枇杷EjNAC82的克隆及其對類胡蘿卜素合成基因EjPSY、EjBCH的轉(zhuǎn)錄激活分析

柴吉釧 王 康 楊民杰 董婉琪 曹士鋒 陳 偉 楊震峰 施麗愉

(浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100)

類胡蘿卜素是一類重要的植物色素，由8個類異戊二烯單位組成，具有多烯鏈[1-2]。類胡蘿卜素廣泛存在于自然界，目前已發(fā)現(xiàn)的類胡蘿卜素多達(dá)800余種[3-4]，該類物質(zhì)廣泛存在于植物器官并參與多個生物過程，同時其在維持人類健康方面也發(fā)揮著重要作用[5]。其中β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)是人體日常所需維生素A的前體[6-7]，能在人體或動物體內(nèi)合成維生素A，其抗氧化活性在預(yù)防眼疾等方面具有一定作用[8]。類胡蘿卜素可降低許多慢性病的患病風(fēng)險，而人體不能自主合成類胡蘿卜素，依賴飲食攝入，因此類胡蘿卜素含量較高的果蔬備受消費者喜愛，如何提高果蔬中類胡蘿卜素的含量也成為研究熱點[9-11]。

長期以來，通過各種研究方法已經(jīng)分析構(gòu)建了植物類胡蘿卜素代謝途徑。類胡蘿卜素的合成開始于MEP途徑生成的雙(牻牛兒基)二磷酸鹽(geranylgeranyl diphosphate，GGPP)，通過八氫番茄紅素合成酶(phytoene synthase，PSY)、八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene dehydrogenase，PDS)、ζ-胡蘿卜素脫氫酶(ζ-carotene desaturase，ZDS)、ζ-胡蘿卜素異構(gòu)酶(ζ-carotene isomerase，ZISO)催化的一系列去飽和反應(yīng)和異構(gòu)化反應(yīng)形成番茄紅素[10-11]。再經(jīng)番茄紅素β-環(huán)化酶(lycopene β-cyclase，LCYB)和番茄紅素ε-環(huán)化酶(lycopene ε-cyclase，LCYE)催化合成α-胡蘿卜素，或經(jīng)LCYB或有色體特異番茄紅素β-環(huán)化酶(chromoplast-specific lycopene β-cyclase，CYCB)合成 β-胡蘿卜素。番茄紅素環(huán)化產(chǎn)生的α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素分別形成α-和β-兩個分支[6]。隨后，在β-胡蘿卜素羥化酶(β-carotene hydroxylase，BCH)的催化作用下，將α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素羥化，在α分支中生成葉黃素，在β分支中生成玉米黃質(zhì)。玉米黃質(zhì)通過玉米黃質(zhì)環(huán)氧酶(zeaxanthin epoxidase，ZEP)和堇菜黃素脫環(huán)氧酶(violaxanthin deepoxidase，VDE)的環(huán)氧化和脫環(huán)氧化作用形成葉黃素循環(huán)[6]。而枇杷果實中類胡蘿卜素的降解主要是β-胡蘿卜素在裂解雙加氧酶(carotenoid cleavage dioxygenases，CCD)的作用下降解生成β-環(huán)檸檬醛和β-紫羅酮[2]。前人研究已克隆得到了胡蘿卜[12]、蜜柚[13]、桃[14]、草莓[15]等果實的類胡蘿卜素代謝關(guān)鍵酶基因，并進行了表達(dá)分析。

轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合特定的DNA序列，調(diào)控目的基因表達(dá)，從而調(diào)控各種生物過程[16]。NAC是高等植物中最大且研究最廣泛的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[17]。NAC的命名由最初在牽牛花中發(fā)現(xiàn)的NAM(no apical meristem)、擬南芥的ATAF(Arabidopsis transcription activation factor)和CUC(cup-shaped cotyledon)三個名稱的縮寫各取首字母構(gòu)成。NAC轉(zhuǎn)錄因子由N端一個保守性極強的NAC結(jié)構(gòu)域和C端極不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄激活域組成[18]。其中，NAC結(jié)構(gòu)域由150個氨基酸殘基組成[19]，包含5個亞結(jié)構(gòu)域，而C端可變結(jié)構(gòu)域可以通過調(diào)節(jié)NAC轉(zhuǎn)錄因子與各種靶蛋白的相互作用，賦予NAC蛋白不同的功能[17]。在高等植物中，轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成后，通過核孔運輸至細(xì)胞核內(nèi)，再與目的基因的啟動子結(jié)合以調(diào)控基因的表達(dá)。Gong等[20]通過亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)梭梭(Haloxylonammodendron)HaNAC1蛋白定位于細(xì)胞核；另有研究從番木瓜(CaricapapayaLinn)果實中鑒定出CpNAC1在細(xì)胞核中起轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[21]。目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物的不同組織中均有表達(dá)，在植物的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。番茄(Solanumlycopersicum)中SlNAC1在根、莖、葉、花、幼果和種子中有表達(dá)，且在花、幼果和種子中顯示較高的表達(dá)水平[22]；梭梭中HaNAC1在根、莖、葉、種子等組織器官中廣泛表達(dá)，且在莖中表達(dá)量最高[20]。高等植物中不同的轉(zhuǎn)錄因子可以通過結(jié)合類胡蘿卜素代謝相關(guān)基因啟動子上的不同元件，在轉(zhuǎn)錄水平上對基因的表達(dá)進行調(diào)控，從而調(diào)控植物中總類胡蘿卜素的積累[23]。已有研究表明，NACBS是NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控類胡蘿卜素的典型的識別序列。番木瓜(CaricapapayaL.)CpNAC1可以作用于PDS2/4啟動子的NACBS(CGTG/A)位點，上調(diào)PDS2/4 基因的表達(dá)，從而增加類胡蘿素的積累[21]。Fu等[23]也發(fā)現(xiàn)，CpNAC2識別并作用于PDS2/4、ZDS、LCYB、BCH啟動子上的CGTG/A位點，正調(diào)控類胡蘿卜素的合成。

枇杷(EriobotryajaponicaLindl.)隸屬于薔薇科，是一種非呼吸躍變型果實。成熟的枇杷是多酚、維生素C、 類胡蘿卜素、類黃酮等天然抗氧化物的優(yōu)良來源[7]。類胡蘿卜素是枇杷的主要呈色色素，根據(jù)類胡蘿卜素組成成分、含量的差異，枇杷可分為紅肉枇杷和白肉枇杷兩大類[9]。類胡蘿卜素在高等植物中的累積是多種因素(包括環(huán)境因素、類胡蘿卜素代謝途徑相關(guān)基因的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控等)共同調(diào)控的結(jié)果。鄭婷婷等[24]研究早鐘6號和白玉兩個枇杷品種果實在成熟期間類胡蘿卜素的積累變化，發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素的積累可能受到PSY、LCYE、LCYB、BCH、CYCB等基因的共同調(diào)控；Fu等[6,25]也發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素在不同品種枇杷中的積累受到PSY、CYCB和BCH基因的調(diào)控。由上述及其他大量研究表明，枇杷果實中類胡蘿卜素的積累受代謝途徑關(guān)鍵酶基因的調(diào)控，但轉(zhuǎn)錄因子對枇杷果實中類胡蘿卜素的調(diào)控作用相關(guān)研究鮮有報道。

