低鹽脅迫對大黃魚非特異性免疫酶活力的影響

何亮銀，史曉麗，周逢芳，陳美霞，韓坤煌

(寧德師范學院，福建 寧德 352100)

與高等脊椎動物相比，魚類的特異性免疫發育不完全，比較依賴非特異性免疫防御系統抵御病害、維持機體健康，抗氧化酶、磷酸酶及溶菌酶(lysozyme,LZM)等屬于非特異性免疫指標，其活力變化可一定程度上反映魚體對外界環境脅迫的適應能力[1-2]。作為水生生物重要的環境因子，鹽度能顯著影響魚類的存活、生長、代謝及非特異性免疫[3-7]。研究發現，養殖水體鹽度變化會誘發魚體應激反應，導致魚體耗氧增加、代謝加速、能量消耗增多[8]。此外，鹽度變化還會造成魚體氧化損傷，降低魚體的免疫能力[9]，長期處于低鹽度或高鹽度脅迫下的養殖魚類，更容易受到病原侵襲，引起魚體疾病，甚至死亡[10-11]。

抗氧化系統能有效防止活性氧損傷，而由超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和過氧化氫酶(catalase,CAT)等組成酶促系統在其中發揮了重要作用[10]。SOD主要通過歧化作用分解超氧陰離子自由基(·O-2)，在清除活性氧過程中最早發揮作用，清除·O-2的過程中會產生H2O2。CAT通過將H2O2分解為H2O，使細胞免于H2O2的毒害，保障機體的各項生理機能[12]。因此，許多研究將SOD和CAT作為研究魚類受鹽度脅迫下抗氧化的重要指標[10-11,13-15]。磷酸酶是生物體內解毒系統的重要組成部分，根據其催化時的最適pH值可分為堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)[16]。ALP是溶酶體的標志酶，主要通過催化磷酸單酯的水解參與磷酸酯的代謝，能在宿主通過溶酶體降解入侵病原過程中發揮作用。ACP是吞噬溶酶體的重要組分，在酸性環境下，ACP可水解含磷酸酯的異物，在免疫反應中發揮作用[17]。LZM能水解革蘭氏陽性細菌的細胞壁肽聚糖，并與防御素、抗菌肽及乳鐵蛋白等協同作用溶解革蘭氏陰性細菌的細胞壁脂多糖，還能破壞真菌、寄生蟲以及病毒等[18]，是研究魚類受鹽度脅迫后免疫反應的重要指標[19]。

大黃魚(Larimichthyscrocea)是我國重要的海水經濟魚類，據統計，2019年大黃魚養殖的產量為225 549 t，已連續多年位居我國海水養殖魚類之首[20]。大黃魚多養殖于東南沿海海域，適宜生存鹽度為20～34，養殖水體的鹽度易受臺風引起的暴雨及地表徑流等的影響而驟降，導致大黃魚應激反應強烈，滲透壓紊亂和機體免疫力下降，引起死亡[21]。此外，為擴展大黃魚養殖區域，最大化利用內陸及河口豐富的咸淡水資源，已有不少研究人員開始嘗試大黃魚的低鹽養殖[21-22]。本研究通過對大黃魚進行急性、慢性低鹽脅迫處理后的肝臟抗氧化酶活力及血清磷酸酶活力和溶菌酶活力的變化分析，探究鹽度驟降及低鹽養殖對大黃魚非特異性免疫的影響，以期為大黃魚的健康養殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚與養殖條件

實驗用健康大黃魚購自寧德富發水產有限公司，初始平均體長為(15.6±1.5)cm，平均體質量為(46.4±3.7)g，運抵實驗場所后暫養一周，持續充氧，水溫為(16.0±1.5)℃，海水鹽度為23，早晚投喂商品餌料，每天使用相同鹽度海水換水1/3左右，吸去殘餌和污物。本研究實驗于2020年3月開始，4月結束。

