油用牡丹單粒種子含油量NIRS模型的建立

劉慧春 周江華 張加強 許雯婷 朱開元

(浙江省園林植物與花卉研究所，浙江 杭州 311251)

油用牡丹是原產于我國的一種優良木本油料植物，其中鳳丹是江南地區油用牡丹的主栽品種，耐干旱、瘠薄、鹽堿，抗寒能力強，適應范圍廣。2011年，牡丹籽油被國家衛生部批準為新資源食品，進入食用油行列，其不飽和脂肪酸含量較高(83.05%～90.00%)，尤其是亞麻酸占不飽和脂肪酸含量高達31.56%～66.85%[1-2]，遠高于目前市場上銷售的主要食用油。對油用牡丹的含油量進行評價是發展油用牡丹產業的一項重要工作，而單粒選種是油料作物育種的重要環節，特別是對于育種資源有限的子代，因此建立無損檢測方法尤為重要。用傳統的化學方法測定含油量不僅需要破壞種子，而且過程十分繁瑣，需要經過去皮、粉碎、萃取等一系列操作流程，耗時且耗材[3]。近紅外光譜分析技術(near infrared reflectance spectroscopy, NIRS)是1980年代后期發展起來的一種高效、快速、低成本、無損傷的現代測試技術[4-6]，該方法已被廣泛應用于玉米(Zeamays)[7]、油菜(Brasscicacampestris)[8-11]、橄欖(Canariumalbum)[12]、羽衣甘藍(Brassicaoleraceavar.acephala)[13]、水稻(Oryzasativa)[14]及其他油料作物[15-18]的含油量、油料品質等各項油料指標的測定。崔虎亮[19]首次采用NIRS技術測定紫斑牡丹種子主要脂肪酸成分，取得了較好的效果，但種子含油量建模效果不佳，主要原因可能是未找到適合的光譜采集適配器。因此油用牡丹種子含油量的無損檢測方法有待繼續研究和完善，同時關于油用牡丹鳳丹種子含油量NIRS數學模型的構建迄今鮮有報道。

本研究利用近紅外光譜掃描技術，獲得油用牡丹鳳丹種子的光譜數據，結合傳統的化學測定結果，建立NIRS技術定量分析鳳丹種子單粒含油量的數學模型，旨在為油用牡丹種子高含油量品種的育種工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

油用牡丹種子樣品分別采集自浙江省園林植物與花卉研究所牡丹基地(臨浦)、浙江省金華市浦江縣檀溪鎮大元村油用牡丹基地、浙江省金華市磐安縣大盤鎮下寮村油用牡丹示范基地，采集樣品數量分別為100(臨浦)、50(浦江)、50份(磐安)，為江南油用牡丹隔離種植的不同株系。

1.2 儀器與試劑

恒溫烘箱(上海精宏實驗設備有限公司，DHG-9023A)、 定性濾紙(杭州富陽北木漿紙有限公司，直徑9 cm 中速)、干燥器(江蘇華鷗玻璃有限公司，240#，含硅膠BS-2101)、研缽(洛陽伊耐陶瓷科技有限公司，130 mm)、分析天平[梅特勒托利多科技(中國)有限公司，上海，AB204N]、實驗用粉碎機(上海凈信實業發展有限公司，JXFSTPRP-48)、電熱恒溫水浴鍋(常州越新儀器制造有限公司，HH-4)、近紅外光譜儀(ThermoFisher Scientific，美國，Antaris Ⅱ)、索氏抽提器(杭州菲躍儀器有限公司，FY-SXT-04)、氣相色譜儀(ThermoFisher Scientific, 美國，TRACE 1300)。

