綠肥油菜種質(zhì)篩選與評價

王曉丹 馬 花 官 梅 官春云

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國家油料改良中心湖南分中心，湖南 長沙 410000)

20世紀中后期以來，我國化肥工業(yè)快速發(fā)展，促使我國糧食產(chǎn)量不斷增加[1]。然而化肥的大量施用造成了江河湖泊水域富營養(yǎng)化[2]，土壤板結(jié)、有機碳含量下降，農(nóng)田氮素遷移[3]，臭氧層破壞，自然災(zāi)害頻發(fā)[4]等一系列問題，使可持續(xù)發(fā)展面臨巨大的壓力和挑戰(zhàn)[5]。作為一種綠色防控技術(shù)，種植綠肥可減少我國化肥農(nóng)藥使用量[6]。因此培育優(yōu)質(zhì)綠肥品種，發(fā)展綠肥產(chǎn)業(yè)對保護生態(tài)環(huán)境及農(nóng)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

綠肥油菜作為近年來迅速興起的有機肥，其種植區(qū)域分布廣泛，適應(yīng)性強[7]，且油菜干物質(zhì)積累量大，翻壓可提高土壤養(yǎng)分含量、增強土壤肥力、改善土壤物理性狀[8-9]。研究表明，油菜種植可改善細菌群落多樣性，增加土壤有益菌群落數(shù)量[10]。油菜的碳氮比適中，較紫云英更有利于被土壤微生物分解，養(yǎng)分易被下茬作物吸收[6,11]；油菜中硫苷水解物可抑制雜草[12]、土壤病原菌[13]及土壤線蟲[14]等，是區(qū)別于其他綠肥作物的重要特征之一。同時，綠肥油菜可結(jié)合不同的農(nóng)作制度需求，如長江流域游的“稻-稻-油”[15]、“蓮-油”輪作[16]等，具有獨特的應(yīng)用價值和廣闊發(fā)展前景。

養(yǎng)分特性是衡量綠肥作物優(yōu)劣的重要指標，也是決定綠肥對土壤和后茬作物影響大小的重要基礎(chǔ)[17]。研究表明，同一生態(tài)區(qū)不同綠肥作物的養(yǎng)分特性及綠肥作物對土壤理化性質(zhì)與微生物的影響差異明顯[18]。本研究以兩個綠肥油菜品種油肥1號[19]、油肥2號[20]為對照，檢測12個油菜品系植株養(yǎng)分含量、土壤養(yǎng)分含量及土壤微生物類群，比較品種間差異，以期篩選出優(yōu)質(zhì)綠肥種質(zhì)資源，促進綠肥油菜育種。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地點位于湖南省長沙市湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園基地(113°07′E、28°18′N)，屬亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候，年平均氣溫17.2℃，年積溫為5 457℃，年均降水量 1 361.6 mm。 試驗田施行“稻-油”輪作，土壤pH值為5.6，有機質(zhì)、全氮、全磷、速效鉀、速效磷的含量分別23.80、1.40、0.70、0.28、0.01 g·kg-1。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用田間隨機區(qū)組設(shè)計，油肥1號、油肥2號和12個油菜品種(系)見表1。小區(qū)面積為2×4 m2，種植密度為15萬株·hm-2，每個品系設(shè)3次重復(fù)，共42個小區(qū)。于2018年9月27日播種，條播，田間管理按大田油菜栽培方法進行。

表1 供試油菜品種(系)Table 1 List of tested oilseed rape varieties (lines)

1.3 試驗方法

在作物苗期、盛花期分別進行植株和土壤取樣，參照王營營[21]的方法測定植株指標(全氮、全磷、全鉀含量)與土壤養(yǎng)分指標(全氮、速效鉀含量)。土壤樣品委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司，基于IonS5TMXL測序平臺，利用單端測序(Single-End)的方法進行16S(V3+V4)區(qū)域擴增子測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 24.0軟件進行相關(guān)性與主成分分析，并用Origin 2019軟件作圖，差異顯著性檢驗采用LSD法，P<0.05時認為差異達到顯著水平。高通量數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析通過諾和云平臺進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 植株養(yǎng)分特性差異

