桑葚酵素發酵過程中活性物質與抗氧化能力的相關性研究

易媛，趙敏惠，左勇,*，馬倩，胡琨，黃慶

1(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓，644005)2(四川師范大學 生命科學學院，四川 成都，610101)

桑葚作為藥食同源的水果，富含維生素、蛋白質、微量元素及多種功能活性物質[1]。桑葚功能性雖強，但果品運輸、貯藏中耗損大，除鮮食外，少部分被精深加工為果汁、果酒等，產品線單一[2]。酵素作為新興產品，有機酸、氨基酸、維生素等營養物質含量豐富，且發酵賦予了產品良好的口感和風味，其清潔腸道、解酒護肝、抗氧化等功效深受消費者喜愛[3]。

酵素制作工藝多采用自然發酵，為混菌發酵體系，其微生物組成和代謝過程復雜，品質和風味優于接種發酵[4]。由于環境微生物的復雜性，導致酵素發酵機理不明確，產品品質不穩定，不適合現代化工業生產。因此，對酵素自然發酵過程的理化和功能成分進行監測和分析，有助于探究酵素的自然發酵機理。

本研究以自然發酵桑葚酵素為實驗對象，檢測傳統酵素發酵過程中主要活性成分的變化，了解酵素功能活性物質的代謝規律，并分析各活性成分對產品抗氧化性產生的影響，旨在進一步認識桑葚酵素的抗氧化機制，為改善自然發酵酵素工藝、減少損耗，及標準化、工業化生產桑葚酵素提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚(購于宜賓農貿市場)；白砂糖，市售一級；DPPH、ABTS，美國Sigma公司；福林酚、沒食子酸、蘆丁(AR級)，麥克林生化科技有限公司；有機酸標準品(草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酮酸、乙酸，HPLC級，純度≥99%)，上海源葉生物技術有限公司。

1.2 儀器設備

T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；1260 infinityⅡ高效液相色譜儀，美國Agilent公司；HWS-12恒溫水浴鍋，上海喬欣科學儀器有限公司；0.22 μm水系濾膜，天津市津騰實驗設備有限公司；AR1140電子天平，奧豪斯國際貿易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葚酵素的制備

桑葚用無菌水沖洗后，自然晾干，白砂糖用紫外照射45 min，玻璃發酵罐高壓蒸汽滅菌。將桑葚與糖按質量比2∶1的比例混合，放入發酵罐中，密封后28 ℃避光發酵80 d。分別于發酵0、5、10、15、20、25、30、40、50、60、80 d取樣，1 000 r/min離心10 min后，取上層發酵液置于-80 ℃冰箱中保存，待測。

1.3.2 桑葚酵素理化指標的測定

采用pH計測定pH值；還原糖含量的測定采用DNS法[5]；總酸含量的測定參照GB 12456-2021《食品中總酸的測定》中的pH計電位滴定法。

1.3.3 主要抗氧化成分測定

總酚的測定使用福林—酚比色法[6]，按照標準曲線線性方程y=5.547x+0.002 2(R2=0.999 6) 計算總酚濃度，以沒食子酸的質量計?？傸S酮的測定采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[7]，按照標準曲線方程為y=0.001x+0.005 4(R2=0.999 3)計算總黃酮含量，以蕓香甙的質量計。

1.3.4 體外抗氧化能力測定

DPPH自由基清除能力測定參照文獻[8]的方法；·OH清除能力測定參照文獻[9]的方法；ABTS陽離子自由基清除能力測定參照文獻[10]的方法；還原力的測定參照文獻[11]的方法。

1.3.5 有機酸含量測定

參照楊建飛等[12]的方法并加以改進。高效液相色譜條件：Agilent ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱，流動相A為KH2PO4溶液(pH=2.54)，流動相B為甲醇溶液，V(KH2PO4)∶V(甲醇)=95∶5，進樣量10 μL，VWD檢測器，檢測波長210 nm，流速0.4 mL/min，柱溫30 ℃。

1.4 數據處理

采用SPSS 17.0進行皮爾遜相關性分析及主成分分析，采用SIMCA 14.1對主成分的分圖進行繪制，采用Origin 2018、Excel繪制圖表。

2 結果與討論

2.1 發酵過程中理化指標的變化

桑葚酵素發酵過程中還原糖、pH和總酸的變化如圖1所示。發酵的前30 d，還原糖總體呈不斷下降的趨勢，從初始的532.71 g/L下降到388.08 g/L。而總酸呈不斷上升的趨勢，從初始的4.55 g/L上升到28.69 g/L，證明發酵體系中的微生物利用糖生長代謝，并產生以乳酸、乙酸為主的大量有機酸，同時使pH從初始的4.58下降至3.16。30 d以后，還原糖、總酸基本趨于平穩，表明微生物代謝減弱，發酵進入后熟階段。到發酵截止的80 d內，還原糖含量輕微浮動，可能是微生物分解利用桑葚原料中的糖類物質引起的[13]。發酵結束時，總酸含量為26.97 g/L，其下降的原因可能是發酵液中的有機酸被氧化分解、形成脂類、被菌群作為碳源消耗等。

a-還原糖含量；b-pH、總酸含量圖1 不同發酵時間還原糖、pH、總酸含量的變化Fig.1 The change of reducing sugar content, pH and total acid content