石油醚(30～60℃)(常州市中超化工有限公司，分析純)、甲醇(蘇州嘉鼎化學科技有限公司，分析純)、氫氧化鉀(常州市啟迪化工有限公司，分析純)。

1.3 試驗方法

1.3.1 含油量的化學測定方法 化學測定法采用索氏抽提法，按《GB/T 5009.3-3006食品安全國家標準食品中脂肪的測定》[20]進行測定。選取成熟度、飽滿度一致的牡丹種子4粒，用實驗用粉碎機將其磨碎，放入疊好且烘干至恒重的濾紙袋(m1)中，于恒溫烘箱中烘干，直至種子重量不再變化，放于干燥器中待其冷卻至室溫，稱重(m2)。含料濾紙袋堆疊整齊，置入索氏抽提器的抽提筒中，在抽提筒中加入石油醚，直至沒過濾紙袋。控制抽提溫度使提取液每8～10 min回流一次。樣品抽提時間控制在20 h左右。提取結束時取1 mL提取液，用甲醇氫氧化鉀脂化后上氣相色譜檢測，若無明顯脂肪酸成分檢出，即抽提完全。將抽提后的濾紙包放于通風櫥吹風晾干，待紙包上的抽提液揮發完畢，再恒溫干燥至恒重，將其放置于干燥器中冷卻至室溫，稱量(m3)。每個樣品做3次重復，取平均值為籽粒平均含油量。

含油量=(m3-m1)/(m2-m1)×100%。

為確定烘焙時間和抽提時間，首先選用樣品數量比較多的PJ15和PJ16 2個品種進行條件優化試驗，分別采用簡單手工破碎和機械均勻粉碎的方法測定烘焙所用時間，然后用氣相色譜法測定脂肪酸殘余確定抽提所用時間。確定烘焙條件和抽提時間后，其余樣品按優化后的條件進行測定。樣品烘焙至恒重所需時間作為烘焙時間，即烘焙的樣品每隔半小時稱重一次，直至前后兩次重量變化在0.5%以內。

1.3.2 近紅外光譜數據的采集 利用近紅外光譜儀，設置儀器工作參數，光譜區間掃描范圍為4 000～10 000 波數(cm-1)，掃描次數為16，分辨率為8 cm-1。試驗中選擇與含油量分析中大小色澤等外觀均勻一致的種子，采用漫反射掃描，對種子的正反面各掃描一次。利用儀器自帶的軟件采集光譜，利用TQ Analyst軟件進行數據分析和模型構建。儀器開機前檢測儀器內干燥劑為藍色。每個樣品取3粒種子正反掃描共6條光譜數據，取這6個光譜數據的平均數得到平均光譜，同時得到波長數據，保存數據后待分析。

1.3.3 NIRS數學模型的建立 分別采用偏最小二乘法(partial least squares，PLS)和主成分回歸法(principal component regression， PCR)進行模型的構建。為消除背景噪聲影響，使用各種光譜預處理方法優化模型，包括多元信號矯正(multi signal correction, MSC)、標準正則變換(standard normal variation, SNV)、一階導數(1st)以及多種方法結合。模型的預測精度和穩健性采用校正相關系數r1、預測相關系數r2、校正均方根誤差(root mean square error of calibration, RMSEC)和預測均方根誤差(root mean square error of predication, RMSEP)進行評價[21]。

2 結果與分析

2.1 干燥烘焙時間的確定

含油量分析前首先需要去除種子的水分。由于牡丹種子的種皮和胚比較致密，胚粉碎方式與烘干至恒重所需時間密切相關。本研究采用2種粉碎方式手動破碎(錘子敲破)和粉碎機均勻粉碎，結果如圖1所示。手動破碎需要105℃烘焙10 h以上，品種PJ15和品種PJ16烘干至10 h時與烘干8 h相比，仍然有明顯的重量變化，分別降低1.80%和1.69%，尚未達到烘干至恒重的國家標準。PJ15和PJ16采用粉碎機粉碎(PJ15C和PJ16C)，烘干2 h的重量比烘干1.5 h分別降低0.04%和0.07%，重量變化已達到恒重的國家標準《GB 5009.3-2006食品安全國家標準 食品中水分的測定》[22]。說明粉碎機均勻粉碎只需要1 h烘焙即可到達恒重。為保證不同品種牡丹種子均能被完全烘干，本試驗延長1 h烘焙時間，據此確定粉碎機粉碎后105℃烘焙2 h為牡丹籽烘干條件。

2.2 牡丹籽抽提時間的確定

為了確定索氏抽提器中回流抽提的時間，比較回流液中1和18 h氣相色譜分析獲得的脂肪酸峰面積(圖2)。1 h時的峰面積為86.58，18 h時峰面積為2.54，空白溶劑的峰面積為2.33，18 h回流液已經與空白溶解的峰面積相當，因此認為抽提已完成。即抽提18 h以上可以達到抽提完全的效果，試驗中選用抽提20 h。