1.2 實驗設計與管理

實驗用魚養殖于約350 dm3的圓形塑料桶。設置急性低鹽脅迫組、慢性低鹽脅迫組及正常鹽度海水養殖3個實驗大組，其中急性低鹽脅迫又設置鹽度為15和8兩個小組，慢性低鹽脅迫組僅設置鹽度為8組，正常海水鹽度組為對照組，鹽度為23。每個實驗組設置3個平行，共12組，每個平行15尾。將自來水曝氣至少48 h以后用于鹽度調整，對于急性脅迫組，隨機將暫養穩定后群體直接放入目標鹽度組(含對照組)中，從實驗魚放入各鹽度組水體作為起始0 h，分別在1、3、7 d各鹽度組中取樣，每平行每次取兩尾；對于慢性低鹽脅迫組，實驗用魚放入水體后開始調節鹽度，按每天降低2將自然海水鹽度從23降至15，繼續按每天降低1將鹽度從15降至8。逐步調節到設定鹽度后，在該鹽度條件下養殖14 d后取樣。

1.3 樣品采集與酶活力測定

取樣前停止投喂飼料1次，將大黃魚轉移至含MS-222的對應鹽度海水中(濃度為50 mg/dm3)約30 s麻醉后，用一次性1 cm3注射器尾靜脈采血，采集的靜脈血于4 ℃靜置過夜后，次日3 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液凍存于-20 ℃，用于溶菌酶及磷酸酶活力測定；采血后于冰盤上解剖魚體，取出肝臟用預冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)沖洗3遍并用濾紙吸干水分后，置于離心管中-20 ℃保存，用于抗氧化酶活力測定。因魚體較小，每次每個平行取樣兩尾，實驗將同一平行兩尾魚的血液和肝臟合為一個樣本。

對于肝臟組織中SOD和CAT的酶活力測定，準確稱取組織質量，按質量(g)∶體積(cm3)=1∶9的比例加入9倍體積的預冷生理鹽水，冰浴條件下勻漿，制備成10%的組織勻漿液，2 500 r/min離心10 min后取上清，使用南京建成試劑盒進行酶活力測定。其中，定義反應體系中SOD抑制率達50%時所對應的酶量為一個SOD活力單位(U)；定義每毫克組織蛋白每秒分解1 μmol的H2O2的量為1個CAT活力單位(U)。

使用南京建成試劑盒直接對血清中ACP和ALP的酶活力進行測定。定義100 cm3血清在37 ℃與基質(磷酸苯二鈉，disodium phenyl phosphate hydrate)作用30 min產生1 mg酚為1個ACP金氏單位(1金氏單位 =7.14 U/dm3)；定義100 cm3血清在37 ℃與基質(磷酸苯二鈉)作用15 min產生1 mg酚為1個ALP金氏單位。采用空白對照法對血清中LZM進行測定，以530 nm處雙蒸水調透光度為100%，測定各樣品反應管的透光度。

1.4 數據統計與分析

實驗數據采用平均值±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差(ANOVA)及Duncan多重比較分析，以p<0.05作為差異顯著標準。以Origin 8.0軟件繪制柱狀圖。

2 結果與討論

2.1 低鹽脅迫下大黃魚的活動能力及存活狀況

實驗過程中，所有組別大黃魚均未出現死亡情況，表明大黃魚具有較好的鹽度調節和適應能力。對于急性低鹽脅迫組，脅迫初始階段魚體活動頻繁，體表黏液增多，攝食能力明顯減弱，但在較短時間內恢復正常；慢性低鹽脅迫組的大黃魚活動及攝食能力未見明顯變化。

2.2 急性低鹽脅迫對大黃魚非特異性免疫酶活力的影響

2.2.1 抗氧化酶 從圖1可以看出，急性低鹽脅迫下，大黃魚肝臟組織的SOD活力呈先上升后下降的趨勢。鹽度為15的脅迫組，SOD活力在第1天開始顯著上升(p<0.05)后逐漸下降，至第7天時顯著低于對照組水平。鹽度為8的脅迫組的SOD活力變化趨勢與鹽度為15的脅迫組相似，也在第1天時顯著上升(p<0.05)，然后開始下降，在第3天和7天時，SOD值均顯著低于對照組。對于同一時間點的不同鹽度脅迫組，脅迫鹽度越低，造成的SOD活力值波動越大，即上升或下降的幅度也越大，且同一時間點的兩個組別間差異顯著(p<0.05)，而對照組SOD活力在整個實驗周期內未見顯著變化。

