基于網絡藥理學的雷公藤干預Graves眼病潛在靶點預測及作用機制分析

張國玉

內黃縣中醫院，河南 內黃 456300

Graves眼病(graves ophthalmopathy，GO)又稱浸潤性突眼、甲狀腺相關性眼病，是格雷夫斯病(graves disease，GD)的甲狀腺外并發癥，占GD的25%～50%[1]。GO患者以眼內異物感、脹痛、畏光、流淚、復視、視力減退為主要癥狀，嚴重者因眼瞼閉合不全、角膜外露而形成角膜潰瘍、全眼炎，甚至失明，不僅影響患者的生活質量，還對外貌及心理狀況產生巨大影響[2]。糖皮質激素是治療Graves眼病的主要方法，尤其是對活動性中重度患者。雷公藤素有“中草藥激素”之稱，一項薈萃分析表明，雷公藤有效提取物雷公藤多苷治療該病療效顯著，且不良反應較少[3]。網絡藥理學融合了醫學、計算生物學、生物信息學、網絡分析等多學科，實現從藥物成分到疾病靶點、基因、途徑的綜合網絡分析，闡述藥物對疾病的作用機制。本研究采用網絡藥理學方法分析雷公藤治療Graves眼病的作用機制，希冀為雷公藤制劑治療Graves眼病的基礎實驗研究及臨床研究提供方向和理論。

1 材料與方法

1.1 雷公藤相關靶點篩選通過中醫藥系統藥理學平臺[4]尋找雷公藤化學組成成分，根據口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%[5]、類藥性(drug-likeness，DL)≥ 0.18[6]的2個藥代動力學屬性值進行活性成分初步篩選，以獲得活性化合物及活性成分的預測蛋白質靶點。篩選結束后，在Uniprot蛋白質數據庫(https：//www.uniprot.org)將活性成分預測的蛋白質靶點進行規范。

1.2 Graves眼病相關靶點篩選以“Graves Ophthalmopathy”為疾病名，挖掘GeneCards數據庫(https：//www.genecards.org)中與Graves眼病相關的基因。在Genecards數據庫中，Score值越高，表示該靶點與疾病聯系越密切。根據經驗，多設定Score大于中位數的靶點為潛在靶點[7]。在OMIM數據庫(http：//www.omim.org)、TTD數據庫(http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)、DisGeNET數據庫(https：//www.disgenet.org/home/)中以“Graves Ophthalmopathy”為疾病名獲得疾病靶點予以補充。剔除重復值后，獲得Graves眼病靶點基因。

1.3 靶蛋白互相作用網絡構建為明確雷公藤相關靶點與Graves眼病靶蛋白之間的相互作用，利用Venn在線作圖(http：//www.bioinformatics.com.cn/)篩選出二者交集靶點并繪制韋恩圖。進而將交集靶點在STRING平臺(https：//string-db.org/)構建靶蛋白互相作用(protein-protein interaction,PPI)網絡模型[8]，將蛋白種類設置為“Homo sapiens”進行操作，最低相互作用閾值設為“medium confidence=0.4”，其他參數保持默認設置，得到PPI網絡。并通過 CytoScape3.7.2軟件的分析功能進行研究[9]。

1.4 基因本體(gene ontology,GO)富集分析和京都基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析為了說明雷公藤活性成分的靶點蛋白在基因功能中的作用及在信號通路中的作用，本研究采用David 6.8數據庫[10-11](https：//david.ncifcrf.gov/)對韋恩圖中的交集靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

1.5 雷公藤成分-Graves眼病靶點-通路網絡圖的構建運用 CytoScape 3.7.2構建雷公藤成分-Graves眼病靶點-通路網絡圖，利用CytoScape 3.7.2軟件的“Network Analysis”功能分析有效成分及靶點的網絡拓撲參數，包括連接度(degree)、介度(betweenness)及緊密度(closenesss)等，并根據網絡拓撲學參數判斷核心靶點及發揮藥效的主要活性成分。

