蛋白酶輔助法腐乳發酵工藝優化和理化性質分析

盛宇華，李靜，林萌慧，呂雨婷，魯清峰，蔡成崗， 朱瑞瑜，孫蓉，蔡海鶯*

1(浙江科技學院 生物與化學工程學院，浙江 杭州，310023)2(浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室， 浙江 杭州，310023)3(浙江省農業生物資源生化制造協同創新中心，浙江 杭州，310023)

腐乳是我國具有民族特色的傳統大豆發酵制品，因其味道鮮美，具有抗氧化和降血壓等保健功能，深受消費者歡迎[1-3]。腐乳的發酵過程分為前發酵和后發酵[4]，其中主要發生了生物化學和物理化學變化[5]。腐乳的前發酵是培養菌系和積累酶系的過程，一般為36～48 h；后發酵是酶系作用于腐乳毛坯的過程，其毛坯中毛霉分泌蛋白酶降解大豆蛋白，從而破壞凝膠結構使其質地軟化并產生大量游離氨基酸等。該過程需要較長的后熟時間，一般為3～6個月，因此制約了其在我國的工業化生產[6-7]。

近年來，針對縮短腐乳生產周期的研究較多。其中，在后發酵階段直接加入外源蛋白酶是一種較便捷的方法。此外，腐乳后發酵溫度也在很大程度上影響腐乳的發酵周期，而如今對酶法輔助腐乳發酵中溫度影響的研究較少。本研究通過控制酶促腐乳后發酵的溫度，對腐乳發酵過程中理化性質變化進行研究，了解溫度對蛋白酶輔助腐乳發酵的影響，旨在為優化酶促腐乳工藝提供一定的理論和應用依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鹽鹵型豆腐、食鹽、白酒(均為食品級)，市售；雅致放射性毛霉菌粉，安琪酵母股份有限公司；中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶(活性單位：1×105U，均為食品級)，滄州夏盛酶生物技術有限公司；冰乙酸、無水乙酸鈉、乙酰丙酮、硫酸銨、37%甲醛，阿拉丁工業公司。

恒溫培養箱，上海慧泰儀器制造有限公司；冷凍干燥機，美國Labconco公司；糖度儀，ATAGO(愛拓)中國分公司；酶標儀，美谷分子儀器(上海)有限公司；高速離心機，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；組織研磨儀，上海凈信科技。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶促腐乳的生物釀制

將鹽鹵型老豆腐切成約2 cm×2.5 cm×2.5 cm的小塊，噴灑雅致放射毛霉菌懸液至終濃度約為1×107CFU/mL，在25 ℃下前發酵3 d后搓毛；毛坯稱重后，按質量比加入10%的食鹽腌制22 h，制得咸坯；咸坯稱重后，均勻分成11份，根據表1加入不同外源蛋白酶處理并裝瓶，其總添加量為腐乳總蛋白的4%(質量分數)；最后加入10%食用乙醇至完全浸泡咸坯后加蓋密封，分別在20、30、37、50 ℃下后發酵20 d[8]。

表1 添加外源蛋白酶樣品分組Table 1 Grouping of samples with exogenous protease

1.2.2 腐乳的樣品采集及預處理

樣品采集：每個酶促腐乳樣品的前發酵全部天數以及后發酵1、2、3、5、10、20 d中取樣用于理化特性分析。

預處理：將腐乳在無菌條件下進行取樣，于-18 ℃冰箱保存待用；取固體樣品于-80 ℃超低溫冰箱中冷凍24 h，于真空冷凍干燥機中干燥24 h，將干燥好的樣品碾碎過40目篩，進行稱重、研磨、離心并取上清液為液體樣品于4 ℃冰箱保存，現配現用[9-10]。

1.2.3 腐乳的pH值和可溶性固形物含量測定

pH計測定腐乳樣品pH值，并使用ATAGO數顯糖度儀測定液體樣品的可溶性固形物含量。

1.2.4 腐乳的氨基態氮含量測定

精密吸取氨氮標準使用溶液0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于10 mL管中，向各管分別加入4 mL乙酸鈉-乙酸緩沖溶液及4 mL顯色劑，用水稀釋至刻度并混勻。置于100 ℃水浴中加熱15 min，取出后水浴冷卻至室溫并于400 nm處測量吸光度，以氨氮含量(μg)為橫坐標，OD400為縱坐標繪制標準曲線。取樣品稀釋液于相同操作測量吸光度，從而計算樣品含量[11]，計算如公式(1)所示：