圖1 不同鹽度急性脅迫下大黃魚肝臟SOD活力Fig.1 Acute effects of different low salinity stresses on SOD activity in the liver of croaker不同字母代表有顯著性差異(p<0.05)，相同則無顯著差異，下同。

從圖2可以看出，急性低鹽脅迫下，大黃魚肝臟組織的CAT活力整體呈先下降后上升再下降的趨勢。脅迫鹽度為15時，CAT活力在第1天就大幅下降至對照組近一半水平(p<0.05)，至第3天時開始提升至對照組水平，而后開始下降，至第7天時CAT活力顯著低于對照組。鹽度為8的脅迫組的CAT活力變化趨勢與鹽度為15組相似，也在第1天顯著下降后開始升高，第3天后開始下降，至第7天時CAT活力顯著低于對照組水平(p<0.05)。對于同一時間點的不同鹽度脅迫組，CAT活力值也存在顯著性差異(p<0.05)，而對照組CAT活力在整個實驗周期內保持相對穩定。

圖2 不同鹽度急性脅迫下大黃魚肝臟CAT活力Fig.2 Acute effects of different low salinity stresses on CAT activity in the liver of croaker

2.2.2 磷酸酶 從圖3可以看出，急性低鹽脅迫下，大黃魚血清ACP活力呈下降后逐漸升高的趨勢。脅迫鹽度為15時，血清ACP活力在第1天時顯著下降(p<0.05)，然后逐步升高，至第7天時雖仍低于對照組水平，但沒有顯著性差異(p>0.05)。脅迫鹽度為8時，血清ACP活力變化趨勢與鹽度為15的脅迫組相近，第1天時下降至對照組近1/3水平后逐步升高，至第7天時仍顯著低于對照組(p<0.05)。對于同一時間點的不同鹽度脅迫組，ACP活力值也存在顯著性差異(p<0.05)，且鹽度為8的脅迫組ACP活力值變化幅度要大于鹽度為15的脅迫組。

圖3 不同鹽度急性脅迫下大黃魚血清ACP活力Fig.3 Acute effects of different low salinity stresses on ACP activity in the serum of croaker

從圖4可以看出，急性低鹽脅迫下，大黃魚血清ALP活力呈先逐漸升高后下降的趨勢。鹽度為15的低鹽脅迫組的ALP活力在實驗開始的第1天到第3天逐漸升高，且均高于對照組(p<0.05)，至第7天時開始下降至對照組水平。鹽度為8的低鹽脅迫組的血清ALP活力也在實驗初期逐漸升高，ALP活力值在第3天時約為對照組的1.8倍，第7天雖開始下降，但仍顯著高于對照組(p<0.05)。對于同一時間點的兩個不同鹽度組，血清ALP活力值也存在顯著性差異(p<0.05)。

圖4 不同鹽度急性脅迫下大黃魚血清ALP活力Fig.4 Acute effects of different low salinity stresses on ALP activity in the serum of croaker

2.2.3 溶菌酶 從圖5可以看出，急性低鹽脅迫下，大黃魚血清LZM含量呈波動變化，整體呈先上升后下降的趨勢，但數值變化不大。脅迫鹽度為15時，血清LZM含量在第1天時先小幅上升(p<0.05)，后持續下降，至第3天時與對照組差異不顯著，第7天的LZM含量雖顯著低于對照組，但也僅下降約10%。脅迫鹽度為8時，血清LZM的變化幅度明顯大于鹽度為15的組，每個時間點的LZM含量均與對照組有顯著性差異(p<0.05)。

圖5 不同鹽度急性脅迫下大黃魚血清LZM含量Fig.5 Acute effects of different low salinity stresses on LZM content in the serum of croaker

2.3 慢性低鹽脅迫對大黃魚非特異性免疫酶活力的影響

大黃魚在鹽度為8的慢性低鹽環境下養殖14 d后，肝臟的抗氧化酶活力及血清磷酸酶和溶菌酶活力均出現小幅波動，但與對照組相比所有指標均不存在顯著性差異(p>0.05)。抗氧化酶活力方面，肝臟SOD和CAT活力均有小幅下降[圖6(a)、(b)]；血清ACP活力也有一定的降低[圖7(a)]，而ALP活力則有小幅提升[圖7(b)]；血清LZM含量有略微下降，實驗周期內對照組所有檢測指標均未出現顯著變化(圖8)。

