三種李果皮蠟質的結構與成分比較

黃世安 林 欣 張 琴 陳 紅 朱守亮 馬玉華 董曉慶

(1貴州大學農學院，貴州 貴陽 550025； 2貴州省果樹工程技術研究中心， 貴州 貴陽 550025；3貴州省果樹蔬菜工作站，貴州 貴陽 550025; 4貴州省農業科學院果樹科學研究所，貴州 貴陽 550025)

果皮蠟質是覆蓋在果實最外層的一類有機混合物的總稱，是果實最直接的保護層。作為保護果實的第一道屏障，果皮蠟質能夠抵御各種生物和非生物脅迫[1]，在果實發育和貯藏期間發揮重要保護作用[2-3]。此外，一些果實在發育過程中會因為蠟質的存在而形成白色蠟霜[4]。果皮蠟質由蠟質晶體構成的外蠟和鑲嵌在外部角質層的無定形內蠟組成，主要含有脂肪酸、烷烴、醇類、醛類、酮類、酯類以及三萜類化合物等[5]，蠟質晶體主要有片狀、管狀、絲狀、桿狀、顆粒狀和平板狀結構[6]。

在蘋果、柑橘、梨等果實生產中常常通過機械打蠟，起到類似于自發氣調貯藏的方式來提高果實耐貯性[7-9]，但人工果蠟使用不當會堵塞果實皮孔，阻礙氣體交換，導致果實在貯藏過程中產生異味，降低其品質[10]。而天然果皮蠟質不會造成這種情況，因此對于天然果皮蠟質的研究顯得尤為必要。在以往的研究中，三萜類化合物和β-二酮是藍莓蠟質中含量最高的成分，其中烷烴、伯醇和脂肪酸含量起到決定藍莓果實失重的作用[4]。蘋果蠟質中的烷烴成分可保持果實水分、減緩果實軟化[11-12]；烷烴和醛是生成柑橘板狀蠟質的必需物質，并且烷烴和三萜能控制果實角質層水滲透[13-14]；梨果皮蠟質中，二十九烷和十八碳醛可保持果實品質，其中烯烴和脂肪酸含量與果實硬度顯著負相關[15]。

李果實是貴州省重點支持發展的果品之一，李產業成為全省決戰脫貧攻堅、決勝小康的主力軍。李果實采后品質降低、耐貯性下降，影響果實長期貯藏[16]。雖然給李果實打蠟能提供一種新的貯藏保鮮措施，但是對李天然果蠟的特性研究鮮有報道。本研究選擇具有代表性的3種李，分析不同品種間果皮表面結構、蠟質含量和蠟質成分差異，旨在為進一步開展貯藏時期李果皮蠟質結構和成分變化研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

選擇形狀大小、可溶性固形物含量(total soluable solid, TSS)和硬度一致，無損傷的空心李、蜂糖李和脆紅李果實為研究對象。其中，空心李(TSS：8.7～10.6%，硬度：5.5～7.0 kg·cm-2)采摘自貴州省沿河土家族自治縣，蜂糖李(TSS：13.3～15.5%，硬度：10.2～11.7 kg·cm-2)采摘自貴州省六馬縣，脆紅李(TSS：9.4～10.1%，硬度：9.8～12.0 kg·cm-2)采摘自貴州省農業科學院果樹科學研究所百宜基地。配戴聚氯乙烯手套人工采摘，采摘時輕拿輕放，盡量減少對李蠟霜的損傷。采摘后將果實放于塑料籃子(540 mm× 360 mm×310 mm)，4 h內運送到實驗室進行處理，果實采摘后預冷一夜。

雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺[bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide, BSTFA]+ 1%三甲基氯硅烷(trimethylchlorsosilane, TMCS)硅烷化試劑、正構烷烴混標(均為色譜純)，購于上海安譜實驗科技股份有限公司；戊二醛50%、甲醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、叔丁醇、氯仿(均為分析純)，購于成都金山化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

