磁性Fe3O4納米粒子固定化酶及其在食品中的應用

楊晶晶，薛超輝，李紅娟，于景華，李洪波

(天津科技大學 食品營養與安全教育部重點實驗室暨天津市食品營養與安全重點實驗室，天津,300457)

酶是一種具有高效性、專一性、催化條件溫和無污染等特點的生物催化劑，在食品加工、生物醫藥、水處理、能源等研究領域中有著巨大的應用潛力[1]。然而，大多數酶是蛋白質，易受溫度、pH以及重金屬鹽等環境因素影響而變性或失活，使其難以回收利用和連續化生產。固定化酶具有較高的催化特性和穩定性，可以有效提高酶的利用率。隨著20世紀60年代固定化材料和酶工程領域的進一步發展[2]，固定化酶技術開拓了更加廣闊的應用前景。

目前，新型固定化酶技術的研究主要集中在2個方面：一是固定化新技術的開發及傳統固定化技術的改進，如交聯酶聚集體、物理輔助固定化技術、膜固定化技術等的開發與應用[3]；二是新型固定化材料的開發研究，如金屬有機框架材料(metal-organic frameworks,MOFs)、共價有機框架材料(covalent-organic frameworks,COFs)以及磁性納米材料等[4]。其中，磁性Fe3O4納米粒子作為酶固定化的新型載體，具有良好的生物相容性、粒徑小、比表面積大、超順磁性、較高的載酶量及在溶液中穩定存在等優點[5]。同時該粒子不僅可以通過施加外界磁場快速地從反應體系中分離出來，促進酶的有效回收和循環利用，還可以與多種材料復合，利用這些復合材料獨特的物理或表面特性(提供醛基、羥基、羧基和氨基等基團)提高酶的固定效率，解決單一材料在固定化酶領域所存在的缺陷問題[6]。另外，穩定的核殼結構能夠在強酸、強堿環境中保護酶的活性，使其在固定化酶、生物醫學和臨床應用中發揮巨大的作用。本文綜述了磁性Fe3O4納米粒子的制備、酶固定化方法及其固定不同種類酶的最新研究，最后總結其在食品工業領域的應用現狀，以期為促進磁性Fe3O4納米粒子固定化酶技術的應用研究提供參考。

1 磁性Fe3O4納米粒子

1.1 磁性Fe3O4納米粒子的特性

磁性納米顆粒是由聚合物和磁性材料組成的新型有機-無機功能材料。其中，Fe3O4納米粒子是目前最受歡迎的磁性固定化材料，具有高飽和磁化強度、超順磁性和大比表面積等優點，目前在藥物遞送和酶固定化領域備受關注[5]。但Fe3O4非常不穩定，在空氣中很容易被氧化成其他物質，降低了材料的磁性和分散性。此外，Fe3O4暴露的表面具有化學活性，可能會導致酶蛋白的失活[7]。為了克服這些問題，采用無機或有機材料與裸露的Fe3O4形成納米復合材料。磁性核殼結構的復合材料是最有前途的多功能材料之一，在酶固定化方面受到越來越多的關注，如圖1所示。

1.2 磁性Fe3O4納米粒子的制備

Fe3O4納米粒子的應用十分廣泛，其制備方法多種多樣，主要有機械球磨法、水熱法、高溫分解法、微乳液法、共沉淀法等[8-9]，其制備原理和優缺點如表1所示。

圖1 Fe3O4核殼結構固定化酶形成過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of the formation of Fe3O4 core-shell structure immobilized enzyme

表1 Fe3O4納米粒子的制備方法Table 1 Preparation method of Fe3O4 nanoparticles

1.3 磁性Fe3O4納米粒子固定化酶的方法

通過物理或化學方法將游離酶與特定的載體材料結合實現酶的固定化。酶固定化的方法主要包括吸附法、包埋法、交聯法與共價法等以及多種方法結合的技術[10-12]。研究發現，采用化學試劑對Fe3O4納米粒子及其核殼結構進行修飾，使酶分子上的氨基酸殘基與載體上特定官能團以共價鍵的形式結合，可以快速有效地實現酶的固定化。AKHOND等[13]研究了氨基功能化的納米粒子修飾的磁性納米粒子共價固定豬胰腺α-淀粉酶的潛力。研究表明固定后α-淀粉酶保留了50%以上的初始比活性。與游離酶相比，固定化酶的熱穩定較好，在重復使用9次后依然保持68%的初始活性。CHENG等[14]提出了一種將α-葡萄糖苷酶直接共價固定在3-氨丙基三乙氧基硅烷修飾的Fe3O4納米粒子上的方法。與游離酶相比，固定化α-葡萄糖苷酶的耐酸堿度和熱穩定性略有提高。此外，固定化α-葡萄糖苷酶表現出良好的重復利用性，經7次循環后，剩余活性仍達到66.0%。