圖6 慢性低鹽脅迫下大黃魚肝臟抗氧化酶活力Fig.6 Chronic effects of low salinity stresses on antioxidant enzyme activity in the liver of croaker

圖7 慢性低鹽脅迫下大黃魚血清磷酸酶活力Fig.7 Chronic effects of low salinity stresses on phosphate enzyme activity in the serum of croaker

圖8 慢性低鹽脅迫下大黃魚血清溶菌酶含量Fig.8 Chronic effects of low salinity stresses on LZM content in the serum of croaker

2.4 討論

2.4.1 鹽度脅迫對大黃魚活力及其存活狀況的影響 養殖水體的鹽度對魚體的生長及存活有顯著影響[23-25]。大黃魚為集群洄游性魚類，其適鹽范圍比較廣，李兵等(2012)的研究發現大黃魚30日齡幼魚對海水鹽度的適應范圍為5.5～41.0，具有較強的耐鹽性[26]。本研究中大黃魚在鹽度為15及8的急性低鹽脅迫下，初始階段出現活動頻繁、攝食減弱及黏液增多等現象，這與王濤等(2013)的實驗結果[27]相似；不同的是，本研究中所有組別的大黃魚均未出現死亡，這可能與魚體大小及實驗周期長短有關。在鹽度為8的慢性低鹽脅迫下，大黃魚可長期存活，且存活及攝食狀況未受明顯影響。因實驗周期較短，本研究未測定不同處理組間大黃魚的具體生長指標，不同鹽度差異及脅迫方式對大黃魚生長的影響還有待進一步研究。

2.4.2 急性低鹽脅迫對大黃魚非特異性免疫酶活力的影響 鹽度驟變會導致魚類代謝紊亂及氧化壓力增加[28]。肝臟是魚體內物質代謝以及進行氧化反應的最主要組織，其抗氧化酶活力能指示機體的抗氧化特征。SOD 和CAT 是清除活性氧自由基的重要酶蛋白，對機體細胞損傷后的氧化過程和吞噬作用具有很強的防御功能。在低鹽脅迫下，多鱗四指馬鲅(Eleutheronemarhadinum)肝臟的SOD活性呈先上升后逐步下降的趨勢[29]；銀鯧(Pampusargenteus)肝臟SOD 活力在脅迫初期顯著增強，隨后恢復，CAT 活力則呈波動上升變化[30]；黃姑魚(Nibeaalbiflora)肝臟的SOD活力呈先上升后下降變化，CAT活力則呈先減弱后增強而后再減弱的變化趨勢[15]。本研究中大黃魚肝臟抗氧化酶活力的整體變化趨勢與上述研究結果相似，表現為整體先上升后下降，表明大黃魚機體在鹽度驟降時會提高抗氧化酶活力來應對氧化壓力，與SOD活力變化不同的是，CAT活力會在脅迫初始階段出現降低，這可能與二者產生過程及作用方式相關[12]。