(1)

式中：X，氨基酸態氮含量，mg/g；m，氮的質量，μg；V，吸取試樣的體積，mL；V1，測定用試樣的體積，mL；V2，試樣前處理中的定容體積，mL；0.01，樣品含量，mL/mg；100，單位換算系數。

1.2.5 統計分析方法

所有試樣測定3個平行樣品，并采用Excel 2010和Origin 8.6軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 不同溫度發酵過程中腐乳樣品氨基態氮變化

不同發酵工藝的腐乳產品品質差異較大。其中，氨基態氮與游離氨基酸含量成正比關系，是腐乳成熟的重要指標[12-15]。本研究通過控制不同后發酵溫度，分析其對酶促腐乳氨基態氮含量的影響。圖1～圖4結果顯示，在發酵的整個過程中，腐乳的氨基態氮含量先上升后趨于穩定。根據國內貿易行業標準SB/T 10170—2007《腐乳》的規定[11],白腐乳的氨基態氮含量不小于0.35%，其中各組腐乳后發酵20 d均符合該標準。前發酵階段，毛霉生長旺盛且產生大量蛋白酶，導致氨基態氮含量激增[12]；后發酵初期，由于鹽分的滲透和水分的析出以及對測定方法的影響，鹽坯中氨基態氮含量呈急劇下降；后發酵3～10 d時，坯體中氨基態氮含量整體呈上升趨勢，主要歸因于前發酵時毛霉產生的蛋白酶繼續分解蛋白質成多肽，導致氨基態氮含量持續增加；在后發酵10～20 d時，由于水解產物的累積、鹽抑制使蛋白酶活力下降，蛋白質酶解作用減弱，氨基態氮含量基本處于波動平穩狀態[16]。

2.1.1 20 ℃后發酵溫度腐乳樣品的氨基態氮變化

控制后發酵溫度為20 ℃屬于低溫發酵，低溫發酵有助于控制生物安全性以及腐乳的酸敗，減少對后發酵階段高鹽條件的依賴[17]，但同時會降低發酵過程中的產酶水平和酶活性，延長腐乳成熟周期從而不利于其生產效率。圖1顯示，對照組樣品的氨基態氮含量上升極為緩慢，后發酵20 d其氨基態氮含量最低僅有4.33 mg/g。同樣條件下，各酶促腐乳組別氨基態氮含量均比對照組高。多組腐乳氨基態氮在20 d左右達到9 mg/g以上，基本發酵成熟[4]。其中第5組(2%中性蛋白酶+2%堿性蛋白酶)和第2組(4%堿性蛋白酶)的氨基態氮含量較高，分別達到9.60、9.51 mg/g。結果顯示，添加外源蛋白酶有效解決了低溫蛋白質降解和腐乳熟化的問題，證明了腐乳的酶法輔助低溫發酵工藝的可行性，為腐乳發酵工藝研究提供了新的方向。

圖1 20 ℃后發酵溫度腐乳樣品的氨基態氮變化Fig.1 Changes of amino nitrogen content in sufu samples post-fermented at 20 ℃

2.1.2 30 ℃后發酵溫度腐乳樣品的氨基態氮變化

由圖2顯示，該溫度下各組腐乳氨基態氮含量存在一定差異。其中，第2組(4%堿性蛋白酶)和第5組(2%中性蛋白酶+2%堿性蛋白酶)的氨基態氮含量較高，分別為9.51、9.02 mg/g，最低為對照組僅有4.26 mg/g。后發酵溫度的升高對腐乳中氨基態氮含量起促進作用[2]，而30 ℃下各組腐乳的氨基態氮含量變化趨勢與20 ℃條件下相近甚至相對較低，推測使用不同批次腐乳使得結果受到一定程度的影響。

圖2 30 ℃后發酵溫度腐乳樣品的氨基態氮變化Fig.2 Changes of amino nitrogen content in sufu samples post-fermented at 30 ℃