1.6 分子對接驗證分析雷公藤的主要活性成分和主要靶點，對其進行分子對接驗證。查找或者化學繪圖制作活性成分的mol2文件，查找靶蛋白PDB ID。應用SYBYL-X2.0分子對接軟件將靶點與活性成分進行對接，根據Total Score評價靶點與活性化合物的結合度。

2 結果

2.1 雷公藤活性成分靶點的獲取通過檢索TCMSP數據庫，共檢索到活性成分144個，根據藥代動力學屬性值OB、DL篩選到活性成分51個，刪除無疾病預測靶點活性成分23個，共獲得活性成分28個，具體見表1。在TCMSP數據庫中共獲得靶點143個。

表1 雷公藤主要成分

2.2 Graves眼病靶點的獲取從Genecards數據庫獲得Graves眼病靶點294個。根據經驗設定Score大于中位數的目標靶點為其潛在靶點，如通過GeneCards所得Graves眼病靶點Score最大值為55.59，最小值為0.26，中位數為2.79，故設定 Score>2.79的靶點為Graves眼病的潛在靶點。結合OMIM、DisGeNET、TTD數據庫補充相關靶點，合并后刪除重復值，最終得到150個Graves眼病靶點。

2.3 網絡構建結果將篩選的雷公藤活性成分靶點與Graves 靶點成分利用Venn在線作圖繪制韋恩圖，具體見圖1，并得到交集靶點19個。將19個交集靶點在STRING平臺，構建靶蛋白相互作用網絡圖，導出TSV文件，導入CytoScape 3.7.2軟件，進行無向、無自身網絡分析：該網絡共有18個節點(1個未參與)，107條邊，網絡平均鄰節點數為11.889。利用該19個交集靶點逆向反推雷公藤活性成分，制作xls格式文件，導入CytoScape 3.7.2軟件，得到雷公藤活性成分-靶點-疾病網絡，見圖2。根據度值和介數指標，篩選出關鍵靶蛋白(PTGS2、ADRB2、NR3C1、PPARG、BCL2)，提示這些蛋白在雷公藤藥理機制中發揮關鍵作用，其中PTGS2在網絡中的連接度為23，介度為0.301 5，緊密度為0.671 9，預測PTGS2為雷公藤治療Graves眼病的最主要靶點。

圖1 雷公藤成分-Graves眼病靶點韋恩圖

注：紫色菱形代表雷公藤，粉紅色矩形為雷公藤的活性成分，淺藍色六邊形為蛋白靶點，深藍色為Graves眼病；節點的面積代表其度數大小

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析應用David 6.8數據庫對韋恩圖中交集靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能分析：根據錯誤發現率(false discovery rate，FDR)<0.05，共得到分子功能條目2個，為細胞因子活性、生長因子活性；細胞組分條目3個，為質膜外側、細胞外間隙、細胞表面；生物過程條目50個，包含炎癥反應、免疫應答、白細胞黏附、氧化氮生物合成過程正調控、MAP激酶活性正調節、蛋白質磷酸化正調節等。KEGG通路富集分析共富集出39條通路與雷公藤改善Graves眼病的功效相關，根據 FDR<0.05共得到30條通路，主要包括核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路、細胞黏附分子、Toll樣受體信號通路、TNF信號通路、TGF-β信號通路等，具體可見圖5。Kappa值表示兩個相關對象吻合率，在David 6.8數據庫中Kappa分0.75～1.00表示相關性非常高，0.50～0.75表示相關性高，0.25～0.50表示相關性中等，小于0.25表示相關性低，予以舍去。以分子功能細胞因子活性、生長因子活性、細胞組成質膜外側、細胞外間隙、細胞表面與其他GO富集數據、KEGG富集數據kappa值為依據，舍去相關性低的數據，取5者交集數據，并滿足 FDR<0.05，GO富集分析見圖3，KEGG分析見圖4。

