EGCG上調Nrf2表達促進糖尿病小鼠創傷皮膚愈合①

李 迎 宋 宇 王 旭 張吉林 宋玉國 （北華大學附屬醫院，吉林 132011）

皮膚是機體表皮系統中的最大器官，具有保護組織、維持體內平衡、抵抗病原微生物感染和環境因子侵入等多種重要功能。傷口愈合遷延或速度減慢是皮膚創傷研究的重點。全身性疾病、氧化應激、缺血、免疫抑制、傷口局部促炎或抗炎癥細胞因子失衡等是傷口愈合慢性化的主要原因［1］。糖尿病傷口愈合障礙（diabetic non-healing wound，DNHW）是糖尿病最常見的危害性較大的并發癥，活性生物材料和水凝膠敷料的應用以及高壓氧等措施雖然為其治療展示了一定程度的療效，但最終效果仍不能令人滿意。在傷口的愈合階段，通過對一些轉錄因子激活路徑的檢測分析有助于理解慢性傷口愈合的分子機制［2］。核因子相關因子2［nuclear factor（erythroid-derived 2）-like 2，Nrf2］是一種關鍵轉錄因子，具有調控各種細胞抗氧化基因表達和抑制炎癥因子的功能［3］。因此，在研究DNHW 新的治療靶點上，研究者把焦點集中在尋找天然、高效的Nrf2 激活劑上。Nrf2-Keap1 通路是通過上調Nrf2 表達、降低氧化應激和降低炎癥細胞因子的主要通路［4］。一些植物含有的化合物如芹菜素、蝦青素、姜黃素、富馬酸二甲酯和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechingallate，EGCG）等均可通過 Nrf2-Keap1 通路調控氧化應激水平和抑制炎癥細胞因子表達［5-9］。本文在前期研究工作的基礎上［10-11］，進一步從整體水平上研究DNHW 小鼠應用EGCG 治療后，是否能上調創口皮膚組織Nrf2 的表達，通過Nrf2-Keap1 通路上相關指標的檢測探討EGCG 上調Nrf2表達治療慢性皮膚損傷的作用機制，為治療DNHW 尋找和證實新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級雄性 ICR 小鼠，5 周齡，體質量（20.05±1.50）g，來源于中國食品藥品檢定研究院，許可證號：SCXK（京）2017-0005，相關微生物檢測合格，健康狀態良好，飼養于吉林醫藥學院實驗動物室，實驗環境符合要求。

1.1.2 主要試劑和儀器 鏈脲佐霉素（STZ）、EGCG 購于Sigma 公司；動物組織總RNA 提取試劑盒、cDNA 合成試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司；PCR 擴增引物由生工（上海）科技有限公司合成；免疫組化抗體購于英國Abcam公司；熒光定量PCR擴增儀（德國羅氏480型）；多功能細胞成像儀（Bio-Tek Cytation5，美國）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠糖尿病模型和傷口愈合障礙模型的建立［11］小鼠腹腔注射 STZ（5 μg/μl），200 μl/d，連續5 d，空腹血糖≥13 mmol/L 者，視為小鼠糖尿病模型構建成功。在小鼠左后背靠近尾部，人工制造直徑約10 mm的皮膚創口，每只小鼠分籠飼養，隔日用標尺測量創口直徑，拍照記錄；糖尿病組創口愈合剩余面積明顯高于正常對照組，證明糖尿病傷口愈合障礙模型建立成功。尾靜脈取血，應用微量全血試紙法直接檢測空腹血糖，以STZ注射結束后2周為節點，判斷糖尿病建模是否成功。