迄今為止，多數(shù)關(guān)于NAC轉(zhuǎn)錄因子功能的研究集中于植物生長發(fā)育、抗病、抗衰老和響應(yīng)非生物脅迫等方面的作用，有關(guān)NAC轉(zhuǎn)錄因子對植物中類胡蘿卜素合成調(diào)控方面的研究較少。因此本研究以大紅袍(紅肉枇杷)和白沙(白肉枇杷)為試驗材料，利用轉(zhuǎn)錄組測序(RNA Sequencing，RNA-Seq)技術(shù)對大紅袍和白沙進行轉(zhuǎn)錄組測序，初步篩選并克隆出1個枇杷NAC轉(zhuǎn)錄因子，命名為EjNAC82，對其進行生物信息學(xué)和亞細(xì)胞定位分析。利用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)技術(shù)分析EjNAC82在枇杷不同組織中的表達(dá)情況及其在兩個品種枇杷果實成熟過程中的表達(dá)差異。通過啟動子克隆技術(shù)克隆得到枇杷果實類胡蘿卜素代謝關(guān)鍵酶基因啟動子，并進行啟動子元件分析，再進一步利用LUC/REN雙熒光素酶試驗探究NAC轉(zhuǎn)錄因子對類胡蘿卜素代謝關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，旨在為揭示NAC轉(zhuǎn)錄因子對枇杷果實中類胡蘿卜素積累的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗采用大紅袍(紅肉枇杷)和白沙(白肉枇杷)兩個枇杷品種，均采自浙江省寧波市象山縣新橋鎮(zhèn)枇杷園。采集枇杷根、芽、嫩葉、老葉、嫩枝、老枝、幼果、熟果不同的組織樣。按照果實的成熟度，將果實發(fā)育期分為5個時期：S1期，未轉(zhuǎn)色期，花開后92～98 d；S2期，轉(zhuǎn)色期，112～114 d；S3期，褪綠期，115～120 d；S4期，黃熟期，118～122 d；S5期，成熟期，124～128 d[26]。按以上果實成熟的不同時期，分批摘取，選用大小形狀均勻的果實。將采收的樣品果實的頂部和底部快速除去，準(zhǔn)確地分離其果皮、果肉，并將不同樣本立刻分別放入不同用液氮預(yù)冷并裝滿液氮研缽中進行冷凍，隨后置于-80℃超低溫冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 枇杷果實與不同枇杷組織RNA的提取及cDNA的合成 本試驗采用植物RNA提取試劑盒(Omega Bio-Tek公司，美國)提取兩品種枇杷果實(果皮、果肉)和1.1步驟中采集的其他枇杷組織的總RNA，具體過程參照試劑盒說明書進行。試驗過程中加入DNaseI(Omega Bio-Tek公司，美國)以去除總RNA中微量DNA污染，以備后續(xù)cDNA合成。本試驗中RNA樣品濃度和純度的測定使用NanoDrop 2000核酸蛋白分析儀(Thermo Fisher Scientific，美國)。通過凝膠成像儀(Bio-Rad，美國)觀察提取RNA條帶的完整性、大小和清晰度。按照SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司，江蘇)說明書進行cDNA合成。

1.2.2 枇杷果實NAC轉(zhuǎn)錄因子的克隆 將轉(zhuǎn)錄組測序所得的NAC轉(zhuǎn)錄因子序列在NCBI上進行BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對，發(fā)現(xiàn)與其他物種(4個物種以上)中的NAC長度相同，表明這個NAC轉(zhuǎn)錄因子為全長序列，命名為EjNAC82，再采用ORF Finder程序分析基因的開放閱讀框(open reading frame, ORF)，驗證所獲得ORF的正確性。將上述NAC轉(zhuǎn)錄因子利用逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)技術(shù)，以提取的cDNA作為模板，克隆得到EjNAC82基因的ORF序列。

PCR反應(yīng)體系共10 μL: ddH2O 5.8 μL，dNTP Mix 0.2 μL，SF Buffer 2 μL，250 ng·μL-1cDNA模板1 μL，上下游引物各0.4 μL，Phanta Super-Fidelity DNA pdynerase 0.2 μL。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3 min；95℃變性8 s，51℃退火30 s，72℃延伸(延伸時間為30 s·kb-1)，33次循環(huán)；72℃終延伸10 min。待PCR反應(yīng)結(jié)束后，通過電泳檢測其純度并回收純化，所得產(chǎn)物通過TA克隆反應(yīng)與pMD18-T連接成重組載體，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、篩菌、搖菌、提質(zhì)粒得到陽性克隆子，送上海華大基因進行測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 利用在線工具Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)對轉(zhuǎn)錄因子編碼蛋白的理化性質(zhì)(包括分子量、等電點、酸堿氨基酸組成、脂溶性指數(shù)、親水系數(shù)等)進行預(yù)測；通過在線工具Protcomp 9.0進行亞細(xì)胞定位預(yù)測；利用NCBI網(wǎng)站的BLAST工具進行同源性比對分析，用clustalx 1.83、GeneDoc和MEGA 5.1軟件進行同源序列比對、氨基酸序列分析和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。