磷酸酶是生物體內重要的解毒體系組成部分，它們能通過調節蛋白的去磷酸化，在一些營養物質的消化、吸收、轉運過程中起著重要作用[16]。王海亮等(2016)研究了不同低鹽濃度急性脅迫下花鱸(Lateolabraxmaculatus)的ACP活力變化，其在脅迫初期有下降趨勢，而隨著時間延長，ACP活力又逐漸回升至正常水平[11]；張龍崗等(2011)對澳洲寶石鱸(Scortumbarcoo)的ACP活力在低鹽脅迫下的動態變化研究也顯示低鹽度下ACP活性受到抑制，且鹽度越低抑制作用越明顯[17]。本研究中大黃魚的ACP活性在低鹽脅迫下呈先下降后逐漸升高的趨勢，且鹽度為8的脅迫組ACP活力值變化幅度要大于鹽度為15的脅迫組，這與上述研究的實驗結果相似，可能是由于實驗初期鹽度驟降抑制了ACP活力，隨著魚體對低鹽環境的適應，ACP活力逐漸回升至正常水平，也可能與金屬離子對ACP活力的激活有關[31]。王躍斌等(2015)探究了日本黃姑魚(N.japonica)ALP活力在低鹽脅迫下的變化特點，發現鹽度為6及18組中的日本黃姑魚腎臟ALP活力顯著高于鹽度為24組[1]，而張龍崗等對澳洲寶石鱸的ALP活力在低鹽脅迫下的動態變化研究也顯示低鹽度脅迫會顯著提高ALP活力，鹽度為5的實驗組ALP活力極顯著地高于其他高鹽度組(p<0.01)[17]。本研究中大黃魚ALP活力在低鹽脅迫下呈先逐漸升高后下降的趨勢，這與上述研究者的結果類似，但也有研究表明，低鹽脅迫會降低魚體ALP活性，如房子恒等(2014)發現半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)肌肉和腎臟中ALP活力隨實驗鹽度的升高而逐漸升高，其中肌肉組織中ALP活力在鹽度為20和30時顯著高于淡水處理[2]，這可能與不同魚種對鹽度的適應能力不一樣或者實驗方法不同有一定的關系，具體情況還需進一步研究。

LZM在魚體的黏液、血清和某些淋巴組織中廣泛分布，是魚類非特異性免疫系統的重要組成部分，其活力越強，溶菌能力也就越高[19]。鹽度脅迫能影響魚類的LZM含量，王曉杰等(2005)對許氏平鮋(Sebastesschlegeli)在鹽度為5和10急性低鹽脅迫下的LZM含量進行了測定，結果顯示魚體LZM含量在脅迫24 h達到峰值，之后逐漸下降[32]；對其他海水魚類，如牙鲆(Paralichthysolivaceus)[33]、軍曹魚(Rachycentroncanadum)[34]及黃姑魚[35]等在低鹽脅迫下LZM含量研究也顯示出類似變化規律。本研究中大黃魚血清LZM含量呈先上升后下降的趨勢，但數值變化不大，這與上述研究結果相近，脅迫初期，大黃魚LZM含量增加以應答外源壓力，屬自身應激保護反應，隨著脅迫時間延長，魚體內多種生理功能發生紊亂，降低了自身的免疫力，導致LZM含量下降?？梢?，LZM在大黃魚非特異性免疫中發揮著重要作用。

2.4.3 慢性低鹽脅迫對大黃魚非特異性免疫酶活力的影響 本研究對鹽度為8慢性低鹽脅迫下14 d后大黃魚的各項非特異性免疫酶活力進行了測定，結果顯示包括SOD和CAT的抗氧化酶活力、包括ACP和ALP的磷酸酶活力及LZM含量均在養殖14 d后無顯著性差異，這與王躍斌等[1]的日本黃姑魚研究結果相似，日本黃姑魚在不同鹽度(0、6、12、18、24及30)下養殖30 d后，僅鹽度為24的脅迫組日本黃姑魚腎臟ALP活力顯著低于鹽度為6和18的脅迫組(p<0.05)，其他各組織中SOD、CAT、ALP 和ACP 活力在不同鹽度下均未發現有顯著差異[1]。表明大黃魚與日本黃姑魚類似，對低鹽度有較高的耐受能力，具備低鹽養殖的實踐基礎。

3 結論

魚體非特異性免疫酶活力的變化可以一定程度上反映魚體對不同環境脅迫的適應能力。急性低鹽脅迫能顯著影響大黃魚肝臟的抗氧化功能、血清中的磷酸酶活力及溶菌酶含量，大黃魚雖然對低鹽度有較強的適應能力，但鹽度驟降會引起魚類的應激反應，消耗魚體儲備，還能影響魚體非特異性免疫酶活力，導致免疫能力下降，實際生產中應避免養殖環境鹽度的劇烈變化。另外，與正常鹽度養殖下的大黃魚相比，慢性低鹽養殖下魚體的各項非特異性免疫酶活力均未出現顯著性差異，研究結果將為在河口入海地區及沿海圍墾低鹽度水域的大黃魚養殖提供理論依據。