2.2 發酵過程中主要抗氧化成分的變化

桑葚酵素發酵過程中總酚、總黃酮的測定結果如圖2所示。在發酵5 d，總酚和總黃酮急劇上升，可能是由于原料處理時，加糖攪拌使原料發生氧化，密封發酵后，部分多酚物質的溶出導致的。5 d后總酚和總黃酮減少的原因可能是酚類化合物與固形物、蛋白質甚至酵母結合或吸附，導致了酚類化合物含量的下降[14]。

圖2 桑葚酵素發酵過程中總酚、總黃酮含量的變化Fig.2 Changes of total phenol and total flavone contents in mulberry fermentation

隨著發酵的進行，某些大分子酚類物質逐漸被微生物分解為小分子酚類化合物，使總酚和總黃酮濃度不斷增加[15]，在發酵40 d時達到最大值，分別為3.42 g/L和3.60 g/L。40 d后，總酚和總黃酮開始呈下降趨勢，可能是由于發酵時間過長，多酚類化合物發生非酶促反應，進一步聚合[16]。此結果與前人研究結果相似[17-18]。

2.3 發酵過程中體外抗氧化能力的變化

由圖3-a所示，桑葚酵素DPPH自由基清除能力在發酵過程中緩慢上升，25 d時，從初始的64.59%上升至最大值71.16%，之后開始有輕微的上下浮動，發酵結束時DPPH自由基清除能力為69.37%。偉仕靜等[19]研究發現，發酵過程中總酚的變化與其DPPH自由基清除能力之間有明顯的相關性，與本實驗結果相似。

由圖3-b所示，桑葚酵素ABTS陽離子自由基清除能力25 d內從初始的59.31%迅速上升至73.41%，25 d后緩慢上升，于50 d時達到最大值74.04%，之后又略有下降，發酵結束時的清除能力為70.85%。桑葚酵素發酵過程中ABTS陽離子自由基清除能力的變化與總酚含量變化相似，HAGERMAN等[20]研究表明酚類化合物的聚合度、共軛度、酚類取代基的數量和排列以及分子質量在清除ABTS陽離子自由基上起著關鍵作用。

由圖3-c所示，桑葚酵素·OH清除能力在發酵的前30 d明顯增強，于第30天達到最大值39.83%，相較初始的·OH清除率19.28%，增長了106.58%。30 d后，桑葚酵素的·OH清除能力略有下降后趨于平穩?！H清除率的變化可能是有機酸、酚類物質、酵母代謝產物綜合作用的結果[21]。

由圖3-d所示，發酵過程中桑葚酵素的還原力隨發酵時間增加，呈不斷上升然后趨于平穩的趨勢，發酵結束時，桑葚酵素的還原力從初始的0.72上升到0.77。還原力的變化趨勢區別于其他抗氧化指標的原因與其抗氧化機制相關。

a-DPPH自由基清除率;b-ABTS陽離子自由基清除率;c-·OH清除率;d-還原力圖3 桑葚酵素發酵過程中體外抗氧化指標的變化Fig.3 Changes of antioxidant indexes in vitro during fermentation of mulberry Jiaosu

2.4 發酵過程中有機酸種類和含量的變化

對桑葚酵素有機酸含量進行測定，由圖4可知，桑葚原料不含丙酮酸，經過發酵后，共檢出8種有機酸，其中酒石酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸的含量較高，最高含量分別達到11.02、13.77、9.63、4.02、2.57 g/L，而草酸、丙酮酸、蘋果酸含量一直在1.0 g/L以下變化，說明桑葚酵素中的主要有機酸可能是酒石酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸。

乳酸和乙酸是有機酸中占比最高、變化最大的酸。原料中乳酸和乙酸的含量分別為0.46 g/L和0.77 g/L，在發酵過程中先增加后減少，發酵結束時，其含量分別為11.10 g/L和7.05 g/L。因為乳酸菌和醋酸菌是酵素發酵過程中的優勢菌種，發酵會產生大量的乳酸和乙酸，使總酸升高，pH值降低，從而又抑制了乳酸菌和醋酸菌的繁殖[22]。檸檬酸在發酵過程中沒有明顯的變化規律，這可能是因為檸檬酸參與三羧酸循環，在發酵過程中不易累積[23]。酒石酸作為桑葚原料中含量最多的有機酸，經發酵后，呈先上升后下降的趨勢。酒石酸的增加可能是由于pH值的急劇降低和原料的溶出造成的，然后因氧化降解或沉淀而減少[24]。