14個油菜品種(系)的氮(N)、磷(P)、鉀(K)含量測定結(jié)果見表2，相比對照，多數(shù)品系苗期養(yǎng)分含量差異顯著。在氮含量方面，品系編號為4、10、12、11、9、7的植株苗期全氮含量均高于CK1和CK2；在磷含量方面，除品系5外，其他品系的苗期全磷含量均高于CK1和CK2，其中品系6全磷含量顯著高于其他品系(P<0.05)；在鉀含量方面，品系10、9、4、12苗期全鉀含量顯著高于CK1和CK2。相比對照，多數(shù)品系盛花期養(yǎng)分含量存在顯著差異。在氮含量方面，品系11、13、4、8、5植株盛花期全氮含量均高于CK2；品系8植株盛花期全磷含量最高，除品系7和1外，其他參試品系均高于CK1；品系1和9盛花期全鉀含量高于CK1和CK2，其中品系1顯著高于其他品種(系)(P<0.05)。總體而言，品系4和11植株養(yǎng)分含量較高。

14個油菜品種(系)氮(N)、磷(P)、鉀(K)單株積累量測定結(jié)果表明(表2)，苗期品系5植株的氮、磷、鉀積累量均顯著高于其他品種(系)(P<0.05)；盛花期時，品系11、4、10、8、2、3、12、5的全氮單株積累量高于CK1和CK2，品系11號顯著高于其他品種(系)(P<0.05)，品系8、10、11、3、2、4、5的全磷單株積累量較高，品系8高于其他品種(系)(P<0.05)，品系11、4、2、1、3、9的全鉀單株積累量高于CK1和CK2，品系11號顯著高于其他品種(系)(P<0.05)。結(jié)合植株養(yǎng)分含量分析表明，油菜養(yǎng)分含量苗期普遍比盛花期高，平均養(yǎng)分積累量則是苗期普遍低于盛花期。以盛花期養(yǎng)分積累量作為篩選指標，品系4、11、3、5表現(xiàn)較優(yōu)。

表2 不同品種(系)植株養(yǎng)分含量與養(yǎng)分積累量差異Table 2 Nutrient contents and nutrient accumulation of per plant in different varieties

表3 不同品種(系)土壤養(yǎng)分含量差異Table 3 difference of soil nutrient content among different varieties (lines)

2.2 不同生育期/不同品種(系)間土壤養(yǎng)分及微生物特性

2.2.1 不同生育期/不同品種(系)間土壤養(yǎng)分含量差異 14個油菜品種(系)的土壤養(yǎng)分含量測定結(jié)果表明(表3)，在苗期，品系11土壤氮含量，品系3、10、4、1、2、9土壤速效磷含量，品系4、11、6、1土壤速效鉀含量分別高于CK1和CK2中土壤氮、速效磷、速效鉀含量，其中品系4土壤中速效鉀含量顯著高于兩對照(P<0.05)。盛花期，品系10、12、5土壤全氮含量較高，與CK1差異顯著(P<0.05)；品系12、2、1土壤速效磷含量顯著高于CK1和CK2(P<0.05)；品系11、6、9、10、4、5土壤速效鉀含量較高，且品系11顯著高于CK1和CK2(P<0.05)。多數(shù)品系土壤氮含量在苗期和盛花期以及品種(系)間無顯著差異，不同品種(系)土壤全氮、速效磷和速效鉀含量在苗期和盛花期的變化情況不一致，整體而言，品系10、11土壤養(yǎng)分含量較高。

2.2.2 不同生育期/不同品種(系)間土壤微生物差異 對14個品種(系)苗期與盛花期土壤樣本進行16S測序，質(zhì)控后按照97%相似性進行操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)聚類分析(圖1-A、B)，結(jié)果顯示苗期共享OTU數(shù)為1 658，占OTU總數(shù)的43.96%，花期共享OTU數(shù)為1 480，占OTU總數(shù)的40.29%，表明各品種(系)的種群具有一定差異。根據(jù)SILVA數(shù)據(jù)庫(https://www.arb-silva.de/)注釋結(jié)果，苗期各品種(系)土壤細菌在門(Phylum)水平上豐度排名前10的物種(圖1-C)分別為變形桿菌(Proteobacteria)、酸桿菌(Acidobacteria)、放線菌(Actinobacteria)、綠彎菌(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌(Firmicutes)、芽單胞菌(Gemmatimonadetes)、疣微菌(Verrucomicrobia)、硝化螺旋菌(Nitrospirae)、藍細菌(Cyanobacteria)，盛花期其中八類與苗期一致，另外兩類為奇古菌(Thaumarchaeota)與未知門類微生物(圖1-D)。總體而言，同一時期微生物門水平的組成無明顯差異，不同時期微生物門水平的組成差異不大，但綠肥的不同品種(系)和種植的不同時期會影響不同門類微生物的相對含量。