2.1.3 37 ℃后發酵溫度腐乳樣品的氨基態氮變化

由圖3可得，該溫度下各組腐乳氨基態氮含量呈快速上升趨勢，在后發酵10 d左右其氨基態氮含量均已達標且腐乳已基本成熟，之后均趨于平緩。37 ℃后發酵溫度接近復合蛋白酶的最佳溫度，活性達到最佳狀態，也使腐乳中蛋白質的組織結構疏松，從而暴露出更多的酶作用位點[17-18]。各組腐乳氨基態氮含量仍存在一定差異。其中，第9組(2%堿性蛋白酶+2%木瓜蛋白酶)氨基態氮含量最高達到12.27 mg/g，對照組僅為4.26 mg/g，表明在37 ℃后發酵溫度下添加外源蛋白酶對腐乳成熟起到極大的促進作用，縮短了發酵周期使得發酵12 d左右氨基態氮含量達到較穩定狀態。

圖3 37 ℃后發酵溫度腐乳樣品的氨基態氮變化Fig.3 Changes of amino nitrogen content in sufu samples post-fermented at 37 ℃

2.1.4 50 ℃后發酵溫度腐乳樣品的氨基態氮變化

由圖4可得，該溫度下各組腐乳氨基態氮含量上升較緩并存在下降趨勢，相較于后發酵溫度為37 ℃的氨基態氮含量少。后發酵溫度50 ℃屬于高溫發酵，高溫導致酶蛋白發生部分變性，從而使反應速率有所下降[19]；另外，高溫還會影響氨基化合物如氨基酸和多肽等的穩定性和其他化學反應的發生，導致氨基態氮含量的下降，體現在多組腐乳樣品在后發酵10～20 d的氨基態氮含量均有明顯的下降趨勢。各組腐乳氨基態氮含量變化趨勢較雜亂，但添加外源蛋白酶的組別氨基態氮含量仍高于對照組。其中，第8組(2%堿性蛋白酶+2%胰蛋白酶)和第2組(4%堿性蛋白酶)的氨基態氮含量較高，分別達到10.50、10.35 mg/g，對照組最低為4.65 mg/g。

圖4 50 ℃后發酵溫度腐乳樣品的氨基態氮變化Fig.4 Changes of amino nitrogen content in sufu samples post-fermented at 50 ℃

結果表明，添加外源蛋白酶的組別氨基態氮含量均高于不加酶的對照組，有利于縮短腐乳生產周期。在一定范圍內，隨著后發酵溫度的升高，氨基態氮含量有明顯的增加。通過不同酶處理，中性蛋白酶和堿性蛋白酶對低溫有更好的適應性，在20、30 ℃后發酵條件下起到明顯的促蛋白酶解作用；而木瓜蛋白酶和胰蛋白酶最適溫度范圍相對較高，更適于37、50 ℃后發酵條件，且復合酶的效果優于單一酶作用。

2.2 不同溫度發酵過程中腐乳樣品pH變化

發酵過程中pH值是微生物在特定環境下代謝活動的綜合指標，影響腐乳pH值變化的因素主要有氨基態氮含量和總酸含量[19]。從圖5可以看出，腐乳的發酵過程總體呈先下降后上升再下降后平穩趨勢，且不同發酵溫度下各組pH值的變化規律基本一致[20-21]。前發酵階段，pH值先下降后迅速升高，初期毛霉處于生長延滯期豆腐水分被消耗導致pH下降，之后毛霉基本處于生長平穩期，大量毛霉菌體生長消耗了以豆腐為基礎的碳源和氮源，生成了諸如生物胺等的堿性物質導致pH升高。后發酵階段，毛霉產生大量蛋白酶分解蛋白生成各種酸性氨基酸以及碳水化合物、脂肪酸的分解，乳酸菌等微生物發酵產生乳酸、醋酸等有機酸導致pH值呈下降趨勢。隨著發酵時間的增長，水解產物氨基酸的進一步脫氨基作用產生氨[22],對pH值產生一定的影響。由圖5-a和圖5-b可得，其pH值最終分別穩定在6.0～6.4，在酶法輔助腐乳低溫發酵條件下，各組腐乳pH值均符合標準；由圖5-c顯示，37 ℃后發酵溫度下各組腐乳pH值穩定在5.8～6.2；而圖5-d中50 ℃后發酵溫度各組pH值則穩定在5.5左右。

a-后發酵溫度20 ℃；b-后發酵溫度30 ℃；c-后發酵溫度37 ℃；d-后發酵溫度50 ℃圖5 不同蛋白酶處理腐乳pH的變化Fig.5 Changes of pH in sufu treated with different proteases