1.2.4 亞細(xì)胞定位 重組載體構(gòu)建：以cDNA為模板，使用CE Design(Vazyme生物公司專用引物設(shè)計軟件)進行目的基因特異性引物設(shè)計，利用高保真酶Phanta? Super-Fidelity DNA Polymerase(Vazyme，南京)進行PCR擴增。亞細(xì)胞定位所使用的載體為pCAMBIA1301-GFP。構(gòu)建載體所需引物見表1。將目的基因PCR產(chǎn)物和載體酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(生工生物，上海)進行割膠回收，具體步驟參照說明書。最后，按照ClonExpress?Ⅱ(Vazyme，南京)重組載體試劑盒說明書進行同源重組反應(yīng)。重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中培養(yǎng)，利用菌液PCR檢測得到陽性克隆子并送上海華大基因進行測序。參考秦娟等[27]的方法，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)。

亞細(xì)胞定位觀察：參考Shi等[28]的方法，取平板上確定含有陽性克隆子的農(nóng)桿菌接種于5 mL LB培養(yǎng)基(Luria-Bertani，含50 mg·L-1Rif，50 mg·L-1Kan)，28℃、200 r·min-1條件下培養(yǎng)10～12 h。取1 mL上述菌液接種于20 mL LB，28℃、200 r·min-1過夜培養(yǎng)，至OD600大于或等于1.0。吸取1 mL菌液于EP管，5 000 r·min-1離心4 min，棄上清。用1 mL滅菌水重懸菌體，再用1 mL侵染液[含10 mmol·L-12-(N-嗎啉代)乙烷磺酸一水[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MES]，pH值5.6；10 mmol·L-1MgCl2；150 mmol·L-1乙酰丁香酮(acetosyringone，Ace)]重懸菌體，稀釋至菌液OD600約為0.3，顛倒混勻后室溫避光靜置3 h，用于注射。亞細(xì)胞定位試驗以本氏煙草(Nicotianabenthamiana)為試驗材料。選取4片大小相同的煙草真葉葉片，用2 mL注射器將菌液注射至煙草葉背。注射后第2天澆水一次，培養(yǎng)3 d后將煙草背面下表皮細(xì)胞撕下制成臨時切片，激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號。

1.2.5 qRT-PCR檢測 本試驗相關(guān)引物通過Primer 6軟件設(shè)計，引物如表1所示。利用熒光定量引物進行3步法進行qRT-PCR擴增。qRT-PCR程序：95℃預(yù)變性7 min；95℃變性15 s，45℃退火30 s，75℃延伸15 s，39個循環(huán)。本試驗內(nèi)參引物為EjACT基因(引物見表1，退火溫度為41℃)，設(shè)置陰性對照。采用2-ΔΔCT法對最終的數(shù)據(jù)進行分析，本試驗進行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.6 啟動子克隆與元件分析 枇杷基因組DNA提取：總RNA提取所用材料為枇杷嫩葉組織，用試劑盒為Magen植物DNA提取試劑盒(廣州美基生物科技有限公司)，具體過程參照說明書進行。

啟動子序列巢式擴增：具體步驟參照Universal GenomeWalkerTM2.0試劑盒(Clontech，美國)進行。待PCR反應(yīng)結(jié)束后，通過電泳檢測其純度并回收純化，所得產(chǎn)物通過TA克隆反應(yīng)與pMD18-T連接成重組載體，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、篩菌、搖菌、提取質(zhì)粒得到陽性克隆子，送上海華大基因進行測序。