2.3 油菜植株與土壤養(yǎng)分性質(zhì)以及土壤微生物相關(guān)性分析與主成分分析

2.3.1 油菜植株與土壤養(yǎng)分性質(zhì)以及土壤微生物相關(guān)性分析 植株養(yǎng)分、土壤微生物和土壤養(yǎng)分間相關(guān)性分析結(jié)果表明(表4)，在苗期和盛花期，植株養(yǎng)分含

注：A、B分別為苗期(M)、花期(H)不同品種(系)微生物群落種類Venn圖； C、D分別為苗期、花期不同品種(系)在門水平的差異。Note: A and B are microbial community types of varieties (lines) at seedling stage and flowering stage respectively(Venn graph). C and D are the differences of varieties (lines) at seedling stage and flowering stage respectively(at the phylum level).圖1 不同生育期/不同品種(系)間土壤微生物差異Fig.1 Differences of soil microorganisms in different growth stages/varieties (lines)

表4 油菜植株養(yǎng)分和主要微生物類群與土壤養(yǎng)分性質(zhì)的相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation coefficients of plant nutrients and main microbial groups with soil nutrient properties

量與土壤養(yǎng)分含量均無顯著相關(guān)性，單株氮含量與土壤全氮含量分別存在極顯著和顯著正相關(guān)，同時，盛花期單株磷含量與土壤磷含量之間呈顯著正相關(guān)。苗期與盛花期的部分微生物類群與土壤全氮、速效磷、速效鉀養(yǎng)分含量之間呈現(xiàn)正或負相關(guān)性，尤其是厚壁菌門與疣微菌門，在苗期與盛花期與土壤全氮含量均有顯著負相關(guān)性。由此可知，植株單株養(yǎng)分含量與土壤微生物是影響土壤養(yǎng)分含量的重要因素。

2.3.2 油菜植株與土壤養(yǎng)分性質(zhì)以及土壤微生物主成分分析 據(jù)2.3.1分析，植株單株養(yǎng)分積累量與部分微生物類群有正或負相關(guān)性，將各品種(系)植株單株養(yǎng)分含量和土壤養(yǎng)分含量及土壤厚壁菌和疣微菌類群標準化后進行主成分分析。表5列出了前5個主成分，可代表14個油菜品種(系)82.87%的養(yǎng)分信息。第一主成分的貢獻最大，達28.85%，苗期土壤N含量及植株養(yǎng)分積累量，占較大正向負荷；第二主成分占20.12%，盛花期養(yǎng)分積累量占較大正向負荷；第三主成分中土壤速效鉀含量占較大正向負荷；第四、第五主成分占較大正向負荷的是土壤微生物含量。總體來看，第一、第二主成分為植株養(yǎng)分特性因子，第三、四、五因素主要為土壤養(yǎng)分與微生物因子，其中植株養(yǎng)分積累量是綠肥油菜種質(zhì)資源養(yǎng)分特性評價的主導(dǎo)因子。

將各品種(系)植株和土壤養(yǎng)分特性標準化數(shù)值與前5個主成分的特征向量相乘，并加權(quán)得到各主成分得分及排名(表6)。與兩對照品種相比，在植株養(yǎng)分特性方面，以品系11、4、10、2表現(xiàn)較優(yōu)，在土壤養(yǎng)分及微生物特性方面，以品系11、6、4、1較優(yōu)，整體分析來看，品系11、4優(yōu)于CK1和CK2。

3 討論

綠肥養(yǎng)分特性對土壤理化性質(zhì)和后茬作物生長具有重要意義。本研究中苗期和盛花期油菜植株養(yǎng)分含量及單株積累量分析結(jié)果表明，盛花期N、P、K含量均低于苗期，與盛花期植株部分養(yǎng)分由莖葉向生殖器官轉(zhuǎn)移有關(guān)[22]。而盛花期單株養(yǎng)分積累量高于苗期，表明在油菜營養(yǎng)生長過程中，單株鮮草產(chǎn)量不斷增加，進而使單株養(yǎng)分含量不斷積累，這與王佳銳[23]的研究結(jié)果一致。對于翻壓綠肥，翻壓養(yǎng)分總量即養(yǎng)分累積量比植株養(yǎng)分含量更為重要，且油菜在盛花期進行翻壓可提供更多植株養(yǎng)分，以盛花期養(yǎng)分積累量作為篩選指標，則品系4、11、3、5表現(xiàn)較優(yōu)。另一方面，盡管苗期植株單株積累量略低，但苗期營養(yǎng)生長旺、莖葉產(chǎn)量較高，栽培時間短，在翻壓后易腐熟，以苗期養(yǎng)分積累量作為篩選指標，則品系5、11、8表現(xiàn)較優(yōu)。