注：PJ15和PJ16表示2個牡丹籽品種采用錘子敲破的方法手工破碎，PJ15C和PJ16C表示這2個品種采用粉碎機均勻粉碎。Note: The hammer was used to break the peony seeds of PJ15 and PJ16, and PJ15C and PJ16C were uniformly crushed by the pulverizer.圖1 牡丹種子重量隨烘焙時間變化曲線Fig.1 Variation curve of peony seed weight with baking time

圖2 抽提1和18 h回流液中脂肪酸成分氣相色譜峰面積比較Fig.2 Comparison of gas chromatographic peak areas of fatty acids in refluxes extracted for 1 and 18 h

2.3 油用牡丹種子含油量的分布

將上述破碎烘干處理后的200份樣品經化學方法測定，得到牡丹種子含油量的樣品次數分布圖(圖3)。結果表明，樣品分布次數屬于正態分布類型。含油量在10%～28%之間，大部分樣品的含油量集中在18%～24%之間，極少數分布在10%～12%和26%～28%這兩個范圍，沒有低于10%或高于28%的樣品。

采用化學方法測得的數據顯示，本試驗采集的樣品基本覆蓋了油用牡丹鳳丹種子含油量的變化范圍，具有較好的代表性。

圖3 化學方法測定單粒含油量的分布圖Fig.3 Distribution map of single oil content determined by chemical method

2.4 NIRS數學模型的建立

2.4.1 油用牡丹種子單粒含油量NIRS模型的建立及內部交叉檢驗 NIRS數學模型的建立是采用近紅外檢測儀將樣品的光譜掃描數據和化學方法測定結果進行比較，主要采用內部交叉檢驗法和外部檢驗法。內部交叉檢驗以檢驗的相關系數為參考，相關系數越接近1可靠性越高。模型的構建采用PLS和PCR兩種方法，由表1可知，采用PLS模型，標準曲線校正相關系數在0.726 8～0.980 1之間；采用PCR模型，校正相關系數在0.726 6～0.948 4之間，因此PLS模型比PCR模型更適用。光譜數據采用一階導數處理時，標準曲線校正相關系數在0.970 3～0.980 1之間；采用二階導數處理時，校正相關系數在0.756 2～0.974 8之間，揭示光譜數據采用一階導數處理比二階導數處理更好。光譜數據采用Norris平滑，標準曲線相關系數最高可到0.980 1；而采用Savitzky-Golay平滑，最高相關系數為0.978 5，可見Norris平滑比Savitzky-Golay平滑更適用。光程采用固定或隨機，相關系數無差異，因此光程參數對數據分析的影響不大。

比較不同模型和參數后，確定模型建立最佳參數為：采用最小偏二乘法(PLS)，光程固定，一階導數消除背景，數據平滑處理采用Norris derivative filter的方法，平滑參數選用5和3(平滑參數選用5和2能得到相同效果，但5和3為系統默認的平滑參數)。模型的預測精度和穩健性采用校正相關系數r1、預測相關系數r2、校正均方根誤差(RMSEC)和預測均方根誤差(RMSEP)這4個參數分別為0.980 1、0.957 6、0.463和0.705，均為參數優化后的最優值。其中校正相關系數是首要決定參數，揭示標準樣品和光譜曲線的相關性，越接近1表示相關性越好，光譜預測樣品的準確性越高。

圖4顯示了牡丹籽單粒含油量最佳近紅外預測模型，可以看出，多數樣品都沿標準曲線分布，離散點較少，校正相關系數0.980 1，預測相關系數0.957 6(圖4-A)。圖4-B顯示了每個樣品預測值和實際值的偏差，可見多數樣品的含油量預測偏差在±1%以內，少數偏差在1～2%之間。含油量預測偏差在±1%以內，在品種高通量篩選中具有很好的應用價值，為F2代高世代單粒選種提供了快捷有效的方法。由此可見，內部檢驗的預測值與化學測定值的吻合性較好，說明該模型預測結果較為準確，也說明化學測定結果的準確度較高。

表1 油用牡丹種子單粒含油量的NIRS模型參數Table 1 NIRS model parameters of oil content in single seed of oil peony

