶活性隨含量增加而增加，15 g/L時酶活性最大為277.45 U/mL；當羽毛含量高于15 g/L時，酶活性隨羽毛含量的增加反而降低。

列車通過橋梁時，對橋梁產生的動力效應往往會大于其靜止作用在橋上所產生的靜力效應。這種增大效應通常以動力系數來表示，動力系數[11] 。

圖5 羽毛含量對菌株Gxun-20產角蛋白酶活性的影響Fig.5 Effect of feather content on keratinase production of strain Gxun-20

因此，菌株Gxun-20產酶的最適條件為：發酵溫度34 ℃，初始pH 6.5，羽毛含量15 g/L，接種發酵48 h可將羽毛幾乎完全降解(圖6)，羽毛降解率達90.13%。

1.1.4 培養基 富集培養基(g/L)：羽毛5.0，酵母粉5.0，K2HPO41.0，NaCl 2.0，MgSO40.1。初篩培養基(g/L)：酪蛋白30.0，MgSO40.1，NaCl 5.0，KH2PO40.7，K2HPO41.4，瓊脂20.0。種子培養基：LB培養基[3]。發酵培養基(g/L)：羽毛15.0，MgSO40.1，NaCl 5.0，KH2PO40.7，K2HPO41.4。培養基配制均用去離子水，初始pH為7.2。

圖6 菌株Gxun-20于34 ℃搖瓶發酵48 h對羽毛的降解效果Fig.6 Degradation of feathers by strain Gxun-20 in flask culture at 34℃ for 48 h(a)為降解前，(b)為降解后。

2.4 菌株Gxun-20產角蛋白酶粗酶液的酶學性質

通過壓力曲線（見表4）可以看出，前面擠注時，立壓與套壓壓差較大，通過間歇擠注承壓，壓差逐漸變小，地層承壓能力逐漸提升，最后承壓到立壓2.5MPa，套壓2.5MPa，穩壓1.5h不降,折合垂深2070m當量密度達 1.92g·cm-3，在全井密度 1.52g·cm-3的基礎上提高了當量密度0.4g·cm-3。

圖7 溫度對酶活性及熱穩定性的影響Fig.7 Effects of temperature on activity and thermostablity of keratinase

1.2.2 菌株鑒定方法 ①形態學及生理生化鑒定：參考《常見細菌系統鑒定手冊》[19]。②分子鑒定：用通用引物27F和1492R對菌株16S rRNA基因進行PCR擴增、測序[20]，測序結果提交至GenBank進行比對，再采用Neighbor-Joining法構建系統進化樹[11]。

圖8 反應pH對角蛋白酶活性及穩定性的影響Fig.8 Effects of pH on activity and stability of keratinase

2.4.3 金屬離子對酶活性的影響 由表2可知：K+、Sr2+和Mg2+對酶活性影響較小；Na+和Ca2+對酶活性有明顯促進作用，相對酶活性分別達135.99%和118.20%；Fe3+、Cu2+、Co2+、Fe2+和Mn2+對酶活性有顯著抑制作用。

表2 金屬離子對角蛋白酶活性的影響Tab.2 Effects of metal ions on keratinase activity

2.4.4 化學試劑及底物對酶活性的影響 從圖9(a)可知：化學試劑對酶活性影響較大，PMSF可完全抑制酶活性，說明酶的活性中心含有絲氨酸；EDTA對酶活性抑制作用同樣明顯，說明酶的活性中心可能含有某些金屬離子；酶在DMSO、SDS、吐溫40溶液中保持穩定。底物特異性結果[圖9(b)]表明，該酶的底物特異性較強，對羽毛、角蛋白和酪蛋白的降解作用最為明顯；對人發和I型膠原蛋白的降解能力較差。

圖9 化學試劑及底物對角蛋白酶活性的影響Fig.9 Effects of different chemicals and substrates on keratinase activityEDTA為乙二胺四乙酸，PMSF為苯甲基磺酰氟，SDS為十二烷基硫酸鈉，IPA為異丙醇，DMSO為二甲基亞砜。

2.5 討論

與陸生環境微生物相比，海洋微生物由于適應了高鹽、高壓、低溫、缺氧等環境，往往具有更高的生物學活性、更強的抗逆性[17]。本研究從廣西北部灣海洋環境篩選出的1株可高效降解羽毛的副短短芽孢桿菌，其生理生化特性基本符合《常見細菌系統鑒定手冊》[19]對于該種菌株的描述，但與模式菌株不同的是該菌株可以在2%NaCl溶液中正常生長，可能是該菌株篩選自海洋環境，進化過程中適應了高鹽度海洋環境所致。目前，已報道的降解羽毛的菌株多數篩選自陸源環境，源自海洋的羽毛降解菌株較少。