1.2.2 EGCG 對小鼠糖尿病傷口愈合障礙的治療 正常對照小鼠40只，隨機分為正常對照（Control）組和正常對照+EGCG（Control+EGCG）組，20 只/組；糖尿病模型小鼠40 只，隨機分為糖尿病（DM）組和糖尿病+EGCG（DM+EGCG）組，20 只/組。EGCG 采用二甲基亞砜（DMSO）配制成 5 μg/μl 制劑，作為Control+EGCG 組和DM+EGCG 組的治療藥物，每天在創口處給藥10 μl；Control 組和DM 組每天在創口處給予 DMSO 10 μl；連續給藥 10 d，隔日觀察記錄傷口愈合情況，最后統計各組傷口情況。

1.2.3 皮膚樣品采集方法 上述實驗結束后，采用10%水合氯醛按小鼠體質量以40μl/g腹腔注射，做安樂死處理。小鼠死亡后，快速采集創口處皮膚組織。其中，準確稱取皮膚組織5 mg，立即加入300μl 裂解液中用于RNA 提取；其余皮膚組織浸泡于甲醛固定液中，固定后石蠟包埋備用于免疫組化檢測分析。

1.2.4 實時熒光定量PCR 檢測Nrf2 通路相關的氧化應激及炎癥指標mRNA 表達 將裂解液浸泡的皮膚組織用電動勻漿機打碎制成勻漿。按照試劑盒說明書操作提取總 RNA。以Oligo-（dT）15 為引物，以上述提取的RNA為模板合成cDNA。以cDNA為模板，分別加入表1 中的引物和U6 引物，進行熒光定量PCR 實驗，檢測mRNA 表達量。在PCR 儀上讀取每份樣本的Ct 值，以U6 為內參照，計算樣本中mRNA 的相對表達量。計算公式：RQ=2-ΔCt，其中ΔCt=CtmRNA-CtU6。所得RQ 值取對數后進行統計學分析。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.2.5 免疫組化技術檢測Nrf2 通路相關的氧化應激及炎癥指標 新鮮組織固定于10%甲醛24 h以上。依次進行梯度乙醇脫水。將浸好蠟的組織于包埋機內進行包埋。于切片機切厚度為5μm的切片，放于漂片機中展開，再將切片撈起置于載玻片上，編號，60 ℃烘烤5 h。做免疫組化實驗時，經脫蠟與水化、細胞通透與封閉、抗原修復與血清封閉等方法處理后依次，依次用一抗、二抗標記，最后顯色、復染和封片。多功能細胞成像儀拍照記錄。利用Image-Pro-Plus 6.0 軟件將所有檢測指標的表達水平量化為光密度值。

1.3 統計學處理 應用SPSS19.0軟件對所得結果進行分析，各組間的參數比較采用兩樣本t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠糖尿病模型和傷口愈合障礙模型的建模結果及EGCG 治療效果 小鼠皮膚造口后，連續觀察10 d，各組拍照記錄如圖1 所示。通過對糖尿病組和正常對照組創口愈合剩余面積進行統計學分析，結果證實，糖尿病組創口愈合剩余面積明顯高于正常對照組（P＜0.01），證明糖尿病傷口愈合障礙建模成功；在糖尿病小鼠中，EGCG 藥物治療組的創口愈合剩余面積明顯低于非治療組（P＜0.01），提示EGCG對糖尿病傷口愈合障礙有治療作用，見表2。

表2 各組創口愈合剩余面積統計分析（，mm2）Tab.2 Statistical analysis of residual area of wound healing in each group（，mm2）

表2 各組創口愈合剩余面積統計分析（，mm2）Tab.2 Statistical analysis of residual area of wound healing in each group（，mm2）

Note：Compared with Control group，1）P＜0.01；compared with DM group，2）P＜0.01.