表5 植株和土壤養(yǎng)分特性的主成分分析Table 5 Principal component analysis of plant and soil nutrient characteristics

表6 基于主成分分析的綠肥油菜植株和土壤養(yǎng)分與微生物特性的綜合比較Table 6 Comprehensive comparison of nutrient characteristics via principal component analysis

油菜在不同生育期對土壤養(yǎng)分的吸收和利用率不同[24]，不同品種生長情況亦對土壤養(yǎng)分有影響。研究表明，油菜對氮素的吸收量在抽薹前、抽薹至終花、角果發(fā)育期分別約占45%、45%、10%[25]，同時氮肥利用率低在油菜生產(chǎn)中亦普遍存在[26]。本研究中，植株氮含量在苗期和盛花期均較高，而相應(yīng)的土壤氮含量在苗期和盛花期以及品種(系)間均變化差異較小，表明油菜植株需氮量較大，但氮吸收率較低。盡管如此，油菜所吸收的80%以上養(yǎng)分能夠以各種形式還田[25]。肖小軍等[27]研究表明，在油菜秸稈還田條件下，僅需少量N肥即可滿足后茬水稻生長需求。另一方面，油菜根系可分泌多種有機酸和酶類物質(zhì)，尤其是酸性磷酸酶的分泌，活化釋放土壤中難溶態(tài)磷，從而提高根際土中速效磷的含量[28-29]，本試驗中土壤苗期速效磷的含量低于盛花期，可能與盛花期根系發(fā)達，釋放了更多難溶態(tài)磷有關(guān)。整體而言，不同品種(系)氮磷鉀含量在苗期和盛花期的變化情況不一致，推測與不同品種(系)的生長發(fā)育差異性有關(guān)。以土壤養(yǎng)分為篩選指標，則品系11、10、4表現(xiàn)較佳。

不同生育期土壤微生物組成類群不同，不同品系間同一類群占比不同。本研究中，苗期與盛花期微生物豐度及微生物類群存在一定差異，且同一微生物類群在不同品系間含量亦有一定差異。同時，相關(guān)性分析表明厚壁菌和疣微菌門類群在苗期與盛花期與土壤養(yǎng)分有顯著或極顯著相關(guān)性。疣微菌門是一門被劃分出不久的細菌類群，只有少數(shù)被識別的種類，Aguirre-von-Wobeser等[30]研究表明，與對照土壤相比，疣微菌門是唯一一個在玉米(ZeamaysL.)根部土壤中的豐度顯著增加的門類，盡管其功能研究尚不明確，但在水稻(OryzasativaL.)[31]、韭菜(Alliumporrum)[32]、甘蔗(Saccharumofficinarum)[33]中已經(jīng)被證明該類菌可利用植物性碳源促進生長。且疣狀菌可以被描述為寡養(yǎng)型，當(dāng)?shù)^量時，其豐度降低[34-35]。據(jù)此可調(diào)控土壤施肥量，避免因施肥量過多而造成的浪費與負面環(huán)境影響。厚壁菌是最常見的植物根際細菌之一[36]。據(jù)報道，厚壁菌門可培養(yǎng)性很高，在可培養(yǎng)的細菌種類中占14%[37]。Polyanskaya等[38]從豌豆(Pisumsativum)根際分離到一株厚壁菌門的梭狀芽胞桿菌(Clostridiumsp.)，對大麥(Hordeumvulgare)和黃瓜(Cucumissativus)的生長均有促進作用，且能抑制番茄(Lycopersicumesculentum)根系有害菌的生長[39]，并提高芒草(Miscanthussinensis)對鹽脅迫的耐受性[40]。此外，厚壁菌參與細胞壁生物合成和跨膜轉(zhuǎn)運等[41]，且具有磷酸鹽增溶和固氮等多種促進植物生長的特性[42]，以疣微菌和厚壁菌豐度作為篩選綠肥油菜的評價因子進一步研究，對于發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，種植油菜綠肥會改變土壤養(yǎng)分含量與微生物群落豐度。與對照相比，12個油菜品系中，11號(辰溪臘油菜)、4號(紫葉芥)品系綜合表現(xiàn)突出，是良好的綠肥種質(zhì)。此外，除植株養(yǎng)分積累量與土壤養(yǎng)分外，土壤微生物中疣微菌和厚壁菌豐度同樣可用于篩選綠肥種質(zhì)。