E-1010離子濺射儀、S3400N型掃描電子顯微鏡，日本日立公司；7890B-5977A氣相色譜-質譜聯用儀、色譜柱DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，美國安捷倫公司；MD200-2干式氮吹儀，上海滬析實業有限公司；RE-5200A旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；SB-5200DT超聲波清洗機，寧波新芝生物科技有限公司；LNG-T98冷凍濃縮離心干燥器，太倉市華美生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 果皮蠟質結構觀測 3個品種各選擇3個果實，每個果子在赤道處(果臍正對處，兩側面)3個點取樣，觀察果皮蠟質結構。取3 mm×3 mm×2 mm的果皮，加入100 μL 2.5%戊二醛固定果皮切片，固定12 h后將果皮切片加入1 mL pH值7.0的2.0%磷酸鹽緩沖液中浸泡3 min，用梯度叔丁醇(50%、70%、90%)分別脫水后，再用100%叔丁醇脫水2次，每次10 min，脫水后真空干燥[17]。待離心管內的冰晶揮發干后取出粘臺，經E-1010離子濺射儀噴金，在S3400N型掃描電子顯微鏡上觀察蠟質結構。

1.3.2 果皮蠟質提取 蠟質提取：取3個500 mL燒杯，分別倒入300 mL三氯甲烷/甲醇(V/V∶4/1)，使用自制鐵絲夾夾住1個果實依次在3個燒杯中提取。期間不斷用自制鐵絲夾夾住果實在溶液中攪動，此過程不可破壞果皮，在通風櫥內完成。每個品種3次重復，每個重復5個果實。

提取條件：將燒杯置于40℃的超聲波清洗器中提取30 s。

濃縮轉移：果皮蠟質提取后，將5個果實3個燒杯中的蠟質提取液轉移到圓底燒瓶中，在旋轉蒸發器上進行蠟質提取液的濃縮，完成蠟質濃縮后，倒入20 mL三氯甲烷/甲醇至圓底燒瓶中，搖勻并置于超聲波清洗器震蕩，充分溶解瓶壁蠟質[2]。將濃縮液轉移至40 mL棕色玻璃螺口瓶中，在氮氣下吹干至恒定質量(30 min內蠟質變化不超過10 mg)，并稱取提取物質量。

蠟質含量測定：使用電子游標卡尺測量提取蠟質后的李果實橫徑(d1)、縱徑(d2)、高(h)，根據式(1)計算單個果實表面積(S)；再用差量法求得提取物質量，根據式(2)計算果皮提取物含量(μg·cm-2)。

(1)

(2)

1.3.3 果皮蠟質成分測定 取出吹干的蠟質樣本加入10 mL氯仿復溶，渦旋30 s，超聲10 min后取5 mL提取液，氮吹儀吹干后加入200 μL的BSTFA(含1%TMCS)衍生化試劑，在70℃烘箱內反應1 h，室溫靜置30 min。再加入1 mL氯仿復溶，渦旋2 min，超聲10 min，靜置10 min后室溫離心10 min(12 000 r·min-1， 25℃)，取300 μL上清液過0.22 μm有機相濾膜，轉移至帶襯管的玻璃瓶中，進行氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry, CC-MS)代謝組學分析。使用20 μg·mL-1濃度的正構烷烴混標(C7-C40)，轉移至帶襯管的玻璃瓶中。

色譜條件：DB-5MS毛細管柱，載氣為高純氦氣(He，純度>99.999%)，流速1.0 mL·min-1，進樣口溫度260℃；升溫程序：初溫80℃保持2 min，再以 15℃·min-1升至260℃，保持10 min，最后以5℃·min-1升至315℃，保持10 min。質譜條件：電子轟擊離子源，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，電子能量70 eV。掃描方式為全掃描模式(SCAN)，質量掃描范圍：m/z 50～500。