圖3 雷公藤改善Graves眼病的GO富集分析條形圖

圖4 雷公藤改善Graves眼病的KEGG分析氣泡圖

2.5 雷公藤成分-Graves眼病靶點-通路網絡圖的構建運用CytoScape 3.7.2構建雷公藤成分-Graves眼病靶點-通路網絡，見圖5。通過 CytoScape 3.7.2分析，得到核心成分和靶點。CytoScape網絡分析表明，雷公藤甲素連接度(degree)為12，介度(betweenness centrality)為0.1669，緊密度(closeness centrality)為0.5317，預測雷公藤甲素為雷公藤治療Graves眼病的主要成分，其次為山柰酚、川陳皮素、β-谷甾醇、3-(5，8-二羥基-2-氧代苯并吡喃-7-基)-2-羥基-5-甲基苯并吡喃-4-酮、異落葉松脂素，具體見表2。PTGS2、TNF在網絡中的連接度為26，預測其為雷公藤改善Graves眼病的最主要靶點。IFNG、TGF-β1、CD40、CD86等亦為相對重要的靶點，具體見表3。

表2 雷公藤主要活性成分網絡節點特征參數

表3 靶點蛋白網絡節點特征參數

注：粉紅色矩形為雷公藤的活性成分，淺藍色六邊形為蛋白靶點，綠色三角形為通路；節點的面積代表其度數大小

2.6 分子對接SYBYL性能穩定、專業度高，為分子模擬和藥物設計的首選工具。SYBYL使用原型分子表示結合口袋，小分子配體探測蛋白口袋的疏水、氫鍵、靜電，形成蛋白質活性口袋的負像，通過氫鍵受體和供體、疏水位置匹配進行打分，分值越大，表示結合作用越好，一般認為，評分≥4分表示存在結合作用，≥6分有較好活性[12]。雷公藤的主要活性成分為雷公藤甲素、山柰酚、川陳皮素和β-谷甾醇，主要靶點為PTGS2、TNF、IFNG、TGF-β1、CD40、PPARG、ICAM1，對其活性成分和靶點進行分子對接驗證。結果顯示，評分≥4分者占總數92.9%，≥6分者占32.1%，即大部分靶點與成分存在結合活性，分子對接結果見圖6。

圖6 分子對接結果

3 討論

中藥材雷公藤為衛矛科植物雷公藤的根、葉及花，具有祛風除濕、活血通絡、消腫止痛、殺蟲、消炎、解毒的功效。臨床上多種雷公藤制劑，如雷公藤片、雷公藤總萜片、雷公藤雙層片、雷公藤多苷片，在類風濕性關節炎、腎病綜合征等自身免疫性疾病中應用廣泛。雷公藤成分-靶點-Graves眼病網絡顯示了引起Graves眼病的靶點眾多，靶點之間關系復雜。因此，針對中藥多成分、多靶點和復雜的發病機制特點，采用網絡藥理學分析有利于從分子水平闡明其作用機制。Graves眼病是免疫細胞和成纖維細胞相互作用，形成交叉的免疫反應，產生的抗TSHR、IGF-1R自身抗體使成纖維細胞活化并分泌各種細胞因子，如干擾素γ(interferon，IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6(interleuki-6，IL-6)、IL-8、IL-10等，從而導致免疫細胞進一步聚集和活化[13]。雷公藤成分-靶點-Graves眼病網絡與雷公藤成分-Graves眼病靶點-通路網絡均顯示雷公藤甲素、山柰酚、川陳皮素、β-谷甾醇為改善Gravse眼病的主要成分。燕樹勛等[14]實驗證明了雷公藤甲素抑制眼球后成纖維細胞的增生，抑制IFN-γ誘導的CD40的表達。NF-κB調節著TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β和其他細胞因子的表達[15]。雷公藤甲素還可抑制轉錄因子NF-κB活性[16]，抑制TNF-α的表達[17]。山柰酚作為膳食抗感染劑被研究[18]，在嚙齒類動物非特異性急性炎癥中，β-谷甾醇被證明具有較強的抗感染能力[19]，川陳皮素能夠通過抑制TGF-β1來抑制成纖維細胞的生長和纖維化[20]。因此雷公藤可能主要通過雷公藤甲素、山柰酚、川陳皮素、β-谷甾醇等改善Graves眼病。