2 磁性Fe3O4納米粒子固定化酶

2.1 磁性Fe3O4納米粒子固定化脂肪酶

脂肪酶(三酰基甘油酯水解酶)是一種良好的熱穩定生物催化劑，可用于不同的工業領域，如洗滌劑、油脂化學品、食品添加劑、生物柴油、紡織等[15-16]。然而，游離脂肪酶的工業應用通常因其容易失活、操作穩定性低和循環利用困難而受到阻礙，將其固定在合適的載體上可以有效地克服這些缺點，以改善酶的特性。

目前，脂肪酶固定化的各種載體及其性質已被廣泛研究。如，WANG等[17]研發了一種無表面活性劑、經濟和綠色的高分散Fe3O4@MIL-100(Fe)磁性核/殼復合微球，其具有合適的孔徑(7.07 nm)、高比表面積(137.27 m2/g)和高磁化強度(49.67 emu/g)。將假絲酵母脂肪酶作為模型酶固定在核殼微球上。發現固定化酶在65 ℃下水解橄欖油6 h后仍保持65%左右的初始活性；并且在第10次催化運行后，殘余活性仍保持初始活性的60%。這可能歸功于Fe3O4@MIL-100(Fe)大的表面積和孔徑以及MOFs中游離羧基和不飽和金屬中心的存在，使其具有較高的負載量。這與MOSAYEBI將七型假絲酵母脂肪酶固定在(3-辛基)三甲氧基硅烷功能化氧化石墨烯納米復合材料(GO-Fe3O4)的研究結果一致[18]。因此，Fe3O4核殼型磁性微球在環境保護、化學生物傳感器、納米電子學等領域有著廣闊的應用前景。

2.2 磁性Fe3O4納米粒子固定化蛋白酶

目前研究較多的蛋白酶主要有胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶等。酶解產物不僅可以增大蛋白的溶解性、乳化性等物理特性，還可以得到易于消化吸收，具有多種活性的功能性肽段，已被廣泛應用在生物、制藥和食品工業等領域[19]。

在蛋白質水解產物的生產中，游離形式的酶通常需加熱滅活，但加熱可能會使蛋白變性或促進聚集體的形成，而磁性Fe3O4納米粒子固定化酶可以通過磁性分離回收酶，消除了酶失活過程可能引起的潛在變化，并獲得無殘留酶的水解產物。如CAO等[20]制備一種由磁性Fe3O4納米粒子和一層金納米粒子組成的固定化載體。金納米粒子作為中間配體，將胰蛋白酶可逆地固定從而得到一種生物反應器，并將其用于標準蛋白質的消化。結果表明，與使用游離胰蛋白酶及常規固定化技術(如靜電相互作用、共價鍵合和形成金屬螯合物)相比，其酶催化效率更高。CHEN等[21]研究以殼聚糖和三聚磷酸鈉包覆的磁性納米粒子(Fe3O4@CSTPP)為載體，開發了一種新型高效的雙酶(堿性蛋白酶與胰蛋白酶)同步固定化方法，研究發現DE-Fe3O4@CS-TPP納米粒子具有較高的熱穩定性，在貯藏35 d后，其活性保持86%，連續重復使用10次后，仍保持60%以上的初始活性。DE-Fe3O4@CS-TPP納米粒子在米糠、核桃、紅小豆、玉米醇溶蛋白和酪蛋白等各種蛋白質水解過程中顯示出良好的水解度、產率，同時由其水解制備的蛋白肽具有更高抗氧化活性。

2.3 磁性Fe3O4納米粒子固定化漆酶

漆酶是一種分子質量為50～90 kDa的含銅多酚氧化酶，廣泛分布于真菌、植物、細菌和昆蟲中。它可以通過促進苯酚和二元胺的甲氧基取代來氧化多酚或其他具有類似多酚結構的底物[22]。然而，漆酶重復使用性差、穩定性差的缺點阻礙了漆酶的進一步應用。因此，漆酶的固定化引起了廣泛的關注和研究。

酶固定化技術可以提高酶的整體穩定性和回收能力，促進酶在更多領域的進一步應用。與大多數復雜繁瑣的酶固定化過程相比，ZHANG等[23]采用自組裝方法制備了載體Fe3O4@殼聚糖(Fe3O4@CS)復合納米粒子，并將漆酶共價固定Fe3O4@CS復合納米粒子，研究去除水中的氯酚效率。結果表明，固定化漆酶的比活性達到112.4 U，活性回收率為51.8%。與游離漆酶相比，固定化漆酶具有更高的耐酸堿度、熱穩定性和儲存穩定性，這可能是由于漆酶與載體之間的結合增加了結構剛性并減少了構象變化。隨著復合納米粒子制備技術不斷創新，CHEN等[24]首次提出同軸電噴霧制備核/殼復合納米粒子固定化漆酶降解銀杏酸的方法，固定化后漆酶在60～90 ℃熱穩定性較高，用其降解銀杏酸，速率常數(k)和時間(τ50)分別低于0.02 min-1和39 min，表現出良好的催化性能。此外在儲存21 d或重復使用5次后顯示出高于0.5的相對活性，具有良好的儲存穩定性和可重復使用性。隨著固定化酶技術的不斷發展，可實現漆酶的固定化，更有希望實現漆酶的工業化生產。

