基于礦物元素技術的中寧不同產區枸杞的判別分析

開建榮，石欣，李彩虹，楊春霞，王彩艷

(寧夏農產品質量標準與檢測技術研究所，寧夏 銀川，750002)

寧夏中寧縣作為中國枸杞的原產地和道地產區，人工種植枸杞的歷史已達600年之久，因中寧枸杞與其他產地枸杞具有不同的獨特品質，寧夏中寧縣也被譽為“中國枸杞之鄉”[1]，截至2018年年底，寧夏枸杞種植面積達6.67萬hm2，枸杞干果總產量14萬t，年綜合產值130億元[2]，枸杞產業已成為寧夏農村經濟社會發展、農業增效、農民增收的重要支柱產業。目前，國內已注冊的枸杞商標除中寧枸杞外，還有靖遠枸杞、瓜州枸杞、精河枸杞、柴達木枸杞等[3]，隨著枸杞地理標志保護產品的增多，假冒產品標識、以次充好的現象時有發生，嚴重損害消費者權益。

目前，產地溯源技術主要包括礦物元素分析技術、穩定同位素技術、有機成分指紋溯源技術、近紅外光譜指紋溯源技術、拉曼光譜指紋溯源技術等[4]。礦物元素分析技術被認為是植源性食品產地判別較為有效的方法[5-7]，已被廣泛應用于谷物[8-9]、橄欖油[10-12]、葡萄酒[13-15]、茶葉[16-18]等的產地溯源。電感耦合等離子體質譜(inductively coupled plasma massspectrometry，ICP-MS)儀因具有高靈敏度、線性范圍寬、可多元素同時測定等優勢，是目前礦物元素測定最常用的技術[19-20]。枸杞中元素含量與產地環境因素密切相關，形成不同地區各自的元素特征，因此，篩選枸杞中與產地直接相關的元素指標作為產地溯源指標是其溯源研究的關鍵。MAIONE等[21]通過檢測分析21種礦物元素對巴西大米進行分類精度研究，結果表明3種分類模型對巴西中西部、南部地區大米的產地預測準確度分別為93.66%、93.83%和90%；MA等[18]利用ICP-MS對洞庭碧螺春及其他綠茶樣品中37種礦物質元素的含量進行了測定，構建判別模型的正確判別率為96.4%，實現了對相同和不同產地品牌綠茶的產地判別。

國內外學者利用礦物元素技術進行了大空間尺度的產地溯源應用，取得了理想的判別效果。本研究以中寧小尺度區域為例，采用礦物元素分析技術對中寧5個小產區(舟塔產區、鳴沙洲產區、紅梧山產區、紅柳溝產區和清水河產區)進行產地判別分析。研究礦物元素分析技術在小尺度區域內枸杞產地判別中的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

混合標準溶液，美國 Perkin Elmer公司，第1組標準溶液包括As、Ba、Bi、Ca、Cd、Co、Cr、Cs、Cu、Fe、Li、Mg、Mn、Ni、Pb、Rb、Se、Sr、Tl、U、Zn 21種元素混合標準溶液(Lot#18-195 JB)，第2組標準溶液包括B、Ge、Mo、Nb、Er 5種元素(Lot#20-134 JB)，第3組標準溶液包括Ce、Dy、Eu、Gd、Ho、Nd、Pr、Sm、Tb、Th、Tm、Y、Yb 13種元素(Lot#41-48AS)；N、P、K、Hg為單標元素，中國計量科學研究院，質量濃度為1 000 mg/L，共計43種元素。硝酸，德國默克；鹽酸，國藥化學試劑有限公司，均為優級純；試驗用水為一級水。

標準物質GBW 10047(生物成分分析標準物質—胡蘿卜)為中國地質科學院地球物理地球化學勘查研究所研制。

1.2 儀器與設備

ELAN DRC-e型ICP-MS 儀，美國 Perkin Elmer公司；Mars6 Xpress微波消解儀(內置雙光路溫度控制系統和全罐異常壓力監控系統)，美國 CEM 公司；AL104型電子天平，梅特勒-托利多。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集

枸杞樣品于2018年6～10月采自寧夏中寧地區的5個小產區，舟塔產區(n=34)、鳴沙洲產區(n=14)、紅梧山產區(n=24)、紅柳溝產區(n=12)、清水河產區(n=27)。