2.4.2 NIRS模型的外部檢驗 隨機抽取其中52份樣品，采用圖4的模型進行外部檢驗，NIRS預測值與化學方法測定值比較結果見表2。數據顯示，化學法測定得到的含油量最大值為23.94%，預測含油量最大值為23.74%；化學法得到的含油量平均值為20.48%，預測平均值為20.46%，兩者的擬合性均較好，預測值和測定值相關系數達0.957 6，平均誤差小于3%。由此說明，本試驗所構建的牡丹種子單粒含油量的NIRS模型可靠，可以用于分析油用牡丹種子的單粒含油量。

3 討論

與傳統的化學方法相比，近紅外測試方法表現出明顯的優勢，如簡便、迅捷、無污染，特別對測試樣品無損傷，有助于單粒選種，在一定程度上解決了雜交低世代品質育種的測樣問題，對于育種資源有限的種子后代非常重要。此外，建立準確的數學模型，對于樣品的分析和篩選至關重要。對于初次建模的樣品，需要參考化學測定結果，所以化學測定值的準確性直接影響NIRS模型的精確度和使用效果[23]。油用牡丹種子比油菜、大豆等油料種子大，且外種皮偏硬。據文獻報道，去除種皮可以提高NIRS建模效果[24-27]。但去除種皮費工費時，因此本研究對索氏抽提法進行了改進，省略單粒去皮步驟，利用粉碎機將油用牡丹種子進行充分粉碎，并烘干水分后再進行抽提，測得的單粒含油量化學值與NIRS預測值擬合度較高(0.980 1)， 說明本研究改進的索氏抽提法可行。另外，在保證樣品具有代表性、化學值準確的基礎上，選擇最佳的NIRS數學模型參數也很關鍵[27]。本研究結果表明，采用PLS模型，光譜數據采用一階導數，平滑方式選用Norris derivative filter的方法，平滑參數選用5和3，用這一套參數構建的油用牡丹單粒含油量NIRS模型效果最佳。

表2 化學法與NIRS預測值數據表Table 2 Chemical method and NIRS prediction data sheet

圖4 牡丹籽含油量近紅外預測模型Fig.4 Near infrared model of oil content of peony

本研究所選用的測試樣品涵蓋了整個江南地區的油用牡丹種質資源，取材范圍較廣，具有較好的代表性。按《GB/T 5009.3-2016食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》[20]，運用化學測定法測定樣品單粒種子的含油量，并建立相應的NIRS數學模型，再用該模型獲得的預測值與化學方法獲得的測定值進行比較，其內部交叉檢驗相關系數和外部檢驗相關系數都高于0.9，校正均方根誤差和預測均方根誤差均小于1。說明本研究建立的單粒NIRS模型精確度很高，所構建的模型具有較好的預測能力，能夠代替常規且繁瑣的化學測試法，快速、準確且無損傷地預測油用牡丹單粒種子的含油量，對高含油量的優良種質資源篩選具有重大意義。但由于模型具有較強的地域性，如果所分析的樣品超出了建模時的標樣范圍，需在模型中加入該樣品的標樣，否則其模型的準確度會難以保證[28-31]。因此，本研究構建的油用牡丹單粒種子含油量NIRS模型僅適用于江南地區，其他地區若使用該模型，需在該模型中加入其對應地區的標樣，以提高NIRS模型的精確度[32]。后續有望繼續擴大取樣范圍，增加樣品數量，以提高NIRS模型的使用范圍和檢測效果。并進一步開展油用牡丹鳳丹籽油品質方面的指標檢測，建立油酸、亞麻酸、亞油酸等脂肪酸及蛋白質成分的NIRS數學模型。

4 結論

本研究采用索氏抽提法測試了200份油用牡丹單粒種子的含油量，并應用近紅外反射光譜(NIRS)技術采集了樣本的光譜數據，通過偏最小二乘法(PLS)構建了油用牡丹種子單粒含油量的NIRS數學模型。化學法測出的籽油含量變化范圍在10%～28%之間，其分布圖基本符合正態分布。構建的數學模型經內部交叉檢驗和外部檢驗，相關系數均在0.9以上，說明本試驗所構建的NIRS模型可靠，可以用于分析油用牡丹單粒種子的含油量。