結果表明，不同后發酵溫度下腐乳的pH始終呈酸性，且酶促腐乳組別的pH值一般高于對照組，這是由于外源蛋白酶的添加可使蛋白質及其水解產物氨基酸快速分解，使得pH升高[23-24]。隨著后發酵溫度的增加，腐乳pH值有下降趨勢，可能的原因包括在高溫下易滋生細菌產生多種酸性雜質，以及高溫條件下氨基化合物的分解等。此外，在酶促腐乳低溫發酵下，保證了腐乳的酸度以及安全性；而在高溫條件下，大大增加了腐乳的酸性。

2.3 不同溫度發酵過程中腐乳樣品可溶性固形物變化

可溶性固形物是腐乳滋味的主要來源，跟蹤檢測腐乳發酵過程中的可溶性固形物含量對于判斷腐乳的成熟有重要意義[25]。由圖6可知，腐乳可溶性固形物含量整體呈波動上升后平穩趨勢，且不同溫度下可溶性固形物含量變化規律趨于一致。前發酵階段，毛霉在大量累積蛋白酶，故可溶性固形物含量趨于平穩且緩慢增加。后發酵初期，腐乳中的不溶性物質被蛋白酶分解生成水溶性物質；后發酵后期，水解產物的累積以及原料的減少使得蛋白酶活性受到抑制，使得可溶性固形物含量變化趨于平穩。不同后發酵溫度處理下樣品中可溶性固形物含量最高均處于6.0%～6.4%，最低為對照組均僅有4.3%～4.8%。其中，中性蛋白酶和堿性蛋白酶體現了其促熟的優越性。結果表明，酶促腐乳組由于外源蛋白酶分解了更多的不溶性蛋白質，從而使得酶促腐乳組可溶性固形物含量均高于對照組；可溶性固形物包括糖、氨基酸、脂肪酸等，故可溶性固形物含量的變化規律與氨基態氮含量具有相似性。

a-后發酵溫度20 ℃；b-后發酵溫度30 ℃；c-后發酵溫度37 ℃；d-后發酵溫度50 ℃圖6 不同蛋白酶處理腐乳可溶性固形物的變化Fig.6 Changes of soluble solids in sufu treated with different proteases

3 結論與討論

研究結果顯示，可溶性固形物與氨基態氮含量變化規律具有相似性，各酶促腐乳組別均高于不加酶的對照組。不同溫度下，氨基態氮含量最高分別達到9.6、9.57、12.27、10.50 mg/g，最低為4.26～4.65 mg/g，最高含量為最低含量的2～3倍左右；可溶性固形物含量最高在6.0%～6.4%，最低在4.3%～4.8%，表明外源蛋白酶的添加有利于縮短發酵周期，利用添加外源蛋白酶來優化腐乳發酵工藝具有一定的可行性。隨著發酵溫度的升高，兩者均有上升趨勢，但在高溫條件下會影響酶活性，導致氨基態氮含量降低。對比不同后發酵溫度，中性蛋白酶和堿性蛋白酶對低溫有更好的適應性，在20、30 ℃后發酵條件下起到明顯的促蛋白酶解作用，而木瓜蛋白酶和胰蛋白酶最適溫度范圍相對較高，更適于37、50 ℃后發酵條件。同時，復合酶在對腐乳的促熟作用中體現出一定的優越性。在腐乳后發酵過程中，酶促腐乳pH值始終高于不加酶的對照組，隨著溫度的升高，腐乳pH值呈下降趨勢。

基于低溫后發酵有利于腐乳的保藏并防止腐敗，低溫酶輔助法的腐乳發酵工藝可能在制備低鹽腐乳方面具有一定優勢[26]。同時，添加蛋白酶(尤其是復合蛋白酶)能有效解決低溫蛋白質降解和腐乳熟化的問題，并且20 ℃酶促腐乳的成熟速度與30 ℃條件下相似，使低溫發酵酶促腐乳更具可行性，由此可促進改善腐乳的品質和降低腐敗風險。因此，根據此次研究確定低鹽腐乳后發酵最佳工藝為：溫度20 ℃，蛋白酶添加量為2%中性蛋白酶+2%堿性蛋白酶。