圖4 桑葚酵素發酵過程有機酸含量的變化Fig.4 Changes of organic acid content in mulberry fermentation process

2.5 發酵過程中各指標與抗氧化的相關性分析及主成分分析

2.5.1 各指標變化與抗氧化性活性的相關性分析

表1展示了桑葚酵素發酵過程中各指標變化與4種不同抗氧化活性的相關性，除檸檬酸外，其它成分與4種抗氧化指標均呈極顯著的相關性(P<0.01)。其中pH、還原糖與抗氧化能力呈極顯著的負相關，其他活性成分則與抗氧化能力呈極顯著的正相關(P<0.01)。證明總酚、總黃酮類及有機酸含量對桑葚酵素的抗氧化活性有很大影響。

表1 桑葚酵素發酵過程中各成分與抗氧化指標的相關性Table 1 Correlation between antioxidant indexes and components in mulberry fermentation process

2.5.2 主成分分析

為進一步挖掘桑葚酵素活性物質與抗氧化指標的相關性，應用主成分分析法對上述指標加以分析，得到主成分相關矩陣的特征值、貢獻率如表2所示，2個主成分累積貢獻率為81.464%(>80%)，基本包含大多數樣本信息。

表2 解釋的總方差Table 2 The total variance explained

主成分分析載荷圖如圖5所示，各指標之間相關性強的變量聚集在一起，距離越近，相關性越大。第3象限中，蘋果酸、丙酮酸、乙酸、乳酸、總酸與·OH清除能力具有很高的相關性，且與pH和還原糖呈極顯著的負相關。第2象限中，ABTS陽離子自由基清除率與總酚距離最近，說明二者相關性極顯著，除檸檬酸外，其余成分之間也存在一定的正相關性，此結果與上述相關性分析相似。

圖5 主成分分析載荷圖Fig.5 Principal component analysis loading plot

主成分樣品得分圖如圖6所示。發酵0 d和5 d離其他位置相對較遠，說明這2個樣品與其它樣品之間差異較大。發酵10、15 d和20、25、30 d在第2主成分上的差別都不大，但在第1主成分上，發酵10、15 d得分為正值，20、25、30 d得分為負值。發酵40、50、60、80 d主要集中在第2象限，各樣品之間無顯著差異。

圖6 主成分樣品得分圖Fig.6 Scoring plot of principal component samples

基于主成分分析法，對不同發酵時間桑葚酵素構建綜合評價指數體系。以表2的兩個主成分對應的方差相對貢獻率為權重，得到桑葚酵素綜合評價指數 (comprehensive evaluation index, CEI)計算如公式(1)所示：

(1)

式中：CEI，綜合評價指數；PC1，第1主成分；PC2，第2主成分。

不同發酵時間桑葚酵素樣品的綜合評價指標如圖7所示，CEI在0～5 d變化不大，可能是在高糖環境下，微生物處于適應期。發酵5～15 d，CEI迅速上升，發酵15 d以后，CEI上升緩慢，到30 d時達到最大值，為0.90。此后，CEI逐漸下降并趨于平穩。參考CEI，可判斷桑葚酵素的發酵終點為30 d。

圖7 桑葚酵素綜合評價指標Fig.7 Comprehensive evaluation index of mulberry Jiaosu

3 結論

對桑葚酵素發酵過程中的功能活性物質及體外抗氧化能力變化進行分析，發現總酚和總黃酮呈先上升后下降的趨勢，于40 d時分別達到最大值3.42 g/L和3.60 g/L，且多酚類物質含量的變化與體外抗氧化能力變化呈顯著的正相關性；經發酵，桑葚酵素中共檢出8種有機酸，酒石酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸作為桑葚酵素中的主要有機酸，含量最高達到11.02、13.77、9.63、4.02、2.57 g/L，且除檸檬酸外的有機酸在發酵過程中的變化均與抗氧化指標呈顯著的正相關，表明這些活性物質是影響桑葚酵素抗氧化能力的重要因素。通過對所有指標進行綜合性分析，桑葚酵素可分為4個發酵階段：發酵初期(0～5 d)、發酵中期(5～15 d)、發酵后期(15～30 d)及后熟期(30～80 d)，CEI于30 d達到最大值，結合時間成本考慮，可將30 d確定為桑葚酵素的發酵終點。這將為縮短桑葚酵素發酵周期、提高桑葚酵素抗氧化力提供理論基礎。