啟動子元件分析：利用在線工具PLACE數(shù)據(jù)庫(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)對枇杷果實類胡蘿卜素代謝關(guān)鍵基因的啟動子元件進行預(yù)測并分析。

1.2.7 LUC/REN雙熒光素酶試驗 重組載體構(gòu)建方法同1.2.4。本研究中雙熒光素酶試驗所使用的載體為pGreenII 62-SK和pGreenII 0800-LUC，陰性對照為空載體pGreenII 62-SK。構(gòu)建載體所需引物見表1。

煙草注射具體步驟參照1.2.4，其中，LUC/REN雙熒光素酶試驗中，菌液最后稀釋至OD600約為0.25，且待避光完成后將效應(yīng)基因和報告基因培養(yǎng)液按8∶1 比例混合進行注射。注射完第2天澆水一次，培養(yǎng)3 d 后，用直徑為1 cm打孔器將注射部位打出小圓葉片，利用Dual-Luciferase? Reporter Assay System試劑盒(Promega，美國)和Luminoskan Ascent化學(xué)發(fā)光分析儀(Thermo，美國)測定葉片侵染區(qū)中螢火蟲光素酶(firefly luciferase，LUC)與海腎光素酶(renilla luciferase，REN)催化產(chǎn)生的熒光信號。計算 LUC/REN 比值，歸一化為陰性對照，每個組合重復(fù)試驗4次。

1.2.8 引物設(shè)計 引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，具體引物信息如表1所示。

表1 試驗所需引物Table 1 Primers required for the experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷果實EjNAC82轉(zhuǎn)錄因子的克隆及序列分析

以枇杷果實cDNA為模板克隆得到長度為1 668 bp的EjNAC82開放閱讀框序列。該基因編碼的氨基酸一級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，EjNAC82蛋白分子量為61.73 kDa，等電點為4.63，將酸、堿性氨基酸組成比例結(jié)合理論等電點分析，發(fā)現(xiàn)EjNAC82蛋白呈酸性。不穩(wěn)定指數(shù)為46.40，表明EjNAC82蛋白較穩(wěn)定。其脂溶指數(shù)和親水指數(shù)分別為68.13和-0.475，說明該蛋白有較好的脂溶性和親水性。通過亞細(xì)胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，EjNAC82定位于細(xì)胞核內(nèi)。

2.2 枇杷果實EjNAC82結(jié)構(gòu)預(yù)測、氨基酸序列分析和系統(tǒng)進化樹分析

EjNAC82蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，α螺旋、β轉(zhuǎn)角、延伸鏈、無規(guī)則卷曲分別約占20.00%、7.39%、15.14%、57.48%，即EjNAC82蛋白二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主(圖1-A)，此結(jié)果與該蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相一致(圖1-B)。

將EjNAC82基因編碼的氨基酸序列利用NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST下載該基因的同源序列，包括秋子梨、白梨、歐洲甜櫻桃、梅花、毛桃、扁桃、東京櫻花等物種。同源性分析發(fā)現(xiàn)，EjNAC82與秋子梨(Pyrusussuriensis×Pyruscommunis，KAB2622897.1)、白梨(Pyrus×bretschneideri，XP_018499492.1)的NAC轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列相似度高達(dá)90%以上；與其他物種，歐洲甜櫻桃(Prunusavium，XP_021830704.1)、梅花(Prunusmume，XP_008237527.1)、毛桃(Prunuspersica，XP_007201045.1)、扁桃(Prunusdulcis，XP_034229875.1)、東京櫻花(Prunusyedoensisvar.Nudiflora，PQQ06771.1)有少量氨基酸存在差異，相似度達(dá)60%以上。將EjNAC82氨基酸序列與以上7個物種的NAC蛋白氨基酸序列進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EjNAC82蛋白的N端包含NAC轉(zhuǎn)錄因子家族特有的保守極高的NAC結(jié)構(gòu)域，包含5個亞結(jié)構(gòu)域(A～E)，C端差異較大，是極不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄激活域(圖2)。