10 d 7.26±1.70 6.78±1.90 17.54±3.131）10.31±2.742）Groups Control Control+EGCG DM DM+EGCG n 20 20 20 20 0 d 99.01±6.10 101.50±7.04 96.92±7.62 98.58±6.84

圖1 各組皮膚創口愈合圖Fig.1 Skin wound healing map of each group

2.2 各組Nrf2 通路相關的氧化應激指標及相關炎癥指標mRNA 表達結果 應用實時熒光定量PCR技 術 檢測 Nrf2、HO1、NQO1、ICAM-1、VCAM-1 和TNF-α 等 mRNA 的表達量，統計分析結果見圖 2，圖中的統計數據為RQ 值的對數。與Control 組相比，DM 組 Nrf2 的 mRNA 表達明顯降低（P＜0.01），Control組應用EGCG 治療后Nrf2的mRNA 表達上調不明顯（P＞0.05），而DM 組應用EGCG 治療后，Nrf2的mRNA表達明顯升高（P＜0.01）。與Control組相比，DM組HO1的mRNA表達明顯降低（P＜0.01）；與未應用 EGCG 治療組相比，Control 組和 DM 組應用 EGCG治療后 HO1 的 mRNA 表達均明顯升高（P＜0.01）。DM組NQO1的mRNA表達低于Control組（P＜0.05），Control 組 和 DM 組 應 用 EGCG 治 療 后 NQO1 的mRNA 表達均明顯升高（P＜0.01）。與Control 組相比，DM組ICAM-1的mRNA表達明顯升高（P＜0.01），Control 組應用 EGCG 治療后 ICAM-1 的 mRNA 表達量下降不明顯（P＞0.05），而DM 組應用EGCG 治療后 ICAM-1 的 mRNA 表達明顯降低（P＜0.01）。與Control組相比，DM 組 VCAM-1 的mRNA 表達明顯升高（P＜0.01），Control 組和 DM 組應用EGCG 治療后VCAM-1 mRNA 表達均明顯降低（P＜0.01）。DM 組TNF-α 明顯高于 Control 組（P＜0.01），Control 組應用EGCG 治療以后 TNF-α 的 mRNA 表達下降不明顯（P＞0.05），而 DM 組應用 EGCG 治療后 ICAM-1 的mRNA表達明顯降低（P＜0.01）。

圖2 實時熒光定量PCR檢測各組mRNA表達Fig.2 mRNA expressions were detected by real-time fluorescence quantitative PCR in each group

2.3 各組Nrf2 通路氧化應激免疫組化結果 應用免疫組化技術檢測皮膚組織中Nrf2、HO1、NQO1 蛋白和3-NT的表達情況，形態學檢測結果和統計分析結果見圖3，圖中的統計數據為光密度值。與Control組相比，DM 組Nrf2 蛋白表達明顯降低（P＜0.01），Control 組和 DM 組應用 EGCG 治療后 Nrf2 的蛋白表達均升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與Control組相比，DM 組HO1 和NQO1 蛋白表達降低，差異有統計學意義（P＜0.05），Control 組和 DM 組應用EGCG 治療后HO1 和NQO1 蛋白表達量均明顯升高（P＜0.01）。與Control 組相比，DM 組3-NT 表達明顯升高（P＜0.01）；Control 組應用EGCG 治療后3-NT 表達有所下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；而DM 組應用EGCG治療后3-NT表達明顯下降（P＜0.01）。

圖3 各組 Nrf2、HO1、NQO1 和 3-NT 免疫組化檢測結果（免疫組化染色，×200）Fig.3 Immunohistochemical results of Nrf2，HO1，NQO1 and 3-NT in each group（Immunohistochemical staining，×200）

2.4 各組炎癥因子指標免疫組化結果 應用免疫組化技術檢測皮膚組織中ICAM-1、VCAM-1和TNF-α的表達情況，形態學檢測結果和統計分析結果見圖4，圖中的統計數據為光密度值。與Control 組相比，DM組ICAM-1、VCAM-1和TNF-α蛋白表達明顯升高（P＜0.01）；Control 組應用 EGCG 治療后 ICAM-1、VCAM-1和TNF-α蛋白表達有所降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；DM 組應用 EGCG 治療后 ICAM-1、VCAM-1和TNF-α蛋白表達均明顯降低（P＜0.01）。