目前，根據文獻報道，多數芽孢桿菌類菌株最適產酶溫度為30～37 ℃，最適初始pH為5.5～7.0[6-7]。這與本研究結果類似，說明中性偏酸的環境對菌株產酶有利，可能與弱酸性條件有利于羽毛空間結構的破壞以及微生物的生長和酶的誘導[15]有關。但多數文獻報道菌株產酶的最適羽毛含量為1.0%，而菌株Gxun-20產酶最適羽毛含量為1.5%，說明菌株Gxun-20更能適應較高底物含量，具有更強的降解能力，但當底物含量進一步升高時，酶活性反而下降，原因可能是羽毛含量過高會影響料液比，使發酵液變得粘稠影響了溶氧，從而不利于菌體生長和產酶[22]。條件優化后，菌株Gxun-20經過48 h發酵，可將整根羽毛幾乎完全降解，降解率可達90.13%，酶活性可達277.45 U/mL。遠高于Streptomycessp.DJ(發酵10 d，降解率為50%)[5]、BacillussubtilisBS8(發酵48 h，酶活性為23.6 U/mL)[11]、BacilluslicheniformisRPk(酶活性為50 U/mL)[24]等菌株的降解能力，說明該菌株在降解羽毛類角蛋白資源方面具有良好的應用潛力。

調整因素作用影響監控能力的關鍵因素之一主要建立在反思因素基礎之上，只有學生進行了相應的反思，從而對學習策略學習方法進行及時的調整.

菌株Gxun-20所產角蛋白酶的最適反應溫度為55 ℃，與B.amyloliquefaciens[24]和B.subtilis[25]所產角蛋白酶最適溫度相同，但低于文獻報道Bacilluscereus所產角蛋白酶的最適溫度60 ℃[26]。酶的熱穩定性較好，60 ℃處理30 min，相對酶活性保持在70%以上，優于文獻報道的60 ℃處理30 min后角蛋白相對酶活性低于50%[3,15]；但當處理溫度為80 ℃時，酶活性基本喪失，可能是由于高溫破壞了維持蛋白質空間結構的化學鍵，進而破壞了酶的活性中心[27]。該酶在pH 6.0～9.0時穩定性好，最適反應pH為7.5，與B.amyloliquefaciens(pH 8.0)[24]、B.subtilus(pH 7.5)[25]和B.cereus(pH 8.0)[26]所產的酶類似。pH過高或過低時，酶活性迅速下降，可能是過高或過低的pH會破壞酶的結構和穩定性，或者影響了酶與底物結合，進而影響了酶的活性[9]，pH的具體影響機制有待進一步研究。金屬離子對酶活性影響較大，其中Ca2+或Na+對酶活性有激活作用，原因可能是由于酶分子中氨基酸側鏈的O2-與Ca2+或Na+可形成穩定的共價鍵，增強了酶活性中心的的穩定性；或“底物-角蛋白酶”形成的復合體由于Ca2+或Na+存在穩定性得到進一步加強，從而使酶的活性升高[17,28]；而Fe3+、Cu2+、Co2+、Fe2+和Mn2+對酶活性有顯著抑制作用，可能是因為此類金屬離子可與酶蛋白氨基酸分子中的-SH基結合，從而影響酶分子二硫鍵的形成，使酶的結構發生改變，進而導致酶分子失活或變性[29]。化學試劑中EDTA對酶活性有強烈抑制作用，說明酶的活性中心可能含有某些金屬離子[30]，與之前Ca2+、Na+可顯著促進酶活性結果一致；PMSF可完全抑制酶的活性，可說明該酶可能為含有金屬離子的絲氨酸蛋白酶類，與文獻報道常見角蛋白酶的活性結構類似[9]。但異丙醇對該酶活有激活作用，這與文獻報道異丙醇對角蛋白酶有強烈抑制作用[16-17]不同，具體機制有待進一步研究。該酶無法降解人發和I型膠原蛋白，這與B.licheniformis、B.subtilus所產角蛋白酶可降解膠原蛋白的結果不同[31]，說明該酶在研發不傷皮膚的洗滌及化妝品等方面具有良好的應用前景。

3 結論

本研究從廣西北部灣海鴨養殖淤泥篩選獲得1株高效降解廢棄羽毛的菌株，鑒定為副短短芽孢桿菌(Brevibacillusparabrevis)Gxun-20。菌株最適產酶條件為：發酵溫度34 ℃，初始pH 6.5，羽毛含量1.5%，在此條件下發酵48 h，角蛋白酶活性可達277.45 U/mL。所產角蛋白酶粗酶性質為：最適反應溫度50 ℃，最適pH 7.5；低于60 ℃酶活性保持穩定，Ca2+、Na+對酶活性有激活作用，而Fe3+、Cu2+、Co2+、Fe2+和Mn2+對酶活性有顯著抑制作用；金屬螯合劑EDTA和蛋白酶抑制劑PMSF可顯著抑制酶活性；有機溶劑異丙醇對酶活性有激活作用，相對酶活性達129.34%；酶的底物特異性較強，對羽毛類β-角蛋白及酪蛋白降解能力較強，而對牛血清蛋白、I型膠原及人發類α-角蛋白降解能力較弱。因此，海洋來源的副短短芽孢桿菌Gxun-20及其所產角蛋白酶在廢棄羽毛降解方面具有良好的應用前景。