圖1 EjNAC82蛋白的二級(A)、三級(B)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.1 The deduced secondary (A) and tertiary (B) structure of EjNAC82 proteins

圖3 EjNAC82轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of EjNAC82 transcription factor

為進一步研究枇杷EjNAC82蛋白的系統(tǒng)進化關(guān)系，用MEGA5.1軟件分析了與其同源性較高的白梨、蘋果、湖北海棠、毛桃、梅花、秋子梨、扁桃7個物種中NAC家族基因的親緣關(guān)系。結(jié)果表明，枇杷EjNAC82與秋子梨PuNAC、白梨PbNAC的聚類于同一分支，親緣關(guān)系最近(圖3)。

2.3 EjNAC82蛋白的亞細(xì)胞定位

通過在線預(yù)測軟件進行亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果表明，EjNAC82蛋白定位于細(xì)胞核。為進一步驗證EjNAC82蛋白亞細(xì)胞定位，本試驗構(gòu)建了重組蛋白EjNAC82-GFP(圖4)，空載pCAMBIA1301-GFP作為對照。

激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照35S::GFP的整個煙草葉片細(xì)胞內(nèi)都檢測出綠色熒光熒光信號，而35S::EjNAC82-GFP煙草葉片細(xì)胞中只在細(xì)胞核內(nèi)檢測觀察到綠色熒光信號(圖4)。上述結(jié)果表明EjNAC82蛋白定位于細(xì)胞核并行使其功能。

2.4 枇杷果實EjNAC82基因表達(dá)分析

通過qRT-PCR測定大紅袍和白沙兩品種枇杷根、芽、嫩葉、老葉、嫩枝、老枝、幼果、熟果8種不同的組織中EjNAC82的表達(dá)量，結(jié)果表明，EjNAC82基因在根、芽、嫩葉、老葉、嫩枝、老枝、幼果、熟果組織中均有表達(dá)。其中，EjNAC82在老葉中的表達(dá)最高，且大紅袍老葉中的表達(dá)顯著高于白沙老葉(P<0.05)(圖5)。

通過qRT-PCR測定分析大紅袍和白沙兩品種枇杷果實成熟過程中EjNAC82基因的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EjNAC82在果皮和果肉成熟過程中的表達(dá)模式相同，呈先上升后下降再上升的趨勢。隨著果實的成熟，EjNAC82在S1、S3、S4、S5時期大紅袍果肉中的表達(dá)量顯著高于同時期白沙(P<0.05)。EjNAC82在大紅袍枇杷果皮S2時期的表達(dá)量顯著高于白沙，而在S3和S5時期白沙中EjNAC82的表達(dá)量顯著高于大紅袍(P<0.05)(圖6)。

2.5 枇杷果實類胡蘿卜素代謝關(guān)鍵基因啟動子克隆及順式作用元件分析

利用Genome Walking技術(shù)從枇杷中擴增出EjPSY1、EjPSY2和EjBCH3個基因的啟動子片段，長度分別為1 043、1 607、726 bp。通過在線軟件PLACE分析啟動子序列上的順式作用元件。

EjPSY1啟動子上含有7個NAC蛋白結(jié)合位點NACRS，其中含3個[CACG]、7個[CGTA]識別序列。由此推測，NAC轉(zhuǎn)錄因子可能識別并結(jié)合EjPSY1啟動子。此外，EjPSY1啟動子上含有17個CAAT-box真核生物核心啟動子元件、多個光響應(yīng)元件(2個AE-box、1個TCT-motif、1個GATA-motif、1個GT1-motif)和激素響應(yīng)元件(1個P-box和1個TGACG-motif)(表2)。

EjPSY2啟動子上含有9個NAC蛋白結(jié)合位點NACRS，其中含4個[CACG]、6個[CGTG]和4個[CGTA]識別序列。由此推測，NAC轉(zhuǎn)錄因子識別并結(jié)合EjPSY2啟動子。此外，EjPSY2啟動子上含有19個CAAT-box真核生物核心啟動子元件、多個光響應(yīng)元件(1個AAAC-motif、7個Box 4、1個G-Box、2個GT1-motif、1個LAMP-element)和激素響應(yīng)元件(2個ABRE、2個GARE-motif、1個TCA-element)(表3)。