1.4 數據分析

使用獨立數據采集方法獲取片段離子，經Analysis Base File Converter軟件轉換為abf格式，之后導入MS-DIAL軟件進行預處理，導出原始數據矩陣，采用NIST數據庫進行物質定性分析，對所有峰面積根據篩選后RSD(ALL)<0.3的內標進行分段歸一化處理確定其相對含量。人工篩選出具體的蠟質組分后采用Excel 2016辦公軟件對數據進行整理與分析，用OriginPro 2021作圖。利用DPS軟件中的Duncan’s新復極差法中5%顯著差異進行多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 3種李果皮表面結構

注：1，2：空心李果皮蠟質結構；3：空心李果皮皮孔；4，5：蜂糖李果皮蠟質結構；6：蜂糖李果皮皮孔；7，8：脆紅李果皮蠟質結構；9：脆紅李果皮皮孔；SE為放大倍數。Note: 1, 2: Peel surface structure of Kongxin plum. 3: Lenticel of Kongxin plum fruit. 4, 5: Peel surface structure of Fengtang plum fruit. 6: Lenticel of Fengtang plum. 7, 8: Peel surface structure of Cuihong plum fruit. 9: Lenticel of Cuihong plum fruit. SE is the magnification.圖1 3種李果皮照片和果皮表面結構掃描電鏡圖Fig.1 Photographs of fruit and scanning electron microscope of peel surface structure in three varieties plum

如圖1所示，3種李果皮上均覆蓋有白霜狀蠟質，空心李、蜂糖李和脆紅李果皮表面的蠟質覆蓋面積分別為70%～90%、50%～70%和20%～40%。觀察果皮蠟質掃描電鏡圖，空心李果皮有大量堆疊的片狀蠟質，也有桿狀蠟質結構，在桿狀的節點上會聚集絮狀或顆粒狀結構。蜂糖李果皮上明顯分布著顆粒狀蠟質晶體，含有大量大小不一、不規則小圓片狀蠟質晶體以及少部分桿狀蠟質。脆紅李果皮既有呈不規則小圓片狀蠟質晶體，也有大量堆疊的桿狀蠟質結構形成的網絡。在300倍的掃描電鏡下，空心李和脆紅李的皮孔為圓形，大小在20～40 μm之間，皮孔周圍覆蓋嚼爛狀蠟質，部分皮孔上覆蓋有蠟質。在200倍的掃描電鏡下，蜂糖李皮孔為橢圓形，大小在300～600 μm之間，皮孔較空心李和脆紅李大，且兩側副衛細胞有角質加厚。

2.2 3種李果皮提取物含量差異

如圖2所示，3個品種李中空心李果皮蠟質含量最高，為3 439.83 μg·cm-2；其次是蜂糖李，為2 012.69 μg·cm-2；脆紅李最低，為895.22 μg·cm-2，3種李之間蠟質含量存在顯著差異(P<0.05)。

注：不同字母表示不同品種蠟質含量在0.05水平上有顯著差異。Note: Different letters indicate that wax content of different varieties of plum has significant difference at 0.05 level.圖2 3種李果皮蠟質含量Fig.2 Content in peel wax of three varieties plum

2.3 3種李果皮蠟質成分

2.3.1 3種李果皮蠟質組分差異 GC-MS分析結果表明，李果皮的三氯甲烷/甲醇(V/V∶4/1)提取物中共分析出87種蠟質成分，3種李果皮蠟質成分基本一致，主要包括脂肪酸、烷烴、醇類、醛類、酯類、酮類、三萜類化合物等，但不同成分含量比例不同。對3種李果皮蠟質組成進行主成分分析，如圖3-A所示。在主成分分析的評分圖中，第1和第2主成分的特征值分別為3.66和2.38，貢獻率分別為52.25%和34.04%，累積貢獻率為86.29%。脆紅李在第1主成分上得分最高，蜂糖李在第1主成分上得分最低；空心李在第2主成分上得分最高，與蜂糖李和脆紅李相比在第2主成分上差別較大。3種李果皮蠟質組分和相對含量差別較大，組分區分明顯。3種李中，蜂糖李中脂肪酸含量相對較高，脆紅李中酮類含量相對較高。