1.3.2 樣品前處理

枸杞鮮樣曬干，置于50 ℃烘箱中烘干至粉碎時不黏壁，然后進行充分研磨，過100目篩后備用。

枸杞樣品采用微波消解法消解，具體操作步驟：稱取0.5 g (精確到0.000 1 g) 枸杞樣品置于微波消解管中，加入硝酸10 mL，常溫靜置3 h后，放入微波消解儀中進行樣品消解，選擇溫度控制，5 min爬升至120 ℃，保持10 min；5 min爬升至150 ℃，保持20 min；5 min爬升至190 ℃，保持30 min。消解完畢后冷卻，輕輕擰開蓋子，將微波消解管置于趕酸儀上120 ℃趕酸2 h，然后冷卻至室溫，用超純水洗至50 mL刻度試管中，并用超純水定容，搖勻；同時做試劑空白。

1.3.3 礦物元素含量測定

枸杞中N、P、K元素含量按照NY/T 2017—2011《植物中氮、磷、鉀的測定》測定，K采用火焰光度計測定，N采用凱氏定氮儀法測定，P采用鉬銻抗吸光光度法測定。枸杞其他礦物元素含量采用ICP-MS標準模式測定[22-23]。具體的工作條件為：發生器功率：1 300 W；霧化器流量：0.95 L/min；等離子炬冷卻氣流量：17.0 L/min；輔助器流量：1.20 L/min；檢測器模擬階電壓：-2 350 V；離子透鏡電壓：6.00 V。儀器測定枸杞樣品及胡蘿卜標準物質中43種元素，標準物質測定值在標準值范圍內，儀器元素的檢出限和定量限見表1。

表1 ICP-MS儀器測定礦物元素標準曲線、檢出限和定量限Table 1 ICP-MS instrument determination of mineral elements standard curve, detection limits and limits of quantification

1.4 數據分析

采用SPSS 25.0進行單因素方差分析和主成分分析；采用SPSS 25.0和SIMCA 13.0分別進行Fisher判別分析和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA)。

2 結果與分析

2.1 不同產區枸杞中礦物元素含量差異分析

通過對舟塔產區、鳴沙洲產區、紅梧山產區、紅柳溝產區、清水河產區枸杞中43種元素含量進行方差分析。其中Ba、Bi、Cd、Ce、Cu、Dy、Eu、Gd、Ge、Hg、Ho、Mg、Mn、Mo、Nd、Ni、Pr、Se、Sm、Sr、Tb、Th、Tm、Yb、Ca、Pb、P、Er 28種元素含量在5個產區間存在顯著差異(P<0.05)，元素As、B、Co、Cr、Cs、Li、Nb、Rb、Tl、U、Y、Fe、Zn、N、K 15種元素含量在產區間差異不顯著(P>0.05)(表2)。

舟塔產區的Cd、Cr、Ge、Hg、Mo、Ni、Nb、Tl、Ca、Pb、P 元素含量高于其他產區，Ce、Dy、Gd、Ho、Nd、Sm、Tb、Th、Tm、Y、Fe、Pr、Er元素含量低于其他產區；鳴沙洲產區的Cu、Dy、Eu、Nb、Gd、Li、Mg、Rb、Yb、U、Fe元素含量高于其他產區，Sr元素含量低于其他產區；紅柳溝產區的Bi、Mo、Mn、Nb、Li、Ni、P元素含量低于其他產區；紅梧山產區的Ba、Bi、Ce、Ho、Nb、Nd、Pr、Sm、Sr、Tb、Th、Tm、U、Yb、Er元素含量顯著高于其他產區，Cd、Cu、Ge、Hg、Ca元素含量低于其他產區；清水河產區的Co、Mn元素含量高于其他產區，Ba、Eu、Mg、Rb、Tl、U、Yb、Pb元素含量低于其他產區；中寧小尺度區域內各產區枸杞中礦物元素含量有其各自的地域特征，礦物元素在小尺度相似地域之間具有較大的差異性。