注：標(biāo)尺50 μm。Note: Scale bars=50 μm.圖4 EjNAC82蛋白在煙草表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of EjNAC82 protein in tobacco epidemic cells

EjBCH啟動子上含有6個NAC蛋白結(jié)合位點NACRS，其中含1個[CGTG]和3個[CGTA]識別序列。由此推測，NAC轉(zhuǎn)錄因子均可能識別并結(jié)合EjBCH啟動子。此外，EjBCH啟動子上含有14個CAAT-box真核生物核心啟動子元件、1個Box 4光響應(yīng)元件和多個激素響應(yīng)元件(2個CGTCA-motif和2個TGACG-motif)(表4)。

圖6 枇杷成熟過程中EjNAC82基因表達(dá)變化Fig.6 Changes of EjNAC82 expression in loquat fruit during ripening

2.6 NAC轉(zhuǎn)錄因子對枇杷類胡蘿卜素代謝關(guān)鍵酶基因啟動子的激活作用

為進一步研究NAC轉(zhuǎn)錄因子對EjPSY1、EjPSY2和EjBCH啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用，通過同源重組的方法，將EjNAC82基因的ORF序列插入pGreenⅡ62-sk構(gòu)建效應(yīng)基因重組載體，將EjPSY1、EjPSY2和EjBCH啟動子序列插入pGreenⅡ0800-LUC構(gòu)建報告基因重組載體(圖7)。

LUC/REN雙熒光素酶試驗結(jié)果顯示，與空載體相比，EjNAC82轉(zhuǎn)錄因子與EjPSY1、EjPSY2、EjBCH啟動子的共轉(zhuǎn)化使螢火蟲熒光素酶產(chǎn)生的熒光信號(LUC)與海腎熒光素酶產(chǎn)生的熒光信號(REN)的比值(LUC/REN)極顯著升高(P<0.001)，說明EjNAC82轉(zhuǎn)錄因子對EjPSY1、EjPSY2、EjBCH啟動子具有轉(zhuǎn)錄激活作用(圖8)。

3 討論

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物中被廣泛研究的轉(zhuǎn)錄因子家族，該轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控高等植物的生長發(fā)育，對果實的成熟起著關(guān)鍵作用[20]。本試驗從枇杷果實中克隆得到1個NAC轉(zhuǎn)錄因子，命名為EjNAC82。生物信息學(xué)分析表明，EjNAC82蛋白pH值呈酸性，較穩(wěn)定，且有良好的脂溶性和親水性；EjNAC82蛋白二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，且與蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相一致。同源性分析發(fā)現(xiàn)，EjNAC82蛋白與秋子梨PuNAC、白梨PbNAC蛋白相似度高達(dá)90%以上。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，EjNAC82轉(zhuǎn)錄因子含有高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域(包含A～E共5個子結(jié)構(gòu)域)和多變的C端轉(zhuǎn)錄激活域。以上結(jié)果與其他植物已有研究中的NAC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特點相同[29-31]，表明本試驗中克隆的EjNAC82基因?qū)儆贜AC轉(zhuǎn)錄因子。

表2 EjPSY1啟動子序列順式作用元件分析Table 2 Analysis of EjPSY1 promoter sequence cis-acting element

表3 EjPSY2啟動子序列順式作用元件分析Table 3 Analysis of EjPSY2 promoter sequence cis-acting element

已有大量研究表明，轉(zhuǎn)錄因子在植物細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，且在木瓜[21]、梭梭[20]中發(fā)現(xiàn)的NAC轉(zhuǎn)錄因子均定位于細(xì)胞核內(nèi)。本試驗對EjNAC82蛋白進行亞細(xì)胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，并通過亞細(xì)胞定位試驗對其進行驗證，試驗結(jié)果與預(yù)測結(jié)果一致，說明EjNAC82在細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。