由圖3-B可知，3種李蠟質組分含量最高的是醇類，占蠟質總量比例分別為60.08%、65.38%和50.38%。其次是烷烴，在空心李、蜂糖李和脆紅李中分別占19.08%、23.23%和19.60%。空心李和脆紅李果皮蠟質中三萜類化合物含量高于蜂糖李，分別占14.40%和18.73%。3個品種中脂肪酸含量以蜂糖李最高，占5.85%，脆紅李次之，空心李最低。脆紅李和空心李中酯類含量高于蜂糖李，分別占4.67%和2.57%。醛類含量相差不大，脆紅李中含量最高，占2.97%。李表皮蠟質代謝物中酮類含量極低，占蠟質總量少于1%。空心李果皮蠟質中各組分所占比例從高到低依次為醇類>烷烴>三萜類化合物>酯類>脂肪酸>醛類>酮類。蜂糖李果皮蠟質中各組分所占比例從高到低依次為醇類>烷烴>脂肪酸>酯類>醛類>三萜類化合物>酮類。脆紅李果皮蠟質中各組分所占比例從高到低依次為醇類>烷烴>三萜類化合物>酯類>醛類>脂肪酸>酮類。

圖3 3種李果皮蠟質組分主成分分析(A)和百分比(B)Fig.3 The principal component analysis (A) and percentage (B) of peel wax compositions of three varieties plum

2.3.2 3種李果皮蠟質成分及含量顯著性 由表1知，使用平均保留時間確定代謝物名稱，分析出87種蠟質成分，包含20種醇類、12種烷烴、23種脂肪酸、15種酯類、6種醛類、8種酮類以及3種三萜類化合物。3種李果皮中分析出的16種醇類、6種烷烴、19種脂肪酸、12種酯類、5種醛類、6種酮類以及3種三萜類化合物的含量存在顯著差異(P<0.05)。

表1 3種李果皮蠟質成分和含量顯著性Table 1 Significance of peel wax compositions and content of three varieties plum

表1(續)

表1(續)

圖4 3種李果皮蠟質組分聚類熱圖分析Fig.4 Clustering heatmap analysis in peel wax compositions of three varieties plum

2.3.3 3種李果皮表皮蠟質的組成 如圖4所示，對3個品種中的87種蠟質成分以及醇類、伯醇、仲醇、不飽和醇、二元醇、烷烴、直鏈烷烴、支鏈烷烴、脂肪酸、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、酯類、酮類、醛類、飽和醛、不飽和醛和三萜類化合物含量進行熱圖結合層次聚類分析。結果顯示3種李蠟質成分區分明顯，與主成分分析結果一致。空心李與脆紅李的成分聚類在一起，但空心李距離蜂糖李較遠，說明空心李與脆紅李的蠟質成分相近，與蜂糖李差異性較大。3種李中空心李的醇類含量最高，尤其是伯醇中十八醇、二十六醇與二元醇的1,11-十一烷二醇、1,30-三十烷二醇；仲醇在李果皮蠟質中含量極低，但在蜂糖李中含量高于脆紅李以及空心李。直鏈烷烴與支鏈烷烴在脆紅李中含量最低，支鏈烷烴在空心李中含量最高。李蠟質中，二十九烷是含量最高的烷烴成分，在蜂糖李中含量最高。飽和脂肪酸與飽和醛在蜂糖李中含量最高，不飽和脂肪酸與不飽和醛在脆紅李中含量最高。酮類在脆紅李中含量最高，酯類在蜂糖李中含量最低。蠟質中三萜類物質，尤其是熊果醛、熊果酸在蜂糖李中的含量最低，在空心李中的含量最高。