圖4 各組ICAM-1、VCAM-1 和TNF-α 免疫組化檢測結果（免疫組化染色，×200）Fig.4 Immunohistochemical results of ICAV-1，VCAM-1，and TNF-α in each group（Immunohistochemical staining，×200）

3 討論

在慢性傷口修復過程中，由于復雜的細胞和分子活動導致傷口愈合延遲，愈合速度緩慢［12］。氧化應激、全身疾病、創傷、免疫抑制、缺血、傷口部位促/抗炎細胞因子、白細胞介素、白三烯和補體因子之間的失衡以及細胞外基質蛋白（ECM）的缺乏是延長慢性傷口愈合過程的主要原因［13］。一些常見的慢性傷口包括糖尿病足潰瘍、壓瘡和靜脈潰瘍［14］。

糖尿病患者血糖控制不佳，機體處于高血糖狀態，末梢神經和外周動脈發生病變，皮膚組織長期處于高氧化應激狀態是包括糖尿病足潰瘍（diabetic foot ulcers，DFU）在內的 DNHW 的 主 要原因［15］。DFU 是糖尿病的一種危害性并發癥，足部皮膚組織破裂接觸外界病原體導致傷口愈合受損。在傷口愈合的不同階段激活相關的轉錄因子是DFU 治療的有效策略［2］。Nrf2 是一種關鍵的轉錄因子，具有調節細胞抗氧化基因表達和抑制炎癥因子的作用［3］。在基礎條件下，Nrf2 與 Keap1 結合并形成Nrf2-Keap1-Cul3-E3 泛素連接酶復合物，應用有效的Nrf2 激活劑后引起Keap1-Cul3-E3 泛素連接酶的構象改變，Nrf2 釋放，誘導抗氧化基因的轉錄，最終減少細胞氧化應激［4］。其下游靶點主要包括NQO1、谷胱甘肽-S 轉移酶（GST）、過氧化氫酶（CAT）、HO1等，具有消除有毒化合物、分解過氧化氫和促進血紅素分解代謝的功能［16］。另外，高血糖狀態下，在氧化應激導致細胞損傷的過程中還可引起炎癥因子釋放、細胞再生障礙、血流動力學改變，加劇了皮膚組織結構重塑障礙。因此，尋找天然、無毒且高效的Nrf2 激動劑是開發DNHW 治療藥物的有效策略。目前所知，Nrf2 有多種激動劑，其中EGCG 具有天然、無毒、高效等優點。本文在前期研究的基礎上，重點研究EGCG 上調Nrf2 表達促進糖尿病小鼠創傷皮膚愈合的作用機制，包括Nrf2 被EGCG 激活后上調抗氧化應激指標和降低炎癥指標。研究結果表明，糖尿病組小鼠創傷的皮膚組織中Nrf2、HO1和NQO1 的mRNA 表達量明顯低于正常對照組，而ICAM-1、VCAM-1 和 TNF-α 的 mRNA 表達量明顯高于正常對照組；免疫組化檢測得到了同樣的結果，從蛋白表達的層面上做了進一步驗證。DNHW 模型構建成功以后，重點研究EGCG 對傷口的治療，前期研究證明了EGCG 糖尿病小鼠的創口具有明顯的治療作用。在此基礎上本文重點研究了EGCG 是否具有上調Nrf2 的作用，以及促進糖尿病小鼠創口愈合的作用機制如何。研究結果證明，無論是從mRNA 表達層面還是從蛋白質表達層面，EGCG 均具有上調Nrf2 的作用，Nrf2 上調后可發揮促進抗氧化應激指標上調和降低炎癥指標的作用。綜上，EGCG 具有上調Nrf2表達、促進糖尿病小鼠創傷皮膚愈合的作用，是治療DNHW 的理想藥物。但以EGCG 為治療藥物，在劑型、劑量以及毒副作用等方面還需進行更加深入的研究，以期早日實現臨床應用。