本研究通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，該基因在大紅袍和白沙兩品種枇杷不同組織中均有表達(dá)，且在老葉中的表達(dá)最高，在大紅袍老葉中的表達(dá)顯著高于白沙老葉(P<0.05)，說明該基因可能對枇杷葉片的生長發(fā)育有著關(guān)鍵作用。Fan等[32]研究發(fā)現(xiàn)包心菜(Brassicarapassp. parachinensis)BrNAC041轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控葉片衰老。此外，越來越多的研究證明，NAC轉(zhuǎn)錄因子在果實類胡蘿卜素合成中有轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。其中番茄果實SlNAC1的表達(dá)量隨著果實成熟而增加，直至裂果后7 d達(dá)到最高水平，且SlNAC1通過上調(diào)SlPSY1基因的表達(dá)，正調(diào)控類胡蘿卜素的合成[22]。本試驗發(fā)現(xiàn)，隨著枇杷果實的成熟，EjNAC82在S1、S3、S4、S5時期大紅袍果肉中的表達(dá)量顯著高于白沙(P<0.05)，結(jié)合前人研究結(jié)果推測，EjNAC82基因可能正調(diào)控枇杷果實類胡蘿卜素的合成與積累。

表4 EjBCH啟動子序列順式作用元件分析Table 4 Analysis of EjBCH promoter sequence cis-acting element

圖7 載體構(gòu)建原理圖Fig.7 Schematic diagrams of vectors construction

注：***表示P<0.001水平上差異極顯著。Note: *** indicates significant difference at 0.001 level.圖8 EjNAC82對EjPSY1/2和EjBCH啟動子的調(diào)控作用Fig.8 Regulation of EjNAC82 on EjPSY1/2 pro and EjBCH pro

利用啟動子克隆技術(shù)，克隆得到枇杷果實類胡蘿卜素代謝關(guān)鍵基因(EjPSY1、EjPSY2和EjBCH)的啟動子片段，對其啟動子進行元件分析發(fā)現(xiàn)，這些啟動子序列上含有多個真核生物核心啟動子元件和激素響應(yīng)元件，且含有數(shù)個NAC蛋白結(jié)合位點NACRS，說明NAC轉(zhuǎn)錄因子可能通過結(jié)合這些關(guān)鍵酶基因啟動子上的NACRS位點對酶基因發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，木瓜CpNAC1可以作用于PDS2/4啟動子的NACBS(CGTG/A)元件，上調(diào)PDS2/4基因的表達(dá)，從而上調(diào)類胡蘿素的積累[21]。Fu等[6]同樣發(fā)現(xiàn)，CpNAC2識別并作用于PDS2/4、ZDS、LCYB、BCH啟動子上的CGTG/A位點，正調(diào)控類胡蘿卜素的合成。本試驗利用LUC/REN雙熒光素酶試驗明確了EjNAC82轉(zhuǎn)錄因子能激活EjPSY1、EjPSY2和EjBCH啟動子，即EjNAC82可能通過激活EjPSY1、EjPSY2和EjBCH啟動子，上調(diào)EjPSY1、EjPSY2和EjBCH基因的表達(dá)，從而正調(diào)控枇杷果實類胡蘿卜素的合成與積累。

4 結(jié)論

本研究克隆得到1個枇杷NAC轉(zhuǎn)錄因子EjNAC82。生物信息學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EjNAC82蛋白具有NAC轉(zhuǎn)錄因子特有的理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，與秋子梨PuNAC、白梨PbNAC蛋白相似度高達(dá)90%以上，且含有高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域和多變的C端轉(zhuǎn)錄激活域。亞細(xì)胞定位試驗結(jié)果表明，EjNAC82在細(xì)胞核中起轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。qRT-PCR結(jié)果表明該基因可能正調(diào)控枇杷果實類胡蘿卜素的合成與積累。LUC/REN雙熒光素酶試驗進一步明確了EjNAC82轉(zhuǎn)錄因子能激活EjPSY1、EjPSY2和EjBCH啟動子。