如圖5所示，對3種李果皮蠟質的二無醇和三萜類含量進行分析。其中二元醇包含1,11-十一烷二醇、1,12-十二烷二醇、1,30-三十烷二醇3種。3種李中，二元醇在空心李中含量最高，脆紅李中最低。1,30-三十烷二醇是3種李中含量最高的二元醇，在空心李中含量最高，且顯著高于其他2種李(P<0.05)。3種李中，空心李的三萜類含量最高，脆紅李次之，蜂糖李最低。空心李中含量最高的三萜類是熊果醛，而且空心李的熊果醛和熊果酸含量顯著高于其他2種李(P<0.05)。蜂糖李的熊去氧膽酸含量顯著高于空心李(P<0.05)，而熊果醛、熊果酸含量極低。脆紅李中含量最高的成分也是熊果醛，且含有較多的熊果酸，但幾乎不含熊去氧膽酸。

注：不同字母表示同一成分不同品種間含量在0.05水平上有顯著差異。Note: Different letters indicate that there are significant differences in the content of the same composition among different varieties at 0.05 level.圖5 3種李果皮蠟質二元醇與三萜類的分布以及含量Fig.5 Distribution and content of glycols and triterpenes in fruits of three varieties of plum

3 討論

不同物種以及同一物種的不同品種間蠟質含量也不同[2,12,14]。徐呈祥等[14]研究表明，采用三氯甲烷/甲醇(V/V∶3/1) 溶液提取砂糖橘與貢柑果皮蠟質，貢柑果皮蠟質含量高于砂糖橘。本試驗用三氯甲烷/甲醇(V/V∶4/1)溶液提取3種李果皮蠟質，結果顯示，蠟質含量存在顯著差異(P<0.05)，其中空心李蠟質含量最高，蜂糖李次之，脆紅李最低。不同方法提取果皮蠟質，蠟質含量也不相同。酶解法提取柑橘果皮蠟質的含量低于三氯甲烷/甲醇(V/V∶ 3/1)溶液提取法1～2個數量級[18]，使用火棉膠提取番茄果皮蠟質，其含量比三氯甲烷溶液提取的含量低[19]。使用不同有機溶劑提取果皮蠟質會影響蠟質含量與成分，一般使用正己烷提取非極性餾分，二氯甲烷提取弱極性餾分，甲醇提取極性餾分[20]。對于不同有機溶劑對李果皮蠟質的影響，貴州省果樹工程技術研究中心董曉慶團隊也對正己烷、三氯甲烷、三氯甲烷/甲醇(V/V∶ 4/1)三種提取劑進行了比較，結果顯示三氯甲烷/甲醇(V/V∶ 4/1)蠟質含量最高(數據未發表)。

果皮中常見的蠟質結構有片狀、管狀、桿狀、針狀、顆粒狀等類型，蠟質中主要包含脂肪族化合物、環狀化合物以及甾醇類化合物等[21]。對大量植物表皮蠟質結構和成分的研究發現，蠟質結構和成分顯著相關。表皮蠟質呈現的蠟質結構與蠟質成分含量相關，片狀結構的蠟質含有大量醇和三萜類化合物；柱、管狀結構的蠟質含有大量的酮和次級醇；桿、棒狀結構的蠟質含有大量二酮，且含二酮的植物表皮會產生白霜狀蠟質[22]；波浪狀結構的蠟質含有大量烷烴[23]。