2.4 磁性Fe3O4納米粒子固定化其他酶

近年來，磁性納米材料已經成為重要的納米材料，被用來固定各種功能的酶，如淀粉酶、蝸牛酶、脫氫酶、葡萄糖苷酶、果膠酯酶、過氧化氫酶、內酰胺酶、碳酸酐酶等。

YILMAZ等[25]研究了α-淀粉酶固定在修飾的磁性碳納米管磁性納米粒子(α-淀粉酶-Fe3O4/多壁碳納米管)作為萃取劑對食品中金屬離子進行微萃取的可行性。在微萃取中發現，α-淀粉酶-Fe3O4/多壁碳納米管重復使用6次仍保持較高的萃取效率，砷的提取率高于95%，該方法已成功應用于不同大米和面粉樣品中砷含量的分析。LI等[26]合成了球形的50 nm羧化殼聚糖包裹的磁鐵礦納米粒子(Fe3O4@CYCTS)，并首次將其應用于蝸牛酶的固定化。結果顯示，在60 ℃孵育60 min后，固定化蝸牛酶的剩余活性為40.7%，約是游離酶的4倍。同時固定化酶在化學變性劑(2%十二烷基硫酸鈉、60%乙醇和6 mol/L尿素)的作用下仍保留了大部分初始活性。WANG等[27]將磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)固定在Fe3O4納米粒子上以提高其降解組胺的性能。發現固定化GAPDH在70 ℃時仍保持約31.4%的活性，同時固定化酶顯示出良好的可重復使用性(在5次使用循環后保留了近60%的活性)。固定化GAPDH降解了葡萄和黑樹莓酒80%以上的組胺，對酒成分的影響微乎其微，表明Fe3O4-GAPDH的酶促技術在降低發酵飲料中生物胺方面具有巨大潛力。

3 固定化酶在食品工業中的應用

3.1 在油脂改性中的應用

脂肪酶是一種能夠顯著提高油脂催化效率的綠色生物催化劑，在油脂工業中應用廣泛，可通過水解、氨解、酯化、酯交換等反應達到油脂改性的目的[28]。如GAO等[29]成功合成了單分散核殼型磁性有機硅納米花，并將其用作南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)共價固定化的載體。CALB@納米花可以有效地催化不同鏈長乙酰丙酸醇(正丁醇、正辛酸、正月桂醇)酯化反應合成乙酰丙酸烷基酯。回收10次后，CALB@納米花保留了85%以上的催化合成乙酰丙酸丁酯的初始活性和96%以上的催化合成長鏈烷基乙酰丙酸酯的初始活性，具有可調皺紋通道的疏水納米花的設計為酶的固定化開辟了一條新的途徑以提高酶的催化活性和穩定性。MIAO等[30]利用戊二醛活化法將脂肪酶成功固定在磁性Fe3O4納米粒子上，制備的固定化脂肪酶作為生物催化劑用于菜籽油與甲醇酯交換制備生物柴油。結果表明，在甲醇與油的摩爾比為6∶1的條件下，使用固定化脂肪酶作為催化劑，在45 ℃下反應24 h，轉化為脂肪酸甲酯的最大轉化率為89.4%，催化劑重復使用5次后，脂肪酸甲酯轉化率保持在70%。

3.2 在果汁澄清中的應用

鮮果汁中果膠、淀粉、纖維素和半纖維素等多糖成分在儲存過程中容易沉淀，形成混濁的果汁懸浮液，這是造成品質不佳的主要原因之一[31]。酶處理果汁可提高最終產品的產量、安全性、保質期和儲存穩定性，同時保持果汁固有的營養品質。DAL等[32]制備3種不同尺寸的磁性殼聚糖顆粒并用于果膠酶的固定和果汁的澄清。研究發現，在橙汁澄清過程中固定化果膠酶經過25次間歇循環后，仍保持85%的初始活性。LADOLE等[33]通過交聯將果膠酶和柚皮苷酶同時固定在環保型殼聚糖包覆磁性納米粒子上，并評價了共固定化生物催化劑對葡萄柚汁的澄清和脫苦效果。結果表明，葡萄柚汁濁度降低約52%，柚皮苷含量降低約85%。共固定化酶可循環使用7次，殘留活性為64%，在室溫下保存30 d，殘留活性為86%。目前已有將固定化酶技術應用于澄清蘋果汁、菠蘿汁、葡萄汁和胡蘿卜汁等的報道[34-35]。