表2 不同產區枸杞中礦物元素含量 單位：mg/kg

2.2 枸杞中礦物元素的主成分分析

主成分分析是指通過將存在相關性的變量轉換成線性不相關的變量，并提取完全沒有相關性又保留了原始數據大部分信息的幾個主成分[24-25]，本研究對中寧枸杞產區間存在顯著差異的36種元素進行主成分分析，KMO統計量為0.809(KMO統計量>0.5)，各元素之間具有顯著相關性，可以進行主成分分析，結果見表3。第1主成分方差貢獻率為30.083%，綜合了Pr、Tb、Sm、Nd、Dy、Yb、Ho、Ce、Tm、Gd、Th、Y、Eu、Bi 14種元素信息；第2主成分方差貢獻率為12.741%，綜合了Mo、Ge、Co元素信息；第3主成分方差貢獻率為7.672%，綜合了Tl、Rb、Cs元素信息；第4主成分方差貢獻率為5.701%，代表了Mg、Mn元素信息；第5主成分方差貢獻率為4.730%，代表了N、K、Li元素信息；第6主成分方差貢獻率為4.225%，綜合了Ca、P、Pb元素信息；第7主成分方差貢獻率為3.640%，代表了Zn、Cu元素信息；第8主成分方差貢獻率為2.798%，代表了Sr元素信息；第9主成分方差貢獻率為2.613%，代表了Er元素信息；第10主成分方差貢獻率為2.381%，代表了As元素信息；前10個主成分累計方差貢獻率為76.583%。篩選出Pr、Tb、Sm、Nd、Dy、Yb、Ho、Ce、Tm、Gd、Th、Y、Eu、Bi、Mo、Ge、Co、Tl、Rb、Cs、Mg、Mn、N、K、Li、Ca、P、Pb、Zn、Cu、Sr、Er、As 33種枸杞的特征礦物元素。

表3 前10個主成分的載荷矩陣及方差貢獻率Table 3 Loading matrix and cumulative contribution to total variance of the first ten principal components

續表3

2.3 枸杞中礦物元素的判別分析

礦物元素含量的差異揭示了不同產區枸杞存在差異，但不足以對枸杞產區進行準確判別，為了實現對中寧不同產區枸杞的產地判別，分別采用Fisher判別分析和OPLS-DA方法對中寧5個產區枸杞樣本進行判別分析。

2.3.1 基于Fisher判別分析的枸杞產區判別模型

為了進一步了解各元素含量指標對枸杞原產地的判別情況，建立基于Fisher判別函數的一般判別方法對枸杞樣品進行多變量判別分析，以43種礦物元素作為判別分析的自變量，進行逐步判別分析，結果顯示，Cd、Ce、Co、Cu、Gd、Hg、Mg、Se、Zn、P等10種礦物元素對產地判別顯著的元素被引入到判別模型中。不同產地枸杞判別函數模型系數見表4，判別分類結果見表5。提取模型前4個典型判別函數，Willks’ Lambda檢驗結果進一步證實，在α=0.05的顯著性性水平下，4個函數對分類效果均為顯著，其中判別函數1和判別函數2累積解釋判別模型能力為78.3%，且相關系數均>0.95，表明判別函數1和判別函數2對5個枸杞產地分類占主要貢獻作用，利用判別函數1和判別函數2的得分值作散點圖，見圖1。舟塔、紅梧山、清水河產區容易區分，分別位于不同空間，鳴沙洲產區和紅柳溝產區樣品有部分重疊。分類結果表明，回代檢驗的整體正確判別率為97.3%，回代檢驗是針對所有訓練樣本進行的檢驗，樣品的錯判率是相應總體率的偏低估計，而留一交叉檢驗比較真實地體現了模型的判別能力[26]，交叉檢驗中舟塔產區各有1個和4個樣本分別誤判為紅柳溝和清水河產區，鳴沙洲各有2、2、1、1個樣本被誤判為舟塔、紅柳溝、紅梧山和清水河產區，紅柳溝各有1個樣本被誤判為舟塔和紅梧山產區，紅梧山各有1個和3個樣本被誤判為紅柳溝和清水河產區，清水河各有1個和2個樣本被誤判為舟塔和紅梧山產區，交叉檢驗的整體正確判別率為82.0%，說明基于礦物元素指紋的差異可以有效鑒別不同產地的枸杞。

表4 不同產地枸杞判別函數模型系數Table 4 Distinctive L. barbarum distinguish function model coeffieient

2.3.2 基于OPLS-DA的枸杞產區區分模型

對5個產區枸杞樣本中的43種礦物元素含量進行OPLS-DA分析，構建溯源模型。OPLS-DA模型中，R2X(cum)與R2Y(cum)分別表示在X軸方向和Y軸方向上主成分1和主成分2對變量的解釋能力，Q2(cum)表示模型對分組的預測能力[27]，該模型中R2X(cum)、R2Y(cum)和Q2(cum)分別為0.709、0.598和0.499，說明建立的OPLS-DA模型中2個主成分能有效解釋5個產區之間的差異，且該模型具有一定的預測能力。