本研究中李果皮片狀蠟質結構分布密度與李果皮蠟質中醇和烷烴含量密切相關。3種李果皮蠟質呈現不同的蠟質結構，與蠟質成分含量相關，此外，成分含量的差異可能會使不同的蠟質結構組合在一起。空心李和脆紅李蠟質結構相似，即有大量堆疊的桿狀蠟質結構，且在桿狀的節點上會聚集絮狀或者顆粒狀晶體。3種李果皮上附著一層白霜狀蠟質，空心李白霜狀蠟質覆蓋面積高于蜂糖李和脆紅李，且空心李果皮蠟質呈現較多的桿狀結構。對禾本科植物蠟質的研究發現禾本科表皮結構存在桿狀結構，并在蠟質中檢測出二酮物質[22,24]，但在本研究中雖有大量的桿狀結構，并未檢測出二酮物質。蠟質合成途徑中仲醇是酮的前體，仲醇含量會影響酮與二酮的含量，3種李果皮蠟質中仲醇含量極低，極低的仲醇含量導致李果皮蠟質中酮及二酮的含量極低，與Priyanka等[25]研究藍莓果皮蠟質的結果一致。此外，郝浩浩[26]在研究成熟柑橘果皮蠟質中同樣沒有檢測出二酮物質，臍橙和椪柑果皮蠟質呈現不同形態的桿狀結構，蠟質中含量最高的成分是醛類。

在一些研究中醇類也能形成桿狀結構，并存在兩種組分，一種組分是仲醇、10-二十九烷及其同系物和少量不對稱二元醇[27]；另有一種組分是14,16-三十一烷二醇的對稱二元醇[28]。空心李和蜂糖李含有較高的二元醇，尤其是空心李中的1,30-三十烷二醇的含量顯著高于蜂糖李和脆紅李。研究表明，呈桿狀結構的蠟質組分中大多含有三萜類化合物[29]。本研究中空心李的桿狀晶體結構比蜂糖李和脆紅李密集，而且空心李蠟質中三萜類含量顯著高于蜂糖李和脆紅李，這可能是空心李果皮表皮白霜狀蠟質極為豐富的原因。因此李果皮蠟質中對稱二元醇和三萜類化合物對桿狀蠟質結構以及白霜狀蠟質的形成起重要作用。

Oliveira等[30]研究發現干旱的旱地林地區植被蠟質中主要含有極性低的物質，而濕潤的熱帶草原地區主要含有極性高的物質，低極性物質能更有效的防止水分散失。Chai等[12]在研究10種蘋果果皮蠟質發現，烷烴的相對含量與李果實貯藏性有直接關系。本研究中蜂糖李果皮蠟質中低極性物質烷烴含量比例高于空心李和脆紅李，推測蜂糖李果實在生產中更耐貯藏。3種李果皮蠟質中飽和脂肪酸和飽和脂肪醛含量最高的是蜂糖李，最低的是脆紅李；不飽和脂肪酸和不飽和脂肪醛含量最高的是脆紅李，最低的是蜂糖李。對3種李蠟質成分與硬度和TSS的相關性分析中，醇類、烷烴以及三萜類與硬度呈負相關(R2分別為-0.841、-0.757和-0.634)，三萜類與TSS呈極顯著負相關(R2=-0.991，P<0.01)，進一步說明三萜類與李果實品質有重要關系，但果皮蠟質中具體成分和李果實貯藏之間的關系還需進一步深入研究。

此外，3種李果皮蠟質中還存在黃酮類和蒽醌類，任玉琴等[31]研究發現李果實中黃酮類物質具有重要的抗氧化作用，Rajan等[32]研究發現蒽醌類物質具有抗炎殺菌的作用，但目前還未有研究報道這些物質對蠟質結構的形成是否起到作用以及如何作用，因此需要進一步深入研究和探討。

4 結論

本研究通過分析3種李果皮結構以及果皮蠟質成分，發現蠟質成分及其含量的差異會使李果皮蠟質結構存在不同類型的組合。3種李中分析出7類87種蠟質成分，主成分分析結果顯示3種李蠟質組分區別明顯，聚類熱圖顯示空心李與脆紅李的蠟質成分相近，與蜂糖李差異較大。本研究發現蠟質中對稱二元醇和三萜類化合物對李果皮蠟質桿狀結構以及白霜狀蠟質的形成起重要作用，并且三萜類化合物與李果實品質存在重要關系。