3.3 在乳制品生產中的應用

牛乳含有3.3%～3.5%的蛋白質，營養豐富，是母乳最好的替代品。但牛乳中的蛋白質可能會引起過敏反應，影響嬰幼兒的生長發育，甚至威脅其生命。目前降低牛乳蛋白致敏性的主要方法是酶水解法，該法主要是通過蛋白質肽鍵的斷裂，將過敏蛋白水解成小分子肽段，破壞其過敏位點[36]，從而達到降低其致敏性的目的。FENG等[37]制備了Fe3O4納米粒子與Cu2(PO4)2·3H2O新型納米花催化材料，成功結合木瓜蛋白酶后水解牛乳致敏蛋白，SDS-PAGE顯示，隨著時間的增加，牛奶中的大部分致敏蛋白(β-乳球蛋白、α-乳白蛋白)在30 min時水解完全，酪蛋白也被大量水解，為低致敏性易消化牛奶的生產提供了一種新方法。

3.4 在食品檢測中的應用

隨著生活水平的不斷提高，消費者對食品安全越來越重視。因此，準確有效地分析食品以獲得有效的檢測結果是一個亟待解決的問題。在眾多檢測技術中，磁性納米粒子作為一種新的檢測方法已被證明是檢測食品安全的合適方法[38]。ZHANG等[39]提出了一種磁性石墨烯(G-Fe3O4)測定5種苯并咪唑類化合物(奧芬達唑、甲苯達唑、氟苯達唑、阿苯達唑和芬苯達唑)的新方法，并建立了基于G-Fe3O4磁性固相萃取和高效液相色譜聯用的方法。測定了雞肉、雞血和雞肝樣品中的痕量苯并咪唑，這些樣品中的奧芬達唑、甲苯達唑、氟苯達唑和芬苯達唑的濃度分別為13.0～20.2、1.62～4.64、1.94～6.42和0.292～1.04 ng/g。回收率為83.0%～115%，相對標準偏差小于7.9%。該方法靈敏、可靠，適用于食品中痕量苯并咪唑的分析。類似的，WANG等[40]開發了基于磁性沸石咪唑骨架-8(Fe3O4@ZIF-8)的簡易磁性固相萃取技術，Fe3O4@ZIF-8與高效液相色譜聯用為同時測定塑料包裝飲料和食品中的聚合物添加劑提供了一種有效的富集和測定方法。TONG等[41]構建了對5種鄰苯二甲酸酯(phthalic acid esters,PAEs)具有優異親和力、良好可重復使用性和快速分離的核殼Fe3O4@石墨碳亞微米立方體，并與高效液相色譜聯用，同時檢測飲料和塑料瓶中的5種痕量PAEs。這不僅建立了一種同時測定5種PAEs的有效方法，還為以低成本、可回收餐巾紙為碳源設計或構建磁性石墨碳包覆核殼材料開辟了新的策略。

3.5 在生物活性肽制備中的應用

生物活性肽因具有降膽固醇、降血壓、抗菌、抗氧化等生物活性而成為食品領域的研究熱點[42]。馬瑞娟等[43]采用磁性交聯酶聚集體技術制備的固定化酶酶解鳀魚蒸煮液制備蛋白多肽，并分析所制備水解肽的性能。分析酶解液的必需氨基酸指數>0.95，分子質量低于1 500 Da的小肽占82.52%，且具有較強的抗氧化性。KUAN等[44]將泛素樣特異性蛋白酶1(sfULP1)固定在結合谷胱甘肽的磁性納米顆粒上，然后切割泛素樣修飾物并獲得了胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)。GLP-1是一種低分子質量肽和腸促胰島素激素，具有抗高血糖潛力，對2型糖尿病治療有意義的肽激素。

4 展望

固定化酶以其高催化效率、高穩定性、可重復利用性已被廣泛應用于食品工業的多個領域，但從長遠發展來看，仍然有很多挑戰。一方面，大多數固定化酶種類主要是脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶等，而研究轉移酶類、裂合酶類和異構酶類等相對較少。另一方面，固定化酶的復合材料制備成本相對較高，比如MOFs和COFs材料等。因此，未來可著重探索新的固定化技術和載體，制備多種酶共同固定；探究固定機理，獲得具有高催化效應的新型固定化酶，降低生產成本，提高經濟效益。隨著生物技術、化學、材料等其他相關學科的發展，固定化酶將在食品、醫藥、環保等領域有更廣闊的應用前景。