本研究結果表明，雷公藤改善Graves眼病的靶點主要集中在前列素內環氧化物合成酶2(prostaglandin endoperoxide synthase2 PTGS2)、TNF、干擾素γ、TGF-β1、CD40、氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)、 細胞黏附分子1(cell adhesion molecule 1，CAM1)。PTGS2又稱COX2，在正常組織細胞內的活性極低，在炎癥細胞中的表達水平較高，引起炎癥部位PEG2含量的增加，導致炎癥反應和組織損傷。Graves眼病患者眼眶組織炎性因子的釋放增多，增加纖維細胞的浸潤并增加PGE2的釋放，PGE2又可以通過增加血管的通透性而進一步加重病情，塞來昔布作為COX2抑制劑，可以抑制PGE2的釋放，改善患者的局部癥狀和體征[21]，同時也拮抗PPARγ。PPARG與Graves眼病患者眼眶部的脂肪增殖、分化相關，將PPARγ激動劑噻唑烷二酮類 (羅格列酮)作用于患者部眼眶成纖維細胞，能刺激脂肪細胞的分化和TSHR的表達[22]。而抑制PPARγ途徑則減少人體前脂肪細胞分化和細胞內的脂質積累，減少眼眶部脂肪增殖，延緩病情進展[23]。TGF-β能促進成纖維細胞的生長，TGF-β1在分子水平上促使Graves眼病患者眼眶組織成倍增多，引起纖維化癥狀[24]，Li等[25]通過抑制TGF-β1而減輕眼眶細胞的纖維化。眼眶成纖維細胞受IFN-γ的刺激而上調表達CD40，啟動CD40-CD40L信號通路，刺激眼眶成纖維細胞高表達ICAM-1，而高表達ICAM-1的成纖維細胞因受黏附作用而促進炎癥發生[26]。

由雷公藤成分-Graves眼病靶點-通路網絡可知，NF-κB信號通路為主要的信號通路之一，是免疫和炎癥反應的基礎[27]。活性氧可以釋放TNF-α、IL-1、TNF-α、IL-6，刺激NF-κB，使病情進展[28]，而糖皮質激素則抑制NF-κB通路，起到改善病情的作用。

雷公藤改善Graves眼病的KEGG分析顯示，其作用通路與炎癥性腸病通路關系密切。炎癥性腸病是感染性微生物和免疫系統失調引起的胃腸道慢性炎癥，腸腔的環境最為關鍵，微生物成分如鞭毛蛋白、肽聚糖和脂多糖可被TLR識別觸發NF-κB的激活，導致炎癥反應[29]。而腸腔環境的變化，與甲狀腺疾病的發生同樣密切相關，如甲狀腺功能亢進患者的雙歧桿菌和乳桿菌明顯減少，腸球菌增加[30]。炎癥性腸病通路有Th17細胞參與，Th17細胞在Graves眼病的發生、發展中同樣發揮著重要作用，Fang等[31]研究表明，疾病在活動期時Th17細胞數量增多，伴隨著病情的緩解，Th17細胞數量逐漸下降。Graves眼病同樣與TLR信號通路關系密切，推測Graves眼病的發病與腸道微生物關系密切，具體機制仍需進一步研究。

研究結果表明，雷公藤的一種活性成分可以調控多個靶點，而同一靶點可干預多種生物過程及信號通路，體現了雷公藤多靶點、多通路的聯合作用。提示雷公藤的活性成分可通過重要靶點對網絡進行全部或者局部調節，起到改善Graves眼病的作用，同時預測了雷公藤通過調控腸道微生物改善Graves眼病的潛在作用機制。由于網絡藥理學的局限性以及中藥成分進入人體后反應的復雜性，仍需后續進行動物或細胞實驗加以驗證。