表5 不同產區枸杞的一般判別分析結果Table 5 General discriminant analysis of L. barbarum from different origins

圖1 不同產區枸杞前2個典型判別函數得分散點圖Fig.1 Scattering points of the first two typical discrimination functions of L. barbarum from different origins

圖2為OPLS-DA模型第1、2主成分得分圖和載荷圖。各個產區樣品群體內有明顯的聚集趨勢，僅有1個紅梧山的樣本落在Hotelling T2橢圓圖外，舟塔產區(ZT)、鳴沙洲產區(MSZ)可以較好地區分開，紅柳溝產區(HLG)分別與清水河產區(QSH)和紅梧山產區(HWS)樣品有部分重疊。橫坐標為第1主成分得分，通過第1主成分可以將舟塔、紅梧山與清水河產區樣品區分開；縱坐標為第二主成分得分，通過第2主成分可以將清水河產區與鳴沙洲產區區分。載荷圖表示第1、2主成分中各指標與不同產區的相關性大小，即圖中X變量與Y變量越靠近，其相關性越高。由圖3可知，舟塔產區的Ge、Ni、Ca、Cu、P、Pb、Cd、Hg元素含量較高；鳴沙洲產區的Gd、Yb、Nd、Y、Li、Fe、U、B、Nb、Mg元素含量較高；紅柳溝產區的N元素含量較高；紅梧山產區的Ce、Th、Sm、Tb、Pr、Th、Ho、Dy、Bi、Er、Nd、Ba、Yb、Er等元素含量較高；清水河產區Co、Mn元素含量相對較高，這與礦物元素含量差異的分析結果相近。

利用建立的模型對5個產區的枸杞樣品進行原產地判別(表6)。舟塔產區34個樣品正確判別率為

a-得分圖；b-載荷圖圖2 OPLS-DA模型第1、2主成分得分圖和載荷圖Fig.2 Scoring plot and loading plot of first versus second components in OPLS-DA

100%；鳴沙洲產區14個樣品中2個誤判，正確判別率為85.71%；紅柳溝產區12個樣品中有2個被誤判，正確判別率為83.3%；紅梧山產區24個樣品中3個樣品誤判，正確判別率為87.5%；清水河產區27個樣品2個誤判，正確判別率為92.59%，111個樣品的整體正確判別率為91.89%。

表6 OPLS-DA模型數據判別率Table 6 Accuracy of OPLS-DA model by validation set

3 結論

通過分析寧夏中寧5個小產區枸杞中43種礦物元素含量的組成特征，明確了不同產區枸杞中28種礦物元素存在地域差異。通過主成分分析確定了Pr、Tb、Sm、Nd、Dy、Yb、Ho、Ce、Tm、Gd、Th、Y、Eu、Bi、Mo、Ge、Co、Tl、Rb、Cs、Mg、Mn、N、K、Li、Ca、P、Pb、Zn、Cu、Sr、Er、As 33種枸杞的特征礦物元素。Fisher判別分析確定了Cd、Ce、Co、Cu、Gd、Hg、Mg、Se、Zn、P 10種枸杞的有效溯源指標。Fisher判別分析方法構建的判別模型的回代檢驗和交叉檢驗的整體正確判別率分別為97.3%和82.0%，基于OPLS-DA建立的判別模型的整體正確判別率為91.89%，相比之下，OPLS-DA判別效果更好。模型的整體正確判別率較低，但綜合考慮到中寧僅為一個縣級區域，面積4 226 km2，這樣一個小尺度區域內的枸杞產地正確判別率可以接受。通過多元統計方法基本實現了對小尺度區域范圍內枸杞產地的有效判別。誤判率相對較高的原因可能與產區劃分有關，雖然實現了地域劃分，但5個產區地域距離較近；同時樣本數量不一致也是影響判別模型準確率的因素之一。結合以上分析，礦物元素技術結合多元統計分析方法對枸杞產地判別有效可行。該結果為下一步分析環境因素(土壤、水、肥料等)對枸杞礦物元素指紋信息的影響提供了基礎數據。該模型的建立可用于枸杞原產地識別，對寧夏地理標志性產品及消費者合法權益的保護提